Microtubule regulation in mitosis: tubulin phosphorylation by the cyclin-dependent kinase Cdk1

doi:10.1091/mbc.e05-07-0621

.2006年3月；17(3):1041-50.

doi:10.1091/mbc.e05-07-0621。 Epub 2005年12月21日。

有丝分裂中的微管调节：细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk1对微管蛋白的磷酸化

安妮·福雷斯特·利乌文¹, 莱蒂西娅·佩里斯, 文森特·加切, 伊莎贝尔·加西亚-塞兹, 塞琳·朱兰·比纳德, 维奥琳·兰特斯, 迪迪埃·约伯

附属公司

PMID： 16371510
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有丝分裂中的微管调节：细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk1对微管蛋白的磷酸化

安妮·福雷斯特·利乌文等。分子生物学细胞. 2006年3月.

.2006年3月；17(3):1041-50.

doi:10.1091/mbc.e05-07-0621。 Epub 2005年12月21日。

作者

安妮·福雷斯特·利乌文¹, 莱蒂西娅·佩里斯, 文森特·加什, 伊莎贝尔·加西亚-塞兹, 塞琳·朱兰·比纳德, 维奥琳·兰特斯, 迪迪埃·约伯

附属

¹法国格勒诺布尔Cedex 9，38054，CEA，INSERM Unité366，Cetsquelette实验室。anne.fourest-liewin@cea.fr

PMID： 16371510
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摘要

细胞周期素依赖性激酶Cdk1在从间期到有丝分裂的转变过程中的激活引起微管动力学的重要变化。Cdk1磷酸化许多微管或微管蛋白结合蛋白，但迄今为止，微管蛋白本身尚未被检测为Cdkl底物。在这里，我们显示Cdk1在体外和体内磷酸化β-微管蛋白。β-微管蛋白的Ser172发生磷酸化，该位点在进化过程中非常保守。使用磷酸肽抗体，我们发现细胞微管蛋白的一部分在有丝分裂期间被磷酸化，这种微管蛋白磷酸化被Cdk1抑制剂roscovitine抑制。在有丝分裂细胞中，磷酸化微管蛋白被排除在微管之外，存在于可溶性微管蛋白部分。与细胞内的这种分布一致，体外Cdk1磷酸化微管蛋白掺入生长微管中受到损害。此外，当在细胞中表达时，模拟磷酸化微管蛋白的EGFP-beta3-微管蛋白（S172D/E）突变体无法并入微管。模型显示，172位磷酸丝氨酸的存在可能损害GTP与β-微管蛋白的结合以及微管蛋白二聚体之间的相互作用。这些数据表明，Cdk1对微管蛋白的磷酸化可能参与有丝分裂期间微管动力学的调节。

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数字

**图1。**
Cdk1在体外磷酸化天然和重组β-微管蛋白。（A）纯化的HeLa细胞微管蛋白在γ存在下孵育³²P-ATP加（+）或不加（-）Cdk1-cyclin B。然后对样品进行SDS-PAGE（顶部）处理，并通过放射自显影术（底部）进行分析。（B）麦芽糖结合蛋白-CK2融合蛋白、重组β微管蛋白和重组α微管蛋白与Cdk1-cyclin B在γ存在下孵育³²P-ATP。对样品进行SDS-PAGE（左）处理，并使用磷光成像仪（PI，右）进行分析。

**图2。**
Cdk1磷酸化丝氨酸172残基上的β-微管蛋白。（A）使用软件ClustalW（Infobiogen，Evry，France）将161-190和204-233残基中的人类β1-微管蛋白序列（NCBI蛋白质数据库中的登录号PO7436）与其他生物体的β-微管蛋白顺序对齐。保存的残留物显示在灰色背景上，S₁₇₂PK和T₂₁₉P站点以粗体显示，T5循环以下划线显示。（B）将两个合成肽中的每一个肽与Cdk1-cyclin B和γ孵育，这两个肽与人类β1-微管蛋白序列从残基164到残基182相匹配³²P-ATP。在Ser172上用磷酸盐合成了一种肽pep172-P。作为对照，将这两种肽的混合物与γ孵育³²P-ATP，但不含Cdk1。孵育后，对每个肽中的结合放射性进行计数。（C）野生型（WT）或点突变重组β-微管蛋白在γ³²P-ATP含有（5-8道）或不含（1-4道）Cdk1-cyclin B。检测的突变株如下：Ser172至Ala（S172A）β-微管蛋白（2道和6道）、Thr219至Ala的（T219A）β微管蛋白的（3道和7道）和S172A/T219A双突变β-微管蛋白（4道和8道）。孵育后，对样品进行SDS-PAGE（顶部）处理，并使用磷光成像仪（底部）进行分析。

**图3。**
抗磷酸肽P172抗体是Cdk1体外磷酸化的β-微管蛋白的特异性抗体。（A）重组β-微管蛋白（第1和第2道）和天然牛脑微管素（第3和第4道）在含有非放射性ATP（第1道和第3道）或不含Cdk1-cyclin B（第2道和第4车道）的情况下培养。然后用P172 Ab（底部）处理样品进行Western blotting。显示蓬松红染色。（B）野生型（WT）或点突变重组β-微管蛋白在含有（5-8道）或不含（1-4道）Cdk1-cyclin B的ATP的情况下培养。测试的β-微管蛋白突变体如图2所示。孵育后，用P172抗体处理样品进行Western blotting。

