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细胞生物学杂志。2009年6月15日；185(6): 1047–1063.
doi（操作界面）：10.1083/jcb.200811099
PMCID公司：PMC2711607型
PMID：19528297
第条

线粒体嵴和嵴连接的形成取决于Fcj1和Su之间的拮抗作用e（电子）/克

里贾娜·拉贝尔,1,2 文森特·索巴尼耶,1,2,三 罗兰·舒尔茨,4 弗兰克·沃格尔,5 纳丁·门德尔,1,2 安德烈亚·瓦西尔杰夫·纽梅耶,1,2 克里斯蒂安·科纳,1,2 拉维·加加西亚,6 托马斯·凯尔,4 沃尔夫冈·鲍迈斯特,4 马雷克·塞尔克拉夫,4 沃尔特·诺佩特,1,2,4和安德烈亚斯·雷切尔（Andreas S.Reichert）通讯作者1,2,7
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

嵴连接（CJ）对线粒体的组织和功能很重要，但其形成和结构的分子基础尚不清楚。我们已经鉴定并表征了酵母中的线粒体膜蛋白Fcj1（CJ蛋白1的形成），该蛋白在CJ中特异性富集。缺乏Fcj1的细胞缺乏CJ，在线粒体基质中表现出同心的内膜堆积，并显示F水平增加1F类O（运行）–ATP合成酶（F1F类O（运行）)超级复杂。Fcj1的过度表达导致CJ形成增加、嵴分枝、CJ直径增大和F水平降低1F类O（运行）超复数。F的减值1F类O（运行）通过亚基缺失形成低聚物e（电子）/克（苏e（电子）/克)导致CJ直径增大，嵴尖端数减少，促进嵴分枝。Fcj1和Sue（电子）/克基因相互作用。我们提出了一个模型，其中Fcj1和Su之间的对抗e（电子）/克局部调制F1F类O（运行）寡聚状态，从而控制嵴的膜曲率以生成CJ和嵴尖端。

介绍

线粒体是真核生物中普遍存在的细胞器，具有多种重要功能。线粒体由两层膜组成：外膜（OM）和内膜（IM）。IM由两个亚结构域组成：内界膜（IBM）和嵴膜（CM）。IBM与OM紧密相连，两者都形成了细胞器的双层外壳。CM是IBM在矩阵空间中的内陷。CMs的形态存在较大变化(Munn，1974年;福塞特，1981年; 有关审查，请参阅Zick等人，2009年)和异常线粒体结构已被描述为人类的许多病理情况(DiMauro等人，1985年;华莱士，2005). 观察到CM的管状、层状甚至三角状结构(福塞特，1981年). 线粒体序列切片的电镜显示，嵴通过不同长度的狭窄管状或槽状结构与IBM相连，即所谓的嵴连接（CJs）(Daems and Wisse，1966年)和电子断层扫描(Mannella等人，1994年;Perkins等人，1997年,1998;Nicastro等人，2000年;Frey等人，2002年; 有关评论，请参见弗雷和曼内拉，2000年;Mannella等人，2001年). CJ的直径很小，从12纳米到40纳米不等(Nicastro等人，2000年;Perkins等人，2003年; 审查请参见弗雷和曼内拉，2000年). 这导致了CJ对蛋白质和代谢物在嵴内和膜间以及CM和IBM之间的运动形成障碍的建议(Mannella等人，1994年). CJ的这种作用被认为对氧化磷酸化的调节具有重要影响，因为这类屏障可能会限制ADP等代谢物向晶内空间的扩散，并调节通过IM的pH梯度(Perkins等人，1997年;Renken等人，2002年; 有关评论，请参见Mannella等人，2001年;曼内拉，2006年a). 此外，根据线粒体的生化亚分馏提出了IM的亚室化(沃纳和诺伊伯特，1972年;Pon等人，1989年)单个线粒体蛋白的免疫电镜定位(Gilkerson等人，2003年)或荧光显微镜(Wurm和Jakobs，2006年). 最近，通过使用定量免疫电镜测定20个线粒体蛋白的分布，解决了这种亚室化(Vogel等人，2006年). IBM似乎被CJ从CM中分离出来，但蛋白质能够根据细胞的生理状态在IM的两个亚区之间动态重新分配(Vogel等人，2006年). 此外，CJ在凋亡过程中发生重塑；这被认为是为了释放晶内细胞色素池c（c）从而触发细胞程序性死亡(Scorrano等人，2002年;Cipolat等人，2006年;Frezza等人，2006年).

