蛋白激酶Cα磷酸化α6-管蛋白激活人乳腺细胞运动^*

摘要

介绍

多年来，人们一直关注蛋白激酶Cα（PKCα）^三作为调控癌细胞粘附和迁移的信号通路的上游元件。鉴于PKC亚型在导致转移表型的细胞骨架事件中的作用(1)其蛋白底物的鉴定将为抗转移药物的设计提供有吸引力的靶点。尽管有大量PKC底物进行磷酸化在体外，目前有一个简短的蛋白质列表，这些蛋白质被证明是细胞内PKC底物。已经发现这些底物与肌动蛋白细胞骨架和细胞-细胞接触有关(2,三). PKCα磷酸化后，这些蛋白质影响促进粘附和运动的细胞骨架动力学(1).

MCF-10A细胞系为探索人类乳腺细胞中PKCα特异性通路提供了一个有价值的模型。这种非转化、非肿瘤原性细胞系表达极低水平的PKCα，因此为寻求PKCα过度表达与其表型结果相关的实验提供了低背景。在这些细胞中表达的对二酰甘油（DAG）敏感的亚型中，PKCα是唯一的钙²⁺/依赖DAG的（传统）亚型。该实验室以前曾报道过PKCα的稳定过表达使这些非运动细胞具有高水平的运动能力、增殖减少、E-cadherin表达缺失和细胞形态改变(4).

MCF-10A细胞的一个显著优点是，在PKCα的工程过表达后，为了观察PKCα相关的表型，它们不需要PKC活化剂（如DAG或肿瘤启动子十四烷基-12,13-羟基乙酸酯）的治疗(4). 这种情况与MCF-10A细胞环境有关，因为之前与NIH 3T3细胞使用相同的PKCα编码质粒并没有产生组成活性蛋白(5). 这种激活的可能来源是培养基中存在表皮生长因子（EGF），这是MCF-10A细胞生长的必要条件。表达后，重组PKCα被EGF诱导的细胞内DAG和Ca水平激活²⁺导致运动行为。在仅有弱运动性的亲代MCF-10A细胞中，内源性PKC活性明显对细胞外EGF无反应。然而，用细胞渗透性和PKCα选择性DAG-内酯处理MCF-10A细胞可产生显著的运动性(6,7). 这些观察结果表明，非运动MCF-10A细胞表达内源性PKC抑制剂，该抑制剂可阻止（EGF-生成的）DAG激活其活性，但可以被微摩尔浓度的DAG-内酯取代，也可以通过高剂量表达重组PKCα进行滴定。另一种可能性较小的情况是，PKCα的工程过表达导致组成活性50-kDa催化片段的形成。然而，我们之前的研究反对这种可能性(4). 首先，在表达重组PKCα的MCF-10A细胞中，观察到80-kDa蛋白移位到膜部分，从而表明完整酶的内源性激活。其次，观察到钙蛋白C（一种PKC抑制剂，在调节域中结合DAG结合位点，因此需要完整的酶来抑制催化活性）可以阻止PKCα诱导的MCF-10A细胞运动。

MCF-10A细胞的癌相关表型来源于异常EGF介导的信号转导，这一观点得到了进一步的支持，证据表明该细胞系的许多PKC驱动的表型（包括运动性）可以通过ErbB-2的过度表达进行重述(8,9). 这种EGF受体相关癌基因在乳腺肿瘤中经常过度表达，并被认为通过PKCα发挥作用，导致乳腺癌侵袭(10). 由于MCF-10A细胞系表现出内源性PKCα活性的低背景，因此它提供了一个富含底物的环境，用于筛选和鉴定介导PKCα诱导表型的蛋白质底物。随后，任何候选底物都可以在人类乳腺癌细胞或其他癌细胞中验证为PKC靶点。

直到最近，PKCα底物的鉴定还不可能，因为磷酸蛋白直接与产生它的特定蛋白激酶相连接存在固有的困难。最初由Shokat实验室开发(11–14)，可追踪激酶方法提供了一种化学遗传学方法来识别任何蛋白激酶的直接底物(15–17). 这种方法需要在腺苷附近的ATP结合域进行定点突变N个⁶-结合ATP的氨基。该位点的突变取代了含有长脂肪族侧链的氨基酸残基(例如蛋氨酸）含有较短侧链的残基，如丙氨酸，从而消除了N个⁶-氨基。这种突变体能有效结合ATP的大量类似物，该类似物在N个⁶-氨基(例如N⁶-苯基-ATP）。将ATP类似物添加到含有突变蛋白激酶的细胞裂解液中时产生的磷蛋白是突变活性的结果。在含有结合ATP的cAMP依赖性蛋白激酶的x射线晶体结构的指导下，该实验室最近开发了一种可追踪的PKCα突变体(18). 该突变体（M417A-PKCα）可有效识别已知的PKC底物蛋白，并促进MCF-10A细胞的运动表型，该细胞以前被认为是野生型PKCα(4).

