2型糖尿病患者及其亲属骨骼肌活检中的基因表达：胰岛素信号通路的差异调节

RNA分离、cRNA生产和片段化、阵列杂交和扫描

均化后，使用制造商指定的来自Invitrogen的Trizol试剂从骨骼肌活检中分离总RNA。RNA随后使用来自Qiagen的RNeasy Mikro试剂盒进行了清理。制作了片段化生物素化cRNA，并将其与Affymetrix人类基因组U133 Plus 2.0阵列杂交，按照Affymetix的指导原则进行扫描(网址：www.affmetrix.com). 这些阵列包含约54000个探针，代表约47000个转录本。

数据分析

细胞强度文件（CEL文件）由Affymetrix在GCOS程序中生成。随后使用Bioconductor生成质量控制报告，并使用RMA（Robust Multichip Average）方法对数据进行建模[18],[19]在dChip中对各组之间的单个基因进行了比较(http://biosun1.harvard.edu/compab/dchip/). 折叠变化（FC）设置为>1.2，p值<0.05（未配对t检验），FC的90%置信区间较低，实验强度值与对照强度值之间的差值设置为大于30。错误发现率（FDR）是使用排列方法确定的，并且应该小于5%。

使用程序GenMAPP/MAPPFinder进行功能分析[20](http://www.genmapp.org（英文）/). 此处的标准设置为：FC>1.2，p值<0.05，强度值>30。功能分析也使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）程序进行，使用FC>1.2，p值<0.05标准。微阵列数据根据MIAME指南进行描述。

定量RT-PCR

对选定的基因进行定量RT-PCR，以验证在微阵列研究中获得的结果。使用Applied Biosystems的“高容量cDNA逆转录试剂盒”从0.5µg每个RNA样本中生成cDNA。实验的最后一步是使用应用生物系统公司提供的TaqMan低密度阵列（定制）和“TaqMan-Universal PCR Master Mix”进行的，两者均遵循公司指南。阵列在7900HT系统上运行，数据使用Applied Biosystems的SDS 2.1软件进行分析。每个样品的Ct值在不同的阵列上至少测定两次，平均值用于计算相对折叠变化（FC=2^-ΔΔCt). PPIA（亲环素A）基因被用作内源性对照。用这种方法计算FC时，只获得一个值，包括所有重复值，因此报告了Ct值的标准偏差，而不是折叠变化。

2型糖尿病患者或一级亲属骨骼肌中差异表达的基因

使用dChip程序比较各组间单个基因的表达水平。所有被发现受调控的基因及其折叠变化都列在网上表S1。结果或讨论部分中提到的基因列于表2和表3.

使用方法第节，发现“D”组与对照组相比有149个基因表达差异。这些基因中的大多数被下调(图1). 生成的基因列表包括几个值得注意的基因，如胰岛素受体(INSR公司)，胰岛素受体底物2(IRS2系统)，蛋白磷酸酶1(PPP1CB（PPP1CB）)，脂蛋白脂肪酶(低密度脂蛋白)，己糖激酶2(香港2号)，磷酸化酶激酶(PHKA1公司)，叉头箱O3A(FOXO3A公司)，组蛋白脱乙酰酶7A(HDAC7A型)和NADH脱氢酶(NDUFS1型) (表2).

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图1

差异表达基因的数量。

在生成的微阵列数据的dChip分析中，显示了与健康对照组相比，2型糖尿病患者和一级亲属骨骼肌活检中发现差异表达的基因数量的图表。分析中使用的标准按照方法第节。显示了每组中上调和下调基因的数量。两组中只有2个基因的表达发生改变，即TncRNA和低密度血红蛋白LDHB是厌氧糖酵解的关键酶，与对照组相比，“R”组和“D”组的表达均降低。

使用相同的截止值，发现与对照组相比，“R”组中有11个基因的差异表达，但此比较的FDR>5%(图1). 这11个基因如下：胶原蛋白1α1(COL1A1公司)，胶原蛋白3α1(COL3A1系列)，生长分化因子8(GDF8型)，驱动蛋白家族成员1B(基辅1B)，乳酸脱氢酶B(低密度血红蛋白)、PDZ和LIM域5(PDLIM5项目)，滋养层细胞衍生的非编码RNA(TncRNA)，高尔基自身抗原，高尔基亚家族A 8A(高尔夫8A)，AT富交互域5B(ARID5B型)，LON肽酶N末端结构域和无名指2(伦敦RF2)和EST(表3). 由于这种比较的FDR较高，qRTPCR验证了这些基因中大多数的变化(表3和在线图S1).