尽管线粒体的结构组织具有明显的重要性，但对嵴，尤其是CJ的形态和生物发生起作用的成分，基本上尚不清楚。二聚体特异性亚单位的缺失e（电子）（苏e（电子）)或Su克F的1F类O（运行）–ATP合成酶（F1F类O（运行）)导致该复合物的低聚化缺陷(Arnold等人，1998年)以及改变酵母中具有扩展的类离子结构的嵴形态(Paumard等人，2002年). 此外，据报道，CJ在凋亡过程中的重塑依赖于线粒体动力蛋白样蛋白OPA1(Frezza等人，2006年). 最近有人建议，通过控制OPA1的加工过程，禁止素在嵴形态发生中发挥作用(Merkwirth等人，2008年). 除了在IM融合中的作用外，OPA1的酵母同源物Mgm1被认为是嵴维持所必需的(Wong等人，2003年;Meeusen等人，2006年). 据报道，另一种用于确定人类细胞嵴形态的蛋白质是丝裂原。该蛋白的下调导致IM的大规模增殖，导致多层相互连接，并伴有CJ的消失(John等人，2005年). 丝裂霉素最初被命名为心肌蛋白，因为它在大鼠心脏组织中高度表达(Icho等人，1994年). 人类心脏线粒体的蛋白质组分析进一步表明，线粒体中这种蛋白质的丰度很高(Taylor等人，2003年). 丝裂原这个名字是因为它与成纤维细胞中的丝状线粒体共定位而产生的(Odgren等人，1996年).

总之，已知一些蛋白质会影响嵴形态，但到目前为止，还没有任何蛋白质被证明专门定位于CJ或是CJ蛋白复合物的一部分。在这项研究中，我们研究了控制酵母线粒体嵴和CJ结构的分子基础酿酒酵母我们描述了缺乏开放阅读框的酵母线粒体IM的超微结构改变AIM28系列(YKR016w/FMP13)具有迄今为止未知的功能。该基因最近被列为哺乳动物丝裂原蛋白的假定同源基因(Olichon等人，2006年). 我们提供了形态学和生物化学证据，证明该蛋白直接参与CJ的形成和分子结构，并在CJ处特异性富集。我们建议将其命名为Fcj1（CJ蛋白1的形成）。Fcj1调节F的低聚状态1F类O（运行）相反，CJ的形成和结构取决于F1F类O（运行）超复合体的形成本身。此外，苏e（电子）和Su克第页，共F页1F类O（运行）促进F的齐聚1F类O（运行）对于形成嵴、尖端或边缘的末端至关重要。F1F类O（运行）复合体被认为是确定嵴结构的关键元素(Paumard等人，2002年)这一建议基于其在线粒体IM中的高丰度。在本研究中，我们提出了一个工作模型，解释了Fcj1和F的拮抗作用对嵴结构的控制1F类O（运行）苏e（电子）和Su克关于F的低聚态1F类O（运行）.

结果

Fcj1缺失导致线粒体形态改变和线粒体DNA（mtDNA）部分丢失

在寻找影响线粒体结构的基因时，我们分析了一组在非发酵碳源上生长不足的酵母细胞，因为具有这种表型的突变体通常伴随着线粒体结构的改变。我们专注于编码到目前为止还没有指定功能的假定线粒体蛋白质的基因。通过罗丹明染色和基质靶向GFP表达检查可能的候选菌株的线粒体形态。我们发现了一个典型线粒体网络发生改变的突变FCJ1型(AIM28/FMP13/YKR016w)，观察到异常大的球形线粒体。这些细胞大多位于细胞外围，形成非典型网络(图1 A). 此外，线粒体偶尔出现中空。为了进一步表征，我们测定了rho的百分比0/ρ−细胞。根据细胞密度和所用的生长介质，突变细胞的该值在15%到40%之间变化。与野生型相比，这种细胞在状态III（+ADP）和状态IV（−ADP）下分离的线粒体的呼吸速率和最大解偶联速率降低了30%(表I). 与野生型相比，突变线粒体的膜电位Δψ也降低了，尽管程度较小(表I). 突变体中的呼吸控制比率（状态III/状态IV比率）没有改变，这表明呼吸链和ATP合成酶仍然是良好耦合的。考虑到所有这些观察结果，突变细胞中呼吸障碍的原因不是线粒体DNA的二次丢失，而是氧化磷酸化相关酶活性的主要缺乏。

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Fcj1是正常线粒体形态所必需的。（A） 野生型（WT）和Δfcj1表达线粒体靶向GFP的细胞生长在非发酵培养基上，并通过荧光显微镜观察。（B） Fcj1的结构域描述了线粒体靶向序列（MTS）、跨膜段（TM）、螺旋结构域和具有相应氨基酸残基位置的保守C末端结构域（CTD）。（C） 野生型细胞的亚细胞分离：线粒体（Mito）、微粒体（ER）和胞浆。用指示的标记蛋白Tim44（Mito）、Erp1（ER）和Hxk1（Cytosol）通过蛋白质印迹分析等量的蛋白质（50µg）。（D） Fcj1的线粒体下定位。低渗肿胀（SW）产生的野生型线粒体和有丝分裂体用Oxa1特异蛋白水解片段PK.f处理。（E） Fcj1的膜结合。用NaCl或碳酸钠提取野生型线粒体。用所示标记蛋白进行蛋白质印迹分析，加载膜结合（P）和可溶性（S）组分。DLD、，d日-乳酸脱氢酶。（F） Fcj1的同型相互作用。表达His标记（Fcj1-His）的细胞的线粒体6)或Fcj1的TAP标记变体（Fcj1-TAP）或两者均进行TAP亲和层析。用所示抗体进行Western blotting分析总（T；10%）、结合（B；100%）和未结合（UB；10%）材料。使用兔抗Tom40抗体同时检测Tom40和TAP标记的Fcj1。棒材，1µm。