在目前的工作中，可追踪激酶方法的潜力得到了充分发挥。被鉴定为M417A-PKCα底物的磷蛋白使我们发现α6-微管蛋白是MCF-10A细胞中一种新的PKCα底物。由于α-和β-微管蛋白的异二聚体是微管的构建块，微管的组装动力学在细胞运动过程中至关重要，我们假设PKCα对其磷酸化产生运动行为。通过使用功能获得和功能丧失突变体，我们的结果表明α6-微管蛋白中有一个单一位点，PKCα对其磷酸化可复制先前归属于PKCα的MCF-10A细胞的运动表型。

材料和方法

细胞培养血清、生长因子、培养基、DNA测序引物、Alexa荧光抗体和pcDNA3.1载体购自Invitrogen。QuikChange突变试剂盒和pCMV4载体购自Stratagene（加州La Jolla）。从ATCC（弗吉尼亚州马纳萨斯）获得编码α6-微管蛋白的质粒。所有限制性内切酶均来自新英格兰生物实验室（马萨诸塞州伊普斯威奇）。磷酸蛋白磷酸酶抑制剂混合物、蛋白酶抑制剂、皂苷、诺卡唑和α-微管蛋白单克隆抗体（DM1A）购自Sigma。二-吲哚甲酰亚胺-1（BIM）购自EMD-Calbiochem。兔多克隆α-微管蛋白抗体（E-19）、蛋白A/G-琼脂糖珠、辣根过氧化物酶结合二级抗体、小鼠IgG-琼脂和放射免疫沉淀缓冲液均来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（加州圣克鲁斯）。Fugene 6来自罗氏应用科学公司；凝胶蓝和化学发光试剂（Supersignal West Pico）购自皮尔斯；Duracryl来自NextGen Sciences（密歇根州安阿伯）；Immobilon-P转移膜和鼠抗Myc单克隆抗体购自Millipore Corp.（马萨诸塞州贝德福德）。重组人GST（Mu）-α6-微管蛋白购自Abnova Corp.（台湾），GST-PKCα和识别磷酸化PKC底物的抗体购自Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利），GST-Mu蛋白标准购自Alpha Diagnostic International，Inc.（德克萨斯州圣安东尼奥）。放射性化学物质来自PerkinElmer生命科学公司。

α6-微管蛋白的突变

将编码人α6-微管蛋白的cDNA亚克隆到pCMV4载体的BamHI和XhoI限制位点。该载体的表达产生了一种蛋白质，该蛋白质在COOH末端被FLAG标记。用QuikChange方法替换Asp或Asn密码子（下划线）。以下引物用于产生Ser的突变¹⁶⁵：5′-CGT CTC TCA GTT GAT TAT GGC AAG AAG通用汽车公司AAG CTG GAG TTC TCC-3′用于S165D和5′-CGT CTC TCA GTT GAT TAT GGC AAGAAC公司S165N的AAG CTG GAG TTC TCC-3′。为了生产S158D、S241D和T337D，使用了以下引物：5′-GAA CGT CTC通用汽车公司GTT GAT TAT GGC AAG AAG TCC AAG CTG GAG-3′用于S158D，5′-GTG TCC ATC ACT GCT通用汽车公司S241D的CTG AGA TTT GAT GGA GC-3′和5′-GCC ATT GCC ACC ATC AAA通用汽车公司T337D的AAG CGT ACC ATC CAG-3′。为了验证每个位点特异性突变的存在，对整个开放阅读框进行了DNA序列分析（Macrogen（韩国首尔））。

通过将相应pCMV4结构的cDNA亚克隆到位于BamHI和XbaI位点的pcDNA3.1/Myc-His a载体中，为野生型（WT）α6-微管蛋白和α6-微管蛋白的S165D和S165N突变体构建了Myc融合蛋白。每个构造（马里兰州罗克维尔市Macrogen）验证了整个开放阅读框架的顺序。表达后，Myc标签序列被赋予羧基末端。用兔多克隆Myc抗体（Millipore Corp.）进行Western blot，证实50-kDa Myc标记的融合蛋白在MCF-10A细胞中高水平表达。

GFP-α6-Tubulin的构建

使用基于标准PCR的方法，人源化动物海肾绿色荧光蛋白（GFP）（Stratagene）通过6个Gly连接子融合在α6微管蛋白cDNA（野生型或突变型）的5′端。将融合构建物插入SacII和XhoI限制位点的pCMV4载体。每个构造（韩国首尔Macrogen）验证了整个开放阅读框架的顺序。

细胞培养和转染

传代中期MCF-10A人乳腺上皮细胞(19)来自Barbara Ann Karmanos癌症研究所（密歇根州底特律）。如前所述，将MCF-10A细胞培养在10-cm板（Falcon）上(4). MDA-MB-231细胞在Iscove改良的Dulbecco培养基中培养我-谷氨酰胺、10%胎牛血清和抗生素（1%青霉素/链霉素和0.5μg/ml真菌酮）。MDA-MB-468细胞在含有谷氨酰胺、10%胎牛血清和抗生素的RPMI中培养。用4μg与Fugene 6复合的cDNA在无血清培养基中瞬时转染细胞6 h，然后添加血清并在37°C、5%CO下培养₂48小时后，收集细胞。基于GFP编码载体的实验，转染效率通常为70%或更高。