**图4。**
在M期细胞提取物中，β-微管蛋白在Ser172上被磷酸化。（A）使用蚜虫灵（Aphi）将HeLa S3细胞阻滞在G1/S期，或使用诺卡唑（Noc）将其阻滞在M期，或从诺卡唑块中释放30或60分钟。从这些细胞中分离出微管蛋白，并用P172 Ab（底板）进行蛋白质印迹。图中显示了斑点的蓬松红染色（顶面板）。（B）在诺康唑暴露前，用或不用罗斯科汀处理HeLa S3细胞。从这些细胞中分离出微管蛋白，并用P172 Ab（中间板）进行蛋白质印迹。图中显示了斑点的蓬松红染色（顶面板）。作为对照，用4A4单克隆抗体对同一细胞的总提取物进行印迹，该单克隆抗体特异性识别Cdk1-磷酸化波形蛋白位点（底图；Meijer等。，1997). （C） SDS-PAGE后，将等量的WT和S172A重组β-微管蛋白转移到硝化纤维上。进行Ponceau染色以控制转移（顶部面板）。硝酸纤维素膜在37°C下与有丝分裂细胞提取物（补充有ATP和MgCl）孵育₂在用P172 Ab（底板）进行免疫印迹之前，彻底清洗膜。

**图5。**
P172抗体染色有丝分裂细胞，但在有丝分裂的微管中未检测到磷酸化微管蛋白。（A）粘附的HeLa细胞用P172 Ab（左）和抗β-微管蛋白TUB 2.1 mAb（中）双重染色。DNA用Hoechst 33258染色（右）。照片是在传统的荧光显微镜上拍摄的。（B）将粘附的HeLa细胞标记为A，并在共焦显微镜上进行分析。叠加的图像被合并（右）。棒材，20μm。（C）用诺卡唑将HeLa S3细胞阻滞在M期，提取游离微管蛋白组分和聚合微管蛋白（对应细胞中的微管）。用P172 Ab（底部）进行Western blotting分析这两个组分。印迹的蓬松红染色如图所示（顶部）。（D）游离和聚合微管蛋白组分中磷酸-微管蛋白的半定量。对于每个微管蛋白组分，评估了磷酸-管蛋白的数量（相对于Ponceau染色的P172染色），结果以总磷酸-管蛋白质（游离+聚合）的百分比给出。

**图6。**
体外被Cdk1磷酸化的微管蛋白在微管中的结合很差。（A）牛脑微管蛋白在γ存在下孵育³²P-ATP含有（第3和第4道）或不含（第1和第2道）Cdk1-cyclin B。然后，微管蛋白聚合并离心分离微管颗粒（P）和未聚合的微管蛋白（S）。对等量的每个样品进行SDS-PAGE处理，并用考马斯染色和磷光成像仪（PI）分析，或用P172 Ab（底部）印迹。显示了斑点的蓬松红染色。（B）与A中的实验相同，只是聚合步骤是在紫杉醇存在下进行的。（C）聚合步骤中使用或不使用紫杉醇进行的实验的上清液（S）和颗粒（P）中微管蛋白（通过Ponceau红染色显示）和磷酸-微管蛋白的比例（通过P172 Ab染色显示）的半定量。结果显示为总微管蛋白（S+P，顶面板）或总磷酸化-微管蛋白的百分比（S+P，底面板）。

**图7。**
转染EGFP-β-微管蛋白^S172D型保持可溶性，而EGFP-β-微管蛋白^重量和EGFP-β-微管蛋白^S172A型与微管共定位。用EGFP-β-微管蛋白转染粘附的HeLa细胞^重量，EGFP-β-微管蛋白^S172A型，或EGFP-β-微管蛋白^S172D型细胞要么直接固定（A），要么在固定前溶解（B）。用GFP抗体和α-微管蛋白AG单克隆抗体对整个细胞和裂解细胞进行双重染色。EGFP-β-微管蛋白^S172D型（B，右图），GFP染色过度暴露，以可视化溶解的转染细胞。这里的数据代表了对三个独立实验中100个转染细胞的分析。棒材，20μm。

**图8。**
Ser172位于β-微管蛋白的核苷酸附近，磷酸化的Ser172可能会干扰GTP/GDP结合和周转。（A）微管蛋白异二聚体三维结构中Ser172残基的定位（登录号PDB#1JFF，Lowe等。，2001). 请注意，Ser172在PDB#1JFF中编号为Ser174。丝氨酸残基为红色，β-微管蛋白中的GDP核苷酸为绿色，α-微管蛋白质中的GTP核苷酸为黄色。（B）使用图形包TURBO-FRODO对位置172处的磷丝氨酸（P-Ser）进行建模。磷酸基团和GDP核糖之间的一些可能干扰用蓝色虚线表示。

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