表一。

野生型和Δfcj1细胞

分离线粒体的生物能量特性野生型Δfcj1
非耦合呼吸（nmol氧气/min/mg蛋白质）248.5 ± 41.27 (n个= 3)174.6 ± 30.9 (n个= 3)一
呼吸控制（状态III/状态IV）3.01 ± 0.23 (n个= 3)2.93 ± 0.09 (n个= 3)
膜电位ΔΨ（ΔF/F）0.285 ± 0.019 (n个= 3)0.221 ± 0.032 (n个= 3)b
ATP酶活性（nmol P我/分钟/毫克蛋白质）
 −寡霉素1,393 ± 231 (n个= 3)1,264 ± 121 (n个= 3)c（c）
 +寡霉素275 ± 93 (n个= 3)256 ± 102 (n个= 3)d日

F、 荧光。为了测量生物能量特性，在含有2%（vol/vol）乳酸的完整液体培养基上，从30°C下生长的细胞中分离出线粒体。平均值和标准偏差（±）n个给出了测量结果。

一70%的野生型。
b野生型占78%。
c（c）野生型91%。
d日93%为野生型。

Fcj1位于线粒体IM中，面对膜间隙，具有较大的亲水结构域

这个FCJ1型(AIM28/FMP13/YKR016w)该基因编码540个氨基酸残基的蛋白质。MitoProt II程序的电子分析(Claros和Vincens，1996年)线粒体靶向的可能性很高（0.9967），包括预测的线粒体加工肽酶在16和17位之间的裂解位点和线粒体中间肽酶在残基24和25之间的可能位点(图1 B). 此外，Fcj1包含一个预测的靠近N末端的单个跨膜片段。Fcj1与人丝裂原蛋白有13%的序列同源性，与小鼠丝裂原有12%的序列同源。在C末端，它包含一个相似性较高的短片段(图S1). 跨膜段的位置、螺旋结构域和保守的C末端结构域等结构特征表明Fcj1是丝裂原蛋白家族的成员。

亚细胞分离后，Fcj1在线粒体中完全恢复(图1 C). 用蛋白酶K（PK）孵育分离的线粒体不会导致Fcj1降解；然而，在选择性打开OM后，Fcj1降解(图1D). 用高盐或碳酸钠处理线粒体不会导致蛋白质的提取(图1 E). 为了测试Fcj1是否能形成寡聚体结构，我们用两种不同的C末端标记的Fcj1His-tagged（Fcj1-His6)和串联亲和纯化（TAP）标记变体（Fcj1-TAP）在酵母中共表达。在TAP亲和层析上，Fcj1-His6与Fcj1-TAP共纯化，表明Fcj1经历了同型相互作用(图1 F). Fcj1-His的亲和纯化12从Δfcj1+Fcj1-他的12Triton X-100中溶解的线粒体不会导致蛋白质的铜纯化，Fcj1-His除外12(图S2 A). Fcj1-His的尺寸12通过尺寸排阻色谱法（SEC）测定，Triton X-100溶解线粒体中的复合物为~180 kD。此外，该复合物在亲和纯化后保持其大小，这与稳定的同聚体复合物的形成一致（图S2 B）。大小表明为三聚体复合体；然而，二聚体或四聚体复合物似乎也是可能的。我们还分析了TAP后携带Fcj1-His的线粒体中Fcj1复合物的大小6和Fcj1-TAP。Fcj1-TAP的大小–Fcj1-他的6根据TAP标签或His标签的检测结果，复合物的分子量分别转移至～320 kD或～220 kD（图S2 C）。分子量的增加与含有20-kD TAP标签的Fcj1的一个或多个亚基的存在一致，进一步加强了同源低聚体Fcjl复合物的观点。总之，Fcj1是一种参与同型相互作用的蛋白质，锚定在线粒体IM上，其主要部分暴露在膜间空间。