运动性测定

这些细胞通过10孔歧管（CSM，Inc.，Phoenix，AZ）应用于10孔滑块上，该歧管将细胞沉降限制在一个小的限定区域。拆卸歧管后，电池向外辐射8小时。通过连接在计算机上的数码相机（Moticam 2000）和倒置的尼康双光显微镜分析细胞运动。通过测量总面积的变化（μm）来确定移动范围²)被使用Motic Images Plus 2.0软件的单元格占用。在测量期间，细胞在37°C、5%CO下培养₂在使用DAG-内酯或诺卡唑的实验中，在移除歧管后立即添加试剂（或0.1%（v/v）DMSO作为载体对照）(t吨=0），并且在测定的持续时间内存在。每个报告值是三次测量的平均值，以及相应的标准偏差值（S.D.）。

透性MCF-10A细胞的放射标记

用皂苷（50μg/ml）在等渗蔗糖缓冲液（130 m）中处理转染的MCF-10A细胞5 min米蔗糖，30米米氯化钾，30 m米醋酸钾，20 m米醋酸镁，1 m米氯化钙，20 m米含有磷酸丝氨酸磷酸酶抑制剂的HEPES，pH 7.4），然后添加[γ-³²P]（P）N个⁶-苯-ATP最终浓度为100μ米（～800 cpm/pmol）。这种试剂的合成在别处已有描述(18). 细胞在30°C下偶尔混合培养1小时，并通过离心法造粒。细胞颗粒通过超声波分解并在8000×克用α-微管蛋白抗体和蛋白A/G琼脂糖进行免疫沉淀，如下所述。在进行8%SDS-PAGE之前，用莱姆利样品缓冲液处理免疫球，并在95°C下加热5分钟。

样品制备和免疫沉淀

收集MCF-10A细胞并通过胰蛋白酶分解，然后用完全培养基洗涤两次，最后用无血清培养基洗涤一次。在溶解之前，细胞被重新悬浮并转移到新的Eppendorf管中。这些步骤有助于细胞分离和分裂，并证明优于简单的细胞刮除。为了直接制备细胞裂解物用于Western blot，细胞在50 m米Tris（pH 7.4），5 m米EDTA，5米米EGTA，15米米如前所述，2-巯基乙醇、1%（v/v）Triton X-100、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(18). 以牛血清白蛋白为标准，用比色蛋白质试剂（Bio-Rad）测量每个样品的蛋白质浓度。

如前所述，制备可溶性部分（含有胞质α-微管蛋白）(20). 收集MCF-10A细胞，通过离心（1000×克室温下5分钟），并在0.2 ml稳定缓冲液（0.1）中室温下溶解20分钟米管道，pH 6.9，30%甘油，5%（v/v）二甲基亚砜，1 m米硫酸镁₄，1米米EGTA、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂），含有1.0%Triton X-100。添加10μ米裂解缓冲液中的BIM（pan-PKC抑制剂）大大降低了本底，因为它阻止了分离过程中的不定磷酸化。将裂解液转移到新鲜试管中，并以100005×克在室温下保持45分钟。将含有可溶性微管蛋白（0.2 ml）的上清液的总蛋白（通常为200–300μg）标准化，并用放射免疫沉淀缓冲液将样品体积调整至1.0 ml。为了从每个可溶部分分离α-微管蛋白，使用单克隆抗α-微管蛋白（2μg/ml）进行免疫沉淀，如下所述。

对于免疫沉淀，在缓冲液中从转染细胞制备裂解物（在图例中指定图3和​和4）4)含蛋白酶抑制剂（1 m米苯甲基磺酰氟、10 ng/ml亮氨酸蛋白酶抑制剂、10 ng/ml大豆胰蛋白酶抑制剂）和磷丝氨酸磷酸酶抑制剂。将总蛋白样品正常化，并用小鼠IgG-琼脂糖在4°C下旋转预处理30分钟后，在4°C下用指定抗体进行旋转免疫沉淀，然后用蛋白A/G-琼脂处理1小时。通过800×离心收集免疫复合物克在4°C下清洗5 min。将颗粒在0.5 ml无洗涤剂腹腔缓冲液中再次悬浮，并在4°C下旋转5 min，然后在800×克持续5分钟。

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图3。

抗磷酸化α6-微管蛋白突变体（S165N）抑制MCF-10A细胞的运动并降低内源性α-微管蛋白的磷酸化。 一个，S165N-α6-微管蛋白抑制刺激的MCF-10A细胞的运动行为。在S165N突变体（GFP-（S165N）-α6-微管蛋白）表达后，检测细胞是否对WT-PKCα过度表达或用5μ米DAG-内酯用于实验期间。比较S165N突变体和PKCα激酶缺陷突变体阻碍运动的能力(杜兰特). 所有转染均使用等量的质粒DNA（4μg）。B类，S165N-α6-微管蛋白抑制MCF-10A细胞中DAG-内酯刺激的内源性α-微管蛋白磷酸化。用4μg S165N突变体或VC转染细胞米裂解前，DAG内酯或二甲基亚砜（0.1%，v/v）在37°C下保存30分钟。在0.2 ml微管稳定萃取缓冲液（0.1）中制备裂解液米管道，pH 6.9，30%甘油，5%二甲基亚砜，1 m米硫酸镁₄，1米米含蛋白酶抑制剂和10μ米BIM。从裂解液中制备含有未结合微管蛋白的可溶性部分（见“材料和方法”），并对总蛋白含量（280μg）进行归一化，用放射免疫沉淀缓冲液将每个样品体积调节为1.0 ml。样品用小鼠IgG-琼脂糖预处理，并用2μg小鼠抗α-微管蛋白免疫沉淀15 h，在4°C下旋转。免疫球蛋白被分成重复的印迹，并与兔多克隆磷酸化PKC底物抗体（1:500稀释）或兔抗α-微管蛋白（1:2500稀释）平行检测。结果代表了三个独立的实验。