两个基因，低密度血红蛋白和TncRNA发现，在“D”组和“R”组中均有差异表达。TncRNA的功能目前尚不清楚，而LDHB是厌氧糖酵解的关键酶。低密度血红蛋白与对照组相比，“R”组和“D”组均被发现下调。

一般来说，大多数褶皱变化不大（在1.2到1.4之间），但也有一些例外，如香港2号与对照组相比，D组下调了2.75倍。

定量RT-PCR结果

通过qRT-PCR（在线图S1A). 两种方法都发现所有基因都被调节在同一方向，但其中两个基因(IRS2公司和右侧电子束（脑中富含Ras同源物））未达到FC>1.2标准。

通过qRT-PCR（在线图S1B). 两种方法都发现所有基因都在同一方向调节，但有两个基因(COL1A1公司和COL3A1系列)不符合FC>1.2标准（分别为−1.18和−1.19）。

此外，在用qRT-PCR进行研究的dChip衍生基因表中未发现特别感兴趣的基因，并将结果与微阵列结果进行了比较（在线图S1C). 使用qRT-PCR方法发现PGC1α（PPARγ辅活化子1α）在“D”组中轻微下调（FC=−1.20），并且前列腺素C1β“R”组（PPARγ辅活化因子1β）下调（FC=−1.35）。然而，这些差异在统计上并不显著。

所有Ct平均值、标准偏差和折叠变化都可以在网上看到表S2.

使用GenMAPP/MAPPFinder和Ingenuity Pathway analysis进行功能分析

使用GenMAPP/MAPPFinder进行功能分析，比较各组之间的数据。将dChip中计算的折叠变化和p值导入程序，截止值如下：FC>1.2，p值<0.05，平均表达值>30。应用于这些标准的基因数量比dChip分析中的更多，因为dChip中存在额外的截止值。

每个比较的前三个功能/路径如所示表4令人惊讶的是，一级亲属中最显著上调的途径是胰岛素信号传导，而在2型糖尿病患者中，胰岛素信号传导是唯一下调最多的途径。即使调整MAPPFinder（调整后的p值）中的多次测试，这些结果也非常显著。经多次测试调整后，唯一的另一条重要途径是MAPK信号传导，在D组下调。一般来说，大多数途径/功能在亲属中上调，在2型糖尿病患者中下调。“R”组中上调的几个通路在“D”组中下调也是一个普遍趋势。例如，除了胰岛素信号外，参与糖原代谢、肌肉发育和凋亡的基因也是如此。参与蛋白质合成的基因在两组中总体上调。线粒体功能和电子传递相关的基因通常被下调，但与对照组相比，这些功能没有明显改变。另一种观点是，与对照组相比，“D”组的几种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶在骨骼肌中的表达降低(PPM1A（PPM1A）,PPM1B型,PPP1R9B型,PPP2CB（PPP2CB）、和PPP2R5B型).

还使用灵巧路径分析（IPA）程序进行功能分析，观察信号通路的一般调节，不区分特定基因的上调和下调。在GenMAPP/MAPPFinder分析中使用了相同的截止值。总体而言，IPA分析证实了从GenMAPP/MAPPFinder分析中获得的结果；即胰岛素信号是两组中改变的主要信号通路（数据未显示）。

GenMAPP/MAPPFinder分析中发现的胰岛素信号相关基因表达的变化可以在图2和图3一些受影响的基因重叠，但大多数在“D”组和“R”组之间不同。该分析中的几个基因没有达到dChip分析中设定的所有标准。通过额外的qRT-PCR结果证实了为基因子集观察到的FC(表2和表3)