Fcj1在CJ富集

我们使用定量免疫电镜测定了Fcj1在IM各亚结构域上的分布。化学固定野生型细胞的冷冻切片用抗Fcjl抗体进行免疫修饰，并用免疫金显示。使用低浓度抗体来保持低水平的非特异性免疫修饰。Fcj1抗体的特异性通过蛋白质印迹以及野生型和Δfcj1单元格(图S3、A和B). 如前所述，大量野生型细胞切片中的金颗粒被投影到模型上(Vogel等人，2006年)，代表OM、IBM、CM和CJ(图2，A和B). Fcj1最显著地聚集在CJ附近(图2，A和B)到目前为止，该区域的许多其他线粒体蛋白质的密度都很低（相比之下，请参见Vogel等人[2006]). 在靠近CJ区域的CM中观察到一个几乎缺乏金颗粒的区域(图2 B). 这个颈状区域代表CM的狭窄管状部分，显示出相对较高的正膜曲率。此处的曲率与CJ底部的曲率相反。Fcj1在CM的其余部分（包括嵴尖端）和远离CJ区域的IBM中都有一定程度的存在。嵴尖端是指线粒体切片的电子显微照片中出现的嵴尖端。根据断面，它们代表了片状CM板的高度正弯曲边缘。为了定量评估这些发现，从底部开始沿模型IM移动滑动窗口，仅计算距离IM 14nm以内的金粒子(图2、C和D). 这是对Fcj1和Cox2（细胞色素的一个亚单位）进行的对照c（c）氧化酶和苏氨酸e（电子）和Su克第页，共F页1F类O（运行）(图2、C和D; Cox2和Su的原始数据e（电子）和Su克被从Vogel等人[2006]). 使用Fcj1，在与CJ相对应的区域观察到最多的金粒子(图2、C和D，灰色框）。代表Cox2的金颗粒的数量在CJ和IBM区域非常低，在CM区域增加(图2 C;Vogel等人，2006年). 苏e（电子）和Su克第页，共F页1F类O（运行）未在CJ区富集，而是在嵴尖端富集(图2 D). 总的来说，Fcj1在CJ的富集是独特的，之前分析的任何蛋白质都没有观察到(图2、C和D;Vogel等人，2006年). 在嵴的平面部分，Fcj1的含量较低，其中Su的水平e（电子）和Su克也是中间的，可以反映这些区域的功能平衡；在某种程度上，它们也可能是由弯曲嵴的拓扑复杂性引起的，可能在较小程度上是由背景信号引起的。总之，我们的数据表明，Fcj1是迄今为止发现的唯一一种在CJ中特异性富集的蛋白质，在CJ的位置，Su的含量e（电子）和Su克相对较低。

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Fcj1在CJ富集。（A） 野生型细胞中Fcj1的免疫金标记。（B） 在CM、IBM和OM模型上绘制Fcj1免疫金标记后的金粒子表示(Vogel等人，2006年). （C和D）IM中蛋白质密度的量化。通过在模型中沿IM自下而上移动硅胶滑动窗口（来自C和来自Vogel等人[2006]). 灰色方框表示CJ区域。Fcj1、Cox2（C）和Su的蛋白质密度克和Sue（电子）（D） 如图所示。棒材，100 nm。

Fcj1缺失导致CJ丢失和嵴形态改变

通过EM和层析重建技术研究了线粒体IMs的形态，并利用德意志方法制备了酵母细胞切片(德意志，1989年). 在野生型细胞中，线粒体显示出大量的CJ，IM和OM通常在CJ的底部非常接近(图3，A和B;表二; 和视频1). 在Δfcj1细胞、线粒体增大，含有大量内嵴，无明显CJ(图3、C和D;表二; 和视频2). 这些CM主要排列为平行、同心、堆叠的囊泡结构。囊泡结构的管腔被确定为窦内空间（图S3 C）。在另一种方法中，对快速冷冻的水合球形酵母细胞进行冷冻切片和冷冻电镜断层扫描。此外，通过冷冻电镜断层扫描分析了分离的线粒体。这两种程序都导致野生型细胞中CJ的高分辨率结构(图4，A和B;图S4，A–C; 和视频3)并透露了CJ在Δfcj1线粒体(图4 C，图S4 D，和视频4).

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嵴形态改变，缺乏Fcj1的细胞中没有CJ。化学固定酵母细胞的（A–D）EM层析图。（A） 野生型细胞中线粒体的单层层析图。（B） A.（C）的表面透视图Δfcj1单元格。（D） C的表面重渲染视图。显示OM（蓝色）和IM（黄色）。WT，野生型。棒材，100 nm。

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Δfcj1线粒体包含典型的F低聚物拉链状结构1F类O（运行）–ATP合成酶。分离线粒体的冷冻电镜层析图。（A）对玻璃化野生型线粒体的层析图进行切片。（B） 图中显示了与A中的方框区域相对应的CJ放大（左）和表面渲染（右）。面板A和B重印自Zick等人（2009年）获得的许可生物化学与生物物理学报（C–G）Δfcj1线粒体。（C）玻化切片Δfcj1线粒体。（D） C中方框区域的放大图（左）和表面渲染图（右）显示了具有F特征的拉链状规则排列1F的零件1F类O（运行）–ATP合成酶。IM显示为黄色，F1F类O（运行）–ATP合酶显示为红色。（E）10 nm厚的断层图像切片，穿过典型的F1F的零件1F类O（运行）–侧视图（箭头）和顶视图（方框区域）中的ATP合成酶。（F和G）通过断层扫描图的截面图和假定F的体积投影俯视图1F类O（运行）–显示了排列在双排六角条纹（F）和双排方形条纹（G）中的ATP合成酶。棒材：（A–C和E）100 nm；（D、F和G）50纳米。