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图4。

抗磷酸化α6-微管蛋白突变体（S165N）抑制人类乳腺癌细胞的运动。 一个GFP-（S165N）-α6-微管蛋白（4μg质粒）在表达非常高水平PKCα（MDA-MB-231）或完全不表达PKCα的人乳腺癌细胞系（MDA-MB-468）中表达后，对运动的主要负作用。每个值是三次测量的平均值±S.D.，结果代表三次独立实验。P（P），亲代细胞。B类，MDA-MB-468细胞中Myc-taggedα6-微管蛋白报告子构建的磷酸化。用4μg编码Myc标记的WTα6-微管蛋白、S165N突变体或VC的质粒转染细胞48小时米BIM或DMSO（0.1%，v/v），并在细胞裂解前在37°C下培养30分钟。在含有50 m的0.2 ml缓冲液中制备全细胞裂解物米三氯化氢，pH 7.4，150 m米氯化钠，1米米EGTA，10μ米BIM和0.5%的Nonidet P-40。将总蛋白含量（550μg）归一化后，将裂解液在无洗涤剂缓冲液中稀释5倍，然后用小鼠IgG-琼脂糖进行预处理，并用5μg小鼠抗Myc抗体进行免疫沉淀（旋转6小时，4°C）。在Western blot中检测到Myc-taggedα6-微管蛋白（50kDa带），用兔抗磷-PKC底物（1:500）和兔抗Myc底物（1:1000）依次探测。结果代表了三个独立的实验。

Western Blot分析

如前所述，已知蛋白质浓度的样品在样品缓冲液中变性(18)然后在Duracryl上进行8%的SDS-PAGE，然后电泳转移到15×15-cm聚偏二氟乙烯膜（Immobilon-P），并封闭在5%奶粉中。用初级和辣根过氧化物酶偶联次级抗血清进行免疫化学分析，并用化学发光检测。

重组α6-管蛋白的体外磷酸化

进行磷酸化在体外将高纯度重组GST-α6-微管蛋白（Abnova Corp.）和GST-PKCα（Cell Signaling Technology，Inc.）各1μg结合在含有25 m米Tris，pH 7.4，10 m米醋酸镁，0.5 m米钙²⁺、磷脂酰丝氨酸（0.1 mg/ml）和0.5 m米二硫苏糖醇。添加50μ米ATP或[γ-³²P] ATP（～200 cpm/pmol），反应在30°C下进行30分钟。通过加入莱姆利样品缓冲液来猝灭每个反应，并在95°C下加热5分钟，然后进行6%SDS-PAGE并用凝胶蓝染色。用于质谱分析的样品在厚度为0.75 mm的6%SDS-PAGE凝胶上进行解析。

质谱法鉴定蛋白质

在耶鲁大学癌症中心凯克基金会质谱资源实验室对α6-微管蛋白进行了鉴定。凝胶溶解蛋白被消化就地如前所述，用胰蛋白酶（Promega）在反相微切片上分批纯化，并在Waters Q-TOF质谱仪上通过液相色谱-串联质谱分别分析产生的肽库(18). 使用自动MASCOT算法搜索所有串联质谱光谱。鉴定要求两个或多个光谱与数据库中的相同蛋白质条目相匹配。

结果

α6-管蛋白作为细胞内PKCα底物的鉴定

α6-微管蛋白最初是通过与MCF-10A细胞裂解物中的M417A-PKCα共同免疫沉淀来鉴定的。这种可追踪的PKCα突变体被表达为FLAG标记产物，并用FLAG抗体从无洗涤剂细胞裂解液中进行免疫沉淀，以“下拉”与之结合的任何高亲和力底物蛋白-³²P] 苯基-ATP产生了几个³²通过一维SDS-PAGE解析并通过放射自显影术分析的P标记产物。在典型实验中(18)M417A-PKCα产生了50–55kDa的强条带，但在WT-PKCα或载体对照观察到的带型中没有。PKCα可追踪激酶特有的放射性标记带的发现表明，这些蛋白是潜在的底物。当通过质谱分析时，发现50-55kDa带含有α6-微管蛋白。α6-微管蛋白是否确实磷酸化尚待证实。鉴于微管对细胞运动力学的重要性，进一步研究了α6-微管蛋白在完整细胞环境中作为直接PKCα底物的新可能性。