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图2

2型糖尿病患者胰岛素信号的调节。

使用GenMAPP/MAPPFinder程序发现胰岛素信号通路在基因表达水平上显著下调。分析标准按照方法第节。在路径的每个部分下面，发现表达增加的基因用红色表示，发现表达减少的基因用绿色表示。图改编自GenMAPP。

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图3

2型糖尿病患者一级亲属的胰岛素信号调节。

使用GenMAPP/MAPPFinder程序发现胰岛素信号通路在基因表达水平上显著上调。分析标准按照方法第节。在路径的每个部分下面，发现表达增加的基因用红色表示，发现表达减少的基因用绿色表示。图改编自GenMAPP。

胰岛素信号分子的表达在一级亲属中上调，在2型糖尿病患者中下调

本研究中最引人注目的发现是，2型糖尿病一级亲属骨骼肌中胰岛素信号传导相关基因的表达显著增加，而2型糖尿病骨骼肌样本中相同通路的表达显著下调(表4,图2、和图3). 我们假设，在亲属中观察到的基因表达水平上调胰岛素信号通路可能是对胰岛素信号活性降低的有效补偿。由于一级亲属患有高胰岛素血症，他们很可能在严格的分子意义上存在胰岛素抵抗，尽管在生理上并不存在。胰岛素信号分子表达的增加可能与胰岛素水平的增加协同作用，保护这些个体免受胰岛素抵抗和代谢失调的影响。这种代偿后来在2型糖尿病肌肉中消失，胰岛素信号通路处于下调状态。显性2型糖尿病患者这种代偿机制缺失的可能解释包括：血糖水平升高导致的葡萄糖毒性、FFA水平升高引起的脂肪毒性和/或β细胞功能衰竭。然而，在未来的研究中专门讨论之前，这仍然是推测性的。

“R”和“D”组中受影响的大多数基因没有重叠。例如SLC2A4系列(GLUT4公司（葡萄糖转运蛋白4）），在“D”组下调，在“R”组不变。这一观察可以用以下事实来解释SLC2A4系列在高胰岛素血症钳夹期间，健康肌肉中的表达增加，但在2型糖尿病肌肉中没有[22]在这项研究中发现，2型糖尿病肌肉中胰岛素信号上调的少数基因之一是VAMP2型(图2). 该基因编码一种驻留在GLUT4囊泡表面的蛋白质，在囊泡与质膜靶点之间的相互作用中起着重要作用[23]增加促进GLUT4有效运输和融合到膜的蛋白质表达（如VAMP2）可能是一种补偿GLUT4蛋白质减少量的方法。

先前有报道称，在2型糖尿病患者肌肉中观察到的胰岛素信号缺陷对该途径的代谢调节部分具有特异性，从而使该途径的MAP激酶部分保持完整[24]然而，我们发现一些MAP激酶在基因表达水平下调(图2). MAP激酶表达量的减少可能导致IRS蛋白的丝氨酸/苏氨酸磷酸化降低，最终增加胰岛素信号活性，作为针对胰岛素抵抗的补偿机制的一部分。

我们还发现，与对照组相比，一些丝氨酸/苏氨酸磷酸酶在糖尿病肌肉中的表达降低(第1a页,PPM1B型,PPP1R9B型,PPP2CB（PPP2CB）、和PPP2R5B型) (表2). 可能，磷酸酶表达的减少将转化为丝氨酸/苏氨酸磷酸化水平的增加，从而进一步加剧这些患者的胰岛素抵抗程度。

OXPHOS基因与PGC1α/PGC1β

氧化磷酸化（OXPHOS），先前已被证明在糖尿病前期亲属和2型糖尿病患者中下调[13],[14]在本研究中，未发现两组之间存在显著差异。有几个因素可以部分解释结果中的这种差异。在Patti等人的研究中，所有受试者都是美籍墨西哥人，在基础水平和混合性别组进行了活检。此外，Affymetrix的HuGeneFL阵列代表7129个序列，用于该特定研究[14]相比之下，当前研究中使用的阵列有超过50000个探针，代表大约47000个转录本。单就这一事实而言，在通路和功能分析方面可能会导致不同的结果。在Mootha等人的研究中，使用高胰岛素-血糖钳夹采集样本，所有受试者均为白种人，且组中只有男性，如本研究所示。然而，使用的阵列（来自Affymetrix的HG-U133A阵列）仅覆盖了当前研究中使用的阵列上发现的大约一半的转录本[13].