表二：。

Fcj1，Su缺失后IM组织紊乱细胞的电镜分析e（电子），或Su克

应变线粒体切片数量CJ数量每个线粒体部分的CJ数量连接到一个或多个CJ的CJ的百分比嵴尖端数量每个线粒体切片的嵴尖端数
重量651201.802453.8
Δfcj1750007319.7
Δsue581702.984.1120.2
Δsug641632.581100.2

WT，野生型。在含有2%（vol/vol）乳酸的完整液体培养基上，在30°C下生长的指示菌株的化学固定全细胞的电子显微照片中，测定了每个线粒体切片的CJ和嵴尖端的数量。

线粒体中相邻CMs之间的狭窄基质空间Δfcj1细胞中含有大小和形状均匀的颗粒，这些颗粒排列成拉链状(图4，D–G; 和视频4以及5). 俯视图显示了这些复合体的分布和组织形式，如短线状集合体或两条平行线，呈方形或六角形排列(图4，D–G). 这些结构的尺寸和相对距离与F的尺寸和距离非常吻合1F的一部分1F类O（运行）–ATP合成酶（～10×10×10 nm）。这些高度丰富的结构被认为是F的二聚体或低聚物1F类O（运行）在许多其他研究中(Allen等人，1989年;Dudkina等人，2005年,2006;Minauro-Sanmiguel等人，2005年;Buzhynsky等人，2007年;施特劳斯等人，2008年).

进一步证明拉链状结构代表F的低聚物1F类O（运行），我们删除了Sue（电子）或Su克第页，共F页1F类O（运行）已知这些亚基的丢失会损害F的二聚/齐聚1F类O（运行）(Arnold等人，1998年). 确实，在Δfcj1/Δsug(图5 A)也不在Δfcj1/Δsue线粒体（未示出）是假定的以拉链状方式排列的F1颗粒。相反，它们在IM上随机分布，这与观察到的情况相反Δfcj1线粒体的比较(图5 B). 通过测定一大组粒子与其各自最近邻居之间的距离，证实了这一点。在Δfcj1线粒体，绝大多数观察到的距离在14-16nm之间，而在Δfcj1/Δsug，检测到一个具有广泛距离的明显随机分布(图5 C). 因此Δfcj1线粒体确实代表F的低聚物1F类O（运行）可以通过删除Su来中断e（电子）或Su克第页，共F页1F类O（运行）.

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观察到的拉链状结构Δfcj1线粒体依赖于二聚体特异性Su的存在e（电子）和Su克第页，共F页1F类O（运行）–ATP合成酶。所示菌株分离线粒体的冷冻电镜层析图。（A） 推定F的俯视图1F类O（运行）–ATP合成酶Δfcj1/Δsug线粒体（左）和表面呈现的表现（右）如图所示。（B） 推定F的俯视图1F类O（运行）–ATP合成酶Δfcj1线粒体（左侧；放大后的框状区域图4 E)图中显示了表面渲染表示（右）。（C） F的频率分布1–F1距离。F的中心到中心的距离1对所示菌株的分离线粒体进行低温电子显微镜断层扫描，确定其最近邻的粒子(n个=102（对于两个菌株）。棒材，50 nm。

在完整的野生型线粒体中，F1F类O（运行）在本研究和其他研究中均未观察到超复合物，这可能是由于基质的高蛋白密度和缺乏对比所致(Nicastro等人，2000年). 缺乏Fcj1的线粒体体积增加(表S1)可能导致基质中蛋白质密度降低，从而促进F超分子组织的可视化1F类O（运行）在完整的线粒体中。只有野生型酵母的线粒体膜片段中，之前观察到这种复合物的寡聚体排列(Buzhynskyy等人，2007年;施特劳斯等人，2008年). 总的来说，Fcj1的缺乏一方面与CJ的缺乏有关，另一方面与F的大蛋白复合物的规则排列的出现有关1F类O（运行）超级复杂。

Fcj1在确定CJ的数量和架构方面起着直接作用

为了进一步研究Fcj1在CJ形成中的作用，我们使用了Fcjl的过表达和下调。Fcj1在多西环素可抑制启动子的控制下从野生型酵母细胞中的质粒中表达。还分析了含有空质粒的野生型细胞。Fcj1过表达5到10倍后，每个细胞的CJ数量比对照细胞增加了2到3倍。在野生型细胞中很少观察到嵴的分支，在过度表达Fcj1的细胞中增加了约17倍(图6 A). 此外，当Fcj1过度表达时，CJs的直径出现增大并显示出更高的变异(图6，A和B). 因此，Fcj1过度表达促进了额外CJ的形成并改变了CJ的分子结构。