为了确定PKCα直接磷酸化α6-微管蛋白，进行了一个反应在体外含有重组人GST-α6-微管蛋白、重组人GST PKCα和[γ-³²P] ATP，如“材料和方法”中所述。用于此分析的GST-α6-微管蛋白（75kDa）是在真核系统（小麦胚芽无细胞系统）中产生的，该系统确保重组蛋白正确折叠。在如所示的实验中图1一个，实质性合并³²放射自显影可显示P转化为α6微管蛋白。凝胶蓝染色显示，相对于未经处理的α6-微管蛋白，磷酸蛋白具有可检测到的更高分子量在体外用纯化的重组GST蛋白（GST-Mu）证实该标签不是PKCα的底物。

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图1。

体外α6微管蛋白的胞内磷酸化。 一个在50μg的存在下，通过重组GST-PKCα（1μg）直接磷酸化重组75-kDa GST-α6-微管蛋白米[γ-³²P] ATP+激活器（0.5 m米钙²⁺，磷脂酰丝氨酸（0.1 mg/ml）），在30°C下放置30分钟，如“方法”所述。产物用6%SDS-PAGE溶解，然后用凝胶蓝染色，并在−20°C下放射自显影2天。结果代表了三个独立的实验。B类渗透性MCF-10A转染剂中α-微管蛋白的细胞内磷酸化。收集转染M417A-PKCα或VC的细胞，在低渗、无洗涤剂缓冲液（20 m）中溶解米Tris，pH 7.4，2 m米EGTA，2米米氯化镁₂，1米米二硫代苏糖醇），用皂苷（50μg/ml）渗透，并用100μ米[γ-³²P]（P）N个⁶-苯-ATP，如“方法”所述。用抗α-微管蛋白免疫沉淀细胞裂解物，并在−20°C下用8%SDS-PAGE和放射自显影术分析免疫球蛋白1周。实验进行了两次，结果相似。

为了证明在完整的MCF-10A细胞中α6-微管蛋白也被PKCα磷酸化，内源性α-微管蛋白在[γ-³²P] 苯基-ATP。在表达M417A-PKCα的细胞中，反应是通过用皂苷渗透细胞来启动的，以促进100μ米[γ-³²P] 苯基-ATP(21). 由于突变体对天然ATP的亲和力低10倍，因此在内源性ATP的存在下，该ATP类似物有望优先与突变体PKCα结合(18). 在30分钟细胞内反应后，制备裂解物，并用单克隆抗体免疫沉淀α-微管蛋白。在所示的自动射线图中图1B类观察到α-微管蛋白在表达M417A-PKCα的完整细胞中进行放射标记，而仅接受对照载体的细胞则相反。

PKC磷酸化共有位点突变的α6-管蛋白的开发与表征

人α6-微管蛋白的一级序列⁴检测PKC共有序列的存在，该序列由两侧为碱性残基的Ser或Thr组成(22). 发现了四个潜在地点。一个站点，Ser¹⁶⁵，嵌套在一个完全一致的序列中，而其他三个位点，即Ser¹⁵⁸，序列号²⁴¹和Thr³³⁷包含部分一致序列。值得注意的是，这四个位点存在于所有已知的人类α-微管蛋白亚型中，但在β-微管蛋白中完全不存在。为了确定PKCα对α6-微管蛋白的磷酸化是否具有功能意义，在每个潜在的磷酸化位点引入了单位点突变：¹⁵⁸或Ser¹⁶⁵(RLS公司¹⁵⁸VDYG公司KKS公司¹⁶⁵K)，序列号²⁴¹(S公司²⁴¹左后)，或Thr³³⁷(KT公司³³⁷韩国). 用天冬氨酸残基替换Ser或Thr，以模拟磷酸盐（“假磷酸盐”）的存在。最初，这些突变体是用一个COOH末端的FLAG标签开发的，该标签由一小段酸性残基组成。然而，由于α6-微管蛋白在其COOH末端具有多个酸性残基，也被该抗体识别，因此FLAG抗体不能用于区分天然蛋白和突变蛋白。为了检测突变的α6-微管蛋白，制备了α6-微管蛋白（WT或突变）与GFP标记的氨基末端融合物（见“材料和方法”）。先前一项关于GFP与α-微管蛋白融合的类似研究表明，GFP部分不会干扰其并入微管(23).

将每个构建物转染MCF-10A细胞后，通过α-微管蛋白抗体的Western blot验证每个GFP-α6-微管蛋白突变蛋白（75kDa）的稳定表达(图2一个)检测到GFP融合蛋白（75kDa带）和内源性α-微管蛋白（50kDa条带）。GFP结构在高水平和同等水平上稳定表达。

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图2。

GFP-α6-微管蛋白假磷酸化突变体对MCF-10A细胞运动性的影响。 一个用α-微管蛋白单克隆抗体通过Western blot分析表达重组WT-GFP-α6-微管蛋白、假磷酸化GFP突变体（S165D、S158D、S241D或T337D）或VC的MCF-10A转染体（25μg/lane）的裂解产物，以检测GFP融合蛋白（75 kDa）和内源性α-微管蛋白（50 kDa。注意，为了进行比较，包括了抗磷酸化突变体S165N。结果在三个独立的实验中观察到。B类用转染GFP-α6-微管蛋白、WT-PKCα的单位点假磷酸化突变体或载体对照的MCF-10A细胞进行运动测定。每个值是三次测量的平均值±S.D.。结果代表三次独立实验。