尽管OXPHOS基因作为一组在一级亲属或2型糖尿病患者中的表达水平没有显著变化，但涉及线粒体功能和能量衍生的几个单独基因的表达水平有所下降。NADH脱氢酶1(NDUFS1型)，NADP转氢酶(NNT公司)，5-甲基四氢叶酸-高半胱氨酸甲基转移酶还原酶(MTRR公司)，聚合酶γ(POLG公司)，NADH脱氢酶2(NDUFS2型)在“D”组中被发现下调(表2).

在这项研究中，我们没有发现任何明显的下调PGC1α或前列腺素C1β在“R”组或“D”组的肌肉活检中(表2和表3). 此前有报道称，这些基因在糖尿病前期亲属和2型糖尿病患者中的表达显著下降，与目前的结果相矛盾[13],[14]然而，Karlsson等人最近的一项研究发现，血糖正常的一级亲属中PGC1α和PGC1β的mRNA表达与健康对照组相同，这支持了当前研究的结果[17]为了澄清这一问题，我们测定了所有三个实验组中PGC1α的蛋白表达，发现PGC1α确实在一些一级亲属和糖尿病患者中下调，但在其他患者中没有下调。由于人际关系的高度变异，测得的下调并不显著(图4).

2型糖尿病一级亲属表达水平改变的基因

如前所述，在2型糖尿病患者的健康一级亲属中发现的基因表达变化是寻找该疾病潜在原因的良好候选。

与对照组相比，在一级亲属肌肉样本中发现差异表达的11个基因中，有8个基因的表达水平增加。这些基因包括基辅1B和GDF8型有趣的是基辅1B在使用微阵列和qRT-PCR方法的“D”组中被下调。这两个基因可能在2型糖尿病发病机制中发挥关键作用。

KIF1B已被证明高度参与线粒体和基辅1B杂合小鼠的突触囊泡前体运输受损，并患有高度肌无力[25],[26]2型糖尿病与骨骼肌线粒体水平下降有关[27].通过上调线粒体转运基辅1B可能是一种补偿假定线粒体水平下降的方法。有趣的是，最近发现的与2型糖尿病相关的基因区域之一包含基辅11–另一个驱动蛋白家族成员[8].

GDF8也称为肌抑制素，是骨骼肌生长的抑制剂，也是TGF-β家族的成员。肌肉生长抑制素被认为是治疗包括糖尿病在内的肌肉萎缩疾病的理想候选药物。事实上，在人类和动物模型中，由于慢性肌肉消耗疾病，如恶病质和衰老，骨骼肌中已报告该基因表达增加[28]–[30].查找GDF8型本研究中，在健康的一级亲属中，肌肉生长抑制素（myostatin）被上调，这表明该因子可能在许多糖尿病患者的肌肉萎缩中起到启动作用，并可能在糖尿病前期发生胰岛素抵抗。

在一级亲属和2型糖尿病患者中发现的唯一一个已知功能的基因改变了表达水平低密度血红蛋白LDHB在厌氧糖酵解过程中催化丙酮酸转化为乳酸，因此对正常能量稳态至关重要。据报道，2型糖尿病父母的胰岛素抵抗但非糖尿病后代以及2型糖尿病患者的线粒体ATP合成下降[31]–[32]这项研究的结果表明，这些个体不仅线粒体ATP生成受损，还通过厌氧途径产生ATP。由于线粒体氧化磷酸化和LDHB以某种方式竞争相同的丙酮酸库，因此LDHB水平的降低可能是对线粒体功能受损的一种补偿机制，因为乙酰辅酶a转化可获得更多丙酮酸。

特别感谢Susanne Smed和Elisabeth Schiefloe（丹麦哥本哈根大学Rigshospitalet临床生物化学系）在微阵列扫描方面提供的技术援助。还感谢Soetkin Versteyhe和Lisbeth Gauguin激发了科学讨论，感谢Kirstine Stender-Petersen和Lise Wegner对qRT-PCR研究的建议。感谢Emma Nilsson和Marianne Modest帮助RNA分离。