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Fcj1直接参与确定CJ的数量和架构。（A） 过表达Fcj1的化学固定细胞切片中线粒体的电子显微照片。（B） 含空pCM189质粒的野生型（WT）对照菌株（W303）CJs直径分布(n个=21）和含有pCM189-Fcj1质粒（Fcj1↑；n个= 40). 细胞生长在不可发酵的选择性最低培养基上。绘制了两个菌株在指定范围内直径数的直方图。（C和D）Fcj1在Δfcj1添加强力霉素后不同时间携带pCM189-Fcj1的菌株。使用B中的野生型控制。（C） 通过Western blot分析监测Fcj1的表达水平。（D） Fcj1下调的表型分析。每个线粒体切片的CJ和分支数量（m0小时= 26; 米13.5小时= 69; 米23小时= 49; 米37.5小时= 66; 米47.5小时=57）是在指示的下调时间段（m=线粒体切片数）后，通过化学固定的整个细胞的电子显微照片确定的。Fcj1（0 h）下调前，每个线粒体切片的CJ和嵴分枝数定义为100%。rho的数量0/ρ−细胞和包含嵴堆积的细胞与每个时间点的总细胞数有关。

Fcj1的下调导致CJ和嵴分枝的数量逐渐减少(图6、C和D). 这些嵴形态的改变在早期时间点（13.5和23小时）已经发生。具有以下特征的线粒体Δfcj1在随后的时间点（37.5和47.5小时）出现IM连续同心堆积的表型。CJ的不完全消失归因于Fcj1的不完全下调(图6 C). rho的形成0/ρ−在实验过程中没有观察到细胞，排除了我们的观察是由线粒体DNA二次丢失引起的可能性。总之，这些观察结果强烈表明Fcj1直接参与CJ的形成。

未更改的Su级别e（电子）或Su克F的1F类O（运行）–ATP合成酶Δfcj1细胞

缺乏Su的突变株e（电子）或Su克F的1F类O（运行）–据报道，ATP合成酶改变了嵴形态(Paumard等人，2002年). 因此，我们询问Su的蛋白质水平e（电子）或Su克在中被更改Δfcj1细胞以及Fcj1水平是否在Δsue或Δsug细胞。在没有Fcj1的情况下，类似水平的Sue（电子）或Su克已观察到(图7 A). 因此，在Δfcj1突变细胞不是由苏氨酸水平的变化引起的e（电子）或Su克同样，Fcj1水平在Δsue和Δsug突变体细胞，表明Fcj1与这些突变体所描述的嵴形态改变无关(Paumard等人，2002年). 此外，Fcj1的缺失对参与线粒体功能（如线粒体蛋白导入、线粒体融合和裂变机制以及氧化磷酸化）的几个核和线粒体编码蛋白的水平没有影响(图7 A). 值得注意的是，参与确定线粒体形态的蛋白质水平，如Mgm1、Fzo1、Fis1和Dnm1，没有受到影响。与此一致，线粒体Δfcj1细胞形成一个管状的，尽管改变了的网络。短亚型Mgm1（s-Mgm1）的形成也没有受到影响。这进一步支持了我们的结论，即线粒体能量生产和蛋白质输入在缺乏Fcj1的细胞中起作用，因为这两个过程都是s-Mgm1形成所必需的(Herlan等人，2004年).

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Fcj1降低了F的稳定性1F类O（运行）–ATP合成酶低聚物。（A） 野生型（WT）中的蛋白质水平，Δfcj1， Δsue、和Δsug线粒体。将等分样品进行SDS-PAGE，并用所示抗体进行修饰。（B） F的溶解度1F类O（运行）–洗涤剂中的ATP合成酶。Fcj1-过表达（Fcj1↑）、野生型和Δfcj1将菌株溶解在洋地黄素中并离心以获得上清液（S1）和沉淀（P1）级分。用Triton X-100处理未溶解材料（P1）并离心，以获得上清液（S2）和颗粒（P2）组分。用所示抗体通过Western blotting分析等分样品。（C） BN-PAGE分析。野生型，Δfcj1和Fcj1-过度表达的线粒体（400µg）以指示的洋地黄苷元/蛋白质比率（Dig/Prot；wt/wt）溶解，并进行BN-PAGE和F凝胶分析1F类O（运行）–ATP酶活性。所有通道都来自相同图像设置下的单个凝胶，但通道8和通道9是按照适当的顺序剪切和粘贴的，以保持清晰。（D） SEC.野生型，Δfcj1和Fcj1-过表达线粒体以1（wt/wt）的洋地黄苷/蛋白质比率溶解，并通过Superose 6凝胶过滤色谱进行分离，通过Western blotting分析等分样品。F的低聚物形式1F类O（运行）–ATP合成酶（O，低聚物；T，四聚物；D，二聚体；M，单体）表示为尺寸标记。

Fcj1破坏F的齐聚1F类O（运行）–ATP合成酶

鉴于F的拉链式布置1中的粒子Δfcj1线粒体，我们问Fcj1是否影响F的齐聚1F类O（运行）首先，我们确定F的增溶1F类O（运行）使用温和的清洁剂取决于Fcj1的水平。用洋地黄素溶解从野生型细胞、过表达Fcj1的细胞和缺乏Fcjl的细胞中分离的线粒体。非溶解F的比例1F类O（运行）–ATP合成酶亚基（F1β和Atp4）在缺乏Fcj1的线粒体中最高，在野生型中较低，在过度表达Fcj2的细胞中最低(图7 B). 其他IM蛋白如Dld1和Aac2的增溶没有显示出对Fcj1水平的这种依赖性。F的非溶解部分1F类O（运行）–ATP合成酶随后可以用Triton X-100溶解。显然，F1F类O（运行）在缺乏Fcj1的线粒体中形成不太容易被洋地黄素解离的高分子量复合物。