为了确定任何假磷酸化α6-微管蛋白突变体的表达是否能再现PKCα表达对细胞运动的影响(4)，每个α6-微管蛋白突变体在MCF-10A细胞中表达，然后测试其对运动行为的影响。如所示图2B类，表现出最强运动行为的细胞是那些表达带有S165D突变的α6-微管蛋白的细胞。重要的是，这种运动水平相当于转染WT-PKCα的细胞所产生的运动水平。相比之下，S158D、S241D或T337D突变体的表达没有产生高于WTα6-微管蛋白或载体控制（VC）观察到的运动能力。每个结构的三个不同克隆对运动性（或缺乏运动性）的影响相同，从而证实克隆变异不是一个因素。进一步注意到，用GFP标记的α6-微管蛋白突变体测量的运动行为与用类似的FLAG标记结构转染的细胞的运动行为相同（数据未显示）。

我们考虑了PKCα是α6-微管蛋白中的磷酸化位点的可能性，这些位点不是共有位点。由纯重组PKCα磷酸化的重组α6微管蛋白衍生的胰蛋白酶肽的质谱在体外只透露了Ser¹⁵⁸作为磷酸化位点（数据未显示）。然而，该位点（S158D）的假磷酸化对运动无影响(图2B类). 可能是磷酸化-Ser¹⁶⁵未检测到，因为其两侧有赖氨酸残基，这些赖氨酸残留物可能被胰蛋白酶裂解，从而产生Ser¹⁶⁵作为二肽的一部分。此外，由于质谱测量仅基于27%的蛋白质覆盖率，因此其他位点很容易躲过这一分析。

一种抗磷酰化血清¹⁶⁵α6-管蛋白突变体抑制受刺激MCF-10A细胞和转移性乳腺癌细胞的α-管蛋白磷酸化和运动

探讨Ser磷酸化的功能意义¹⁶⁵，通过取代Ser，制备了α6-微管蛋白的磷酸化抗性突变体¹⁶⁵具有Asn残基（S165N），以便为S165D突变体提供等位控制。Western blot证实S165N-α6-微管蛋白在MCF-10A细胞中稳定表达(图2一个). 下一步是测试这种突变是否对MCF-10A细胞的运动具有显性负效应，MCF-10A细胞的运动是由WT PKCα的工程表达（在MCF-10C细胞中具有组成活性）或用DAG-内酯处理亲代细胞诱导的，DAG的一种膜透性类似物，选择性激活内源性PKCα(6). 为了测试对运动的显性负效应，MCF-10A细胞要么联合转染WT PKCα和S165N-α-微管蛋白，要么只转染S165N突变体，然后用DAG-内酯处理。如所示图3一个S165N突变体抑制了WT PKCα诱导的运动72%。同样，当用DAG-内酯激活S165N转染细胞时，与载体控制细胞相比，产生的细胞运动被抑制了44%。经DAG-内酯处理的细胞的运动性被激酶脱去PKCα的工程表达抑制到类似程度。

评估Ser¹⁶⁵在α-微管蛋白是PKC介导磷酸化的主要靶点的情况下，表达S165N-α6-微管蛋白（或载体控制）。如果Ser¹⁶⁵是磷酸化的首选位点，那么它应该阻止DAG-内酯刺激的内源性α-微管蛋白的磷酸化。裂解用或不用DAG内酯处理过的MCF-10A转染子，并制备可溶性部分（含有胞质微管蛋白）。对内源性α-微管蛋白进行免疫沉淀，免疫球蛋白进行Western blot分析。用识别磷酸化PKC共有位点（PKC底物抗体）的抗体检测磷酸化α-微管蛋白。结果(图3B类)结果表明，当用DAG-内酯刺激细胞时，内源性α-微管蛋白（50kDa带）被强烈磷酸化。然而，与未经刺激的对照组相比，当DAG-内酯刺激的细胞也表达α6-微管蛋白的S165N突变时，这种磷酸化信号可显著降低。因此，Ser¹⁶⁵α-微管蛋白似乎是PKCα磷酸化的主要靶点。

S165N突变体的表达对转移性人类乳腺癌细胞的内在运动具有类似的抑制作用。比较表达PKCα水平升高的MDA-MB-231细胞(24)和MDA-MB-468细胞，不表达任何常规亚型（包括PKCα）(25)但表达其他DAG敏感亚型(例如PKCδ（最丰富）、PKCϵ和PKCη(25)).图4一个证明在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中工程过表达S165N突变体分别抑制其固有运动能力60%和75%。

由于MDA-MB-468细胞不表达传统的PKC亚型，因此在这些细胞中比较了体外表达的Myc-WTα-微管蛋白或Myc-S165N突变体的磷酸化。每个构建体都用小鼠抗Myc的全细胞裂解物进行表达和免疫沉淀。从免疫细胞中制备蛋白质印迹，并依次用PKC底物抗体和抗Myc探针检测(图4B类). 分析表明，表达报告基因WTα-微管蛋白（50kDa）的MDA-MB-468细胞表现出强烈的磷酸化水平，而表达WTα6-微管蛋白的细胞经二-吲哚甲酰亚胺-1（pan-PKC抑制剂）导致非常微弱的磷酸化。这一发现表明该位点主要由PKC亚型磷酸化。重要的是，Myc-tagged S165N-α6-微管蛋白的表达导致其磷酸化显著降低。在S165N构建体中有一些磷酸化的证据揭示了额外磷酸化位点（如Ser¹⁵⁸). 尽管如此，乳腺肿瘤细胞的这些结果暗示Ser¹⁶⁵作为与运动行为密切相关的非传统PKC亚型磷酸化的主要位点。

α-管蛋白磷酸化与微管伸长

通过测试诺克唑对运动能力的影响，发现α-微管蛋白磷酸化产生的运动行为实际上是由微管介导的。该试剂抑制微管伸长和缩短速度，并减少动态不稳定性(26). 表达重组PKCα或S165D-α6-微管蛋白的高能动性MCF-10A细胞在连续处理（8 h）和5μ米诺卡唑(图5). 细胞运动对诺卡唑敏感，这与拉长微管的要求一致。总的来说，这些发现支持了PKC磷酸化Ser的模型¹⁶⁵从而促进微管伸长和运动行为。

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图5。

诺康唑治疗可消除PKCα或S165D-α6-微管蛋白产生的MCF-10A细胞的运动性。用4μg编码PKCα、S165D-α6-微管蛋白或载体对照的质粒DNA转染细胞，如“材料和方法”所述。48小时后，将细胞接种到10孔载玻片上，然后在37°C和5%CO下培养₂隔夜，细胞被处理(t吨=0），5μ米诺卡唑（或0.1%（v/v）DMSO），并在8小时后分析运动性。每次测量是三次测量的平均值±S.D.，结果代表三次独立实验的结果。

讨论

在该实验室先前的一项研究中，运动行为的获得是由非运动MCF-10A细胞中WT PKCα的工程过表达引起的(4). 在本研究中，应用可追踪激酶方法，我们确定α6-微管蛋白是MCF-10A细胞中PKCα的底物，也产生运动表型。在PKC共有位点构建α6-微管蛋白假磷酸化突变体提供了鉴定Ser¹⁶⁵作为磷酸化的关键位点。Ser的模拟磷酸化¹⁶⁵（S165D-α6-微管蛋白）赋予转染细胞诺克唑敏感性运动能力。在补充实验中，磷酸化抗性突变体（S165N-α6-微管蛋白）的表达对转移性人类乳腺癌细胞的运动具有显著的负面影响。这些结果进一步暗示了α6-微管蛋白及其在血清中的磷酸化¹⁶⁵PKC对转移性乳腺细胞微管结构和运动行为的调节。

α6-微管蛋白作为细胞内PKCα底物，是我们对微管蛋白翻译后修饰理解的新进展(27). 与其他已知的微管蛋白修饰（如酪氨酸化、谷氨酰化和乙酰化）不同，微管蛋白的磷酸化仅受到有限的关注。在这方面，已经观察到α-微管蛋白羧基末端的磷酸化(28)以及PKCθ对β-微管蛋白的磷酸化(29)和G蛋白偶联受体激酶2(30)已报告。迄今为止最完整的研究检查了细胞周期素依赖性激酶Cdk1介导的细胞内β-微管蛋白磷酸化，其磷酸化促进了现有聚合物的分解(31,32). Fourest Lieuvin最近的一项研究等。(33)证明β-微管蛋白在血清中通过Cdk1直接磷酸化¹⁷²(棕色在里面图6). 该位点不存在于α-微管蛋白中，位于β-亚基和第二异二聚体α-亚基界面的GTP结合域内。在该研究中，假磷酸化GFP-β3-微管蛋白（带有获得功能突变体S172D或S172E）在微管中结合不良，尤其是在有丝分裂期间。这些发现表明，Cdk1在Ser的磷酸化¹⁷²β-微管蛋白可能通过损害GTP结合或异二聚体之间的相互作用来阻止和/或逆转聚合成微管。四里夫因等。(33)观察到Cdk1介导的β-微管蛋白磷酸化伴随有丝分裂。与他们的发现相反，我们已经表明，当PKCα在MCF-10A细胞中过度表达时，由于通过G₁(4). 不管这两种酶的其他靶点是什么，我们推测Cdk1和PKCα以不同的方式和可能在细胞周期的不同点与微管蛋白亚基相互作用，从而对微管结构产生其特有的影响。

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图6。

组装微管蛋白异二聚体的结构模型。模型显示Ser¹⁶⁵(绿色)α-微管蛋白亚基(蓝色)位于两个聚合的α/β-异二聚体的界面。序号¹⁶⁵参与与生长聚合物正端的β-微管蛋白亚基的纵向接触，并可能影响GTP水解或GDP/GTP在β-微管蛋白上的交换。指出了β-微管蛋白的可交换GTP/GDP和α-微管蛋白质的不可交换GTP。突出显示的在里面棕色的是由Cdk1（Ser）磷酸化的β-微管蛋白中的位点¹⁷⁴在此模型中）(33). α/β-异二聚体的分子模型（蛋白质数据库条目1TUB（塔布）)使用蛋白质浏览器2.80版进行。