然后我们研究了F的超分子结构1F类O（运行）通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）和凝胶内显示其ATP酶活性。F的单体、二聚体和假定四聚体的形成1F类O（运行）在所有菌株的线粒体中都观察到(图7 C). 在中观察到高阶低聚物Δfcj1线粒体即使在高洋地黄素浓度下，也只在野生型线粒体中的极低浓度下存在，而在Fcj1过度表达时则不存在。这些F的高分子量配合物1F类O（运行）代表可溶性部分的一个小亚群。当Fcj1缺乏时，即使在高洋地黄素与蛋白质比率下，它们也非常稳定，而当Fcj1存在时，它们则不稳定。Fcj1的过度表达显著削弱了这些高级低聚物的形成，也减少了四聚体的数量(图7 C和图S5A). 二聚体和单体的数量没有显著影响。同样，F的高级低聚物的丰度1F类O（运行）SEC确定的时间取决于Fcj1的存在(图7 D). 大部分Fcj1在对应于F低聚物更高形式的组分中回收1F类O（运行）（>2 MD），表明Fcj1存在于高分子量复合物中。因此，F的大小1F类O（运行）与Triton X-100增溶相比，用洋地黄素增溶的低聚物要大得多（图S2）。总的来说，包括生化数据和EM断层扫描在内的各种证据表明，Fcj1影响F的稳定性1F类O（运行）低聚物以不利的方式存在，但显然不会影响该复合物的二聚体。

Fcj1对苏采取敌对行动e（电子）和Su克F的1F类O（运行）–ATP合成酶

Fcj1对F低聚物形式稳定性的观察效果1F类O（运行）提示了这些蛋白质之间的功能联系。苏e（电子）和Su克已知F的二聚/齐聚需要1F类O（运行）正常嵴形态需要。为了确定这些亚基和Fcj1之间是否存在遗传相互作用，我们确定了每个单个和相应的双缺失菌株在不可发酵碳源上的加倍时间。缺乏Fcj1的菌株在非发酵碳源上生长受损最严重，与野生型相比，其加倍时间延长了约1.75倍(图8 A). 附加删除任一Sue（电子）或Su克第页，共页1F类O（运行）有效抑制了Δfcj1应变。这些双缺失菌株的加倍时间明显短于Δfcj1应变。滴稀释生长试验进一步证实了这一点(图8 B). 总之，这些数据证明了Fcj1与Su的遗传相互作用e（电子）/苏克第页，共F页1F类O（运行）将所有蛋白质置于同一路径中。后一亚单位促进F的组装1F类O（运行）–ATP合成酶低聚物，而Fcj1具有相反的作用。在双缺失菌株中(Δfcj1/Δsue和Δfcj1/Δsug)，F的形成1F类O（运行）–未观察到ATP合成酶低聚物（图S5 B）。二聚体的存在程度很低，类似于Su的单缺失表型e（电子）或Su克这与二聚体是F齐聚的构建块的观点一致1F类O（运行），如前所述(Paumard等人，2002年;Wittig等人，2008年). 总的来说，Fcj1在功能上与Su交互e（电子）和Su克在对抗模式下，这似乎对CJ的形成至关重要。

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Fcj1和F之间的功能链接1F类O（运行）–ATP合成酶。（A和B）Fcj1与Su的遗传互作e（电子）和Su克（A）指示菌株（BY4742）在30°C下指数生长期间在完全液体乳酸培养基中生长的产生时间(n个= 4). 误差条显示标准偏差。根据吨指示测试。（B） 通过在可发酵（酵母蛋白胨葡萄糖[YPD]）和呼吸（乳酸培养基[YLac]）碳源上以1:10的步骤滴稀释测试指示菌株的生长。（C和D）化学固定的线粒体的电子显微照片Δsug（C） 和Δsue（D） 单元格。分支用箭头表示。所示方框的放大显示为野生型（WT；m=40）线粒体切片电子显微照片中CJ的C（E）直径的插图，以及Δsue菌株（m=40；m=线粒体切片数量）。显示了所示范围内观察到的直径数量的柱状图。棒材，100 nm。

删除Sue（电子）和Su克导致线粒体IM结构的改变

关联F的低聚物状态1F类O（运行）对于嵴的结构，我们测定了Su缺失突变体中嵴尖端的数量和CJ的数量e（电子）和Su克并将其与野生型和Δfcj1细胞。线粒体每段的嵴尖端在Δfcj1与野生型相比的单元格(表二).