值得注意的是¹⁶⁵α-微管蛋白和丝氨酸¹⁷²β-微管蛋白在两个组装异二聚体的界面附近紧密并列。如所示图6，序列号¹⁶⁵(绿色)位于α-微管蛋白的表面。该位点靠近T5环（氨基酸175–184），在组装异二聚体之间的纵向接触中起协同作用，特别是在生长端β-微管蛋白亚基上的可交换GTP（GTP帽）附近（“正端”）(34,35). 在微管蛋白异二聚体聚合成原丝的过程中，进入二聚体的α-微管蛋白与正端β-微管素接触，从而导致可交换GTP水解为GDP；这种反应被认为与α-微管蛋白T7环中的催化残基有关(35). 在Ser处可能存在带负电荷的磷酰基¹⁶⁵α-微管蛋白通过以下方式促进微管蛋白聚合：（i）增加α-微管蛋白和正端β-微管素之间的接触，（ii）增加正端β微管蛋白对GTP的水解，或（iii）通过鸟嘌呤核苷酸交换因子促进新GTP产生的GDP的交换。

在细胞运动过程中，微管发生动态不稳定性，这种不稳定性由伸长和缩短的交替阶段定义，并被认为受蛋白质的调节(例如EB-1、CLIP-170或APC）在加号端绑定(36–38). 一些实验室已将GFP-EB1用作跟踪正末端动态形成的工具，以指示微管伸长活动(37,38). 微管伸长和收缩的交替阶段被认为受到下游事件的影响，包括Rho GTPases(例如Rac 1、Cdc42和RhoA）和stathmin/Op18磷酸化(36,39–46). 在这方面，生长微管的正端被Rac 1和Cdc42捕获并稳定在前缘，它们在运动细胞的这一区域的激活度最高。在其他人提出的一个模型中，有人认为延长微管作为正反馈，可以促进Rho-GTPase的活性(39,42)和stathmin/Op18磷酸化(47)，两个与微管动力学和细胞定向运动相关的事件(38). 在用DAG-内酯处理或表达α6-微管蛋白S165D突变的MCF-10A细胞中，我们观察到Rac 1抑制剂NSC23766可抑制80%以上的运动，⁵从而支持Rac 1的下游作用，正如我们先前对显性负Rac 1进行的研究所初步建议的那样(4). 然而，用磷酸Stathmin抗体进行的蛋白质印迹分析，每个抗体识别三个已知磷酸化位点中的一个（Ser²⁴，序列号³⁷，或序列号⁶³) (47)，显示PKCα刺激或DAG-内酯处理的MCF-10A细胞的磷酸化没有增加。⁵α-微管蛋白磷酸化指导微管结构动力学的精确机制为进一步研究提供了新的方向。

这些研究表明¹⁶⁵α-微管蛋白作为PKCα和其他DAG-敏感PKC亚型的靶位点，包括传统亚型（α、βI、βII和γ），即钙²⁺-和DAG依赖，以及新的亚型（δ、ϵ、η和θ），它们是DAG刺激的和Ca²⁺-独立。在这方面，MDA-MB-468细胞的内在运动性(图4一个)反映了非传统PKC亚型的活性(25). 然而，PKC选择性抑制剂对α-微管蛋白磷酸化的抑制二-吲哚酰亚胺-1证实PKC亚型而非未知蛋白激酶负责磷酸化报告基因WTα6-微管蛋白。此外，塞族人的封锁¹⁶⁵通过表达S165N-α6-微管蛋白，可抑制运动(图4一个)和报告结构的磷酸化丢失(图4B类). 这些发现强烈暗示非传统PKC亚型也能识别Ser¹⁶⁵作为α-微管蛋白的主要共同靶点。

在一项相关研究中，MCF-10A细胞被靶向参与迁移和粘附的基因的siRNA试剂处理(9)，发现两种新的PKC亚型具有相反的作用(即PKC活性被认为具有促运动效应，而PKCη则反对迁移）。内源性PKCα也与迁移有关，但前提是MCF-10A细胞过度表达ErbB2，以激活PKCα作为EGF受体途径的一个组成部分（参见参考文献。9). 在对肠上皮Caco-2细胞进行的其他研究中(29)研究了特异性PKC亚型对微管结构的影响。这里，PKCθ是一种新的亚型，可磷酸化β-微管蛋白（位于未指定的Thr位点），其活性与微管聚合增加有关。相反，新型亚型PKCδ和非典型亚型PKC-λ（对DAG和Ca均不敏感²⁺)促进微管拆卸(48). 尽管这些研究表明PKC亚型对微管动力学产生不同的影响，但目标位点尚未确定。

此处描述的PKCα刺激的信号通路不需要仅由α6-微管蛋白介导，因为该蛋白也存在多种亚型。已分离出六种α-微管蛋白同工酶，所有这些同工酶都包含90-98%的序列同源性，包括此处测试的所有PKC共有位点，包括Ser¹⁶⁵然而，这些共有位点在微管蛋白超家族的其他成员中完全缺失：β、γ、δ、ϵ和ζ(49). 在已知存在的六种人类α-同种异型中，质谱法仅在人类癌细胞（包括MDA-MB-231细胞）中检测到α6-和Kα1-微管蛋白(50–52)或通过实时定量逆转录PCR(53).

致谢

参考文献