缺乏Su菌株的线粒体e（电子）或Su克据报道含有类离子结构和扩展的CM(Paumard等人，2002年)但尚未调查CJ的形成是否受到影响。因此，我们对这些菌株中的CJ进行了定量分析。除了类离子结构外，我们在这些菌株中观察到CJ，与相应野生型相比，每个线粒体片段中的CJ数量略有增加(表二). 因此，苏e（电子）和Su克对CJ的形成并不重要。然而，CJ通常成对出现，并通过穿过线粒体部分的CM连接，这是野生型中很少观察到的结构(图8、C和D; 和表二). 根据这一观察结果，在Δsue和Δsug线粒体极低，比野生型低约20倍(表二). 此外，在27%和9%的线粒体切片中发现了嵴的分支Δsue和Δsug菌株，但不在相应野生型菌株的部分中(图8、C和D). 此外，CJ的平均直径Δsue和Δsug尽管与Fcj1过度表达的细胞相比，细胞数量有所增加，但变化幅度较小(图8E且未描述）。与野生型对照组相比，野生型细胞的平均CJ直径稍低，如图6 B我们将其归因于不同的生长培养基（选择性最小培养基vs.完全培养基）和菌株背景（W303 vs.BY4742；表S2). 我们还研究了双缺失菌株线粒体的超微结构Δfcj1/Δsue和Δfcj1/Δsug这些线粒体的特征是存在内部的、同心的或囊泡状的CM，实际上没有CJ（图S5、C和D）。总之，苏e（电子）和Su克一方面促进嵴尖端的形成，另一方面Fcj1对CJ的形成是必要的。这两种线粒体膜蛋白调节F的寡聚状态1F类O（运行）以对抗的方式。这表明嵴的结构及其嵴末端的元素、与IBM的连接，也许还有嵴片的平面排列都受这两种拮抗蛋白的局部浓度控制。

讨论

这项研究解决了线粒体嵴复杂结构是如何在分子基础上确定的问题。在这项研究中，我们报道了与F1F类O（运行）–ATP合成酶，决定嵴结构。IM蛋白Fcj1在CJ和嵴形状的形成中起重要作用。苏e（电子）和Su克第页，共F页1F类O（运行）其耗竭之前被证明会导致类洋葱嵴(Paumard等人，2002年)对嵴结构有影响，这与Fcj1相反。我们根据本研究中讨论的结果，提出了这些成分如何决定嵴各部分结构的模型(图9，A和B).

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线粒体嵴和CJ形成的工作模式。（A） CM不同区域的膜曲率以及Fcj1和Su的亚软骨定位示意图e（电子）和Su克在野生型线粒体中。阳性膜弯曲用蓝色表示，阴性弯曲用红色表示，两种或无明显弯曲的区域用紫色表示。侧视图（左侧）或旋转90°后的横截面（中间）显示了带有一个CJ的代表性嵴板的概览。3D视图中方框区域的放大显示了Fcj1，Su的拟议布置e（电子）/苏克F的、和1F类O（运行）CM的各个区域及其对膜曲率的影响。（B） 在所示突变线粒体中观察到的CM结构中膜曲率的示意图。当Fcj1耗尽时，CM的正曲率占主导地位，而需要膜负弯曲的膜结构则不存在。苏的缺乏e（电子）/苏克导致阳性膜曲率明显降低，导致CJ直径增大，嵴分支，表观嵴尖端数量显著减少。Fcj1水平增加产生类似的表型。然而，此突变体不影响嵴尖端的形成。ICS，晶内间隙；M、 矩阵空间。

Fcj1通过单个N端跨膜片段锚定在IM上，将蛋白质的主要部分暴露在膜间隙中。它经历了同型相互作用，每个细胞中估计有5730个分子，数量相当丰富(Ghaemaghami等人，2003年). 然而，它远没有IM的主要成分F丰富1F类O（运行）–F1α和F1β亚基的ATP合成酶估计分子数分别为41500和164000(Ghaemaghami等人，2003年). 哺乳动物蛋白丝裂原与Fcj1的序列相似性很低；然而，根据其耗竭表型，它很可能代表一个直系血统(John等人，2005年). Fcj1在CJ的底部存在较高水平，但也存在于嵴的其他部分，尽管程度较小。删除Fcj1会导致CJ流失。过度表达导致CJ数量增加和嵴内部分支，表明Fcj1在连接形成中起直接作用。Fcj1对F的低聚物状态有调节作用1F类O（运行）.Fcj1的删除导致F水平的增加1F类O（运行）超级复杂。这种影响在缺乏Fcj1的线粒体的形态学分析中也很明显。Cryo-EM揭示了广泛F的形成1F类O（运行）该菌株嵴间基质空间的超复杂结构。与这些观察结果一致，Fcj1的过度表达导致F水平的降低1F类O（运行）超复数。

操纵F的级别1F类O（运行）苏e（电子）和Su克产生了同样有趣的结果。如前所述，这些亚基的缺失导致同心嵴结构的积累(Paumard等人，2002年). 删除任一Sue（电子）或Su克据报道强烈支持F的离解1F类O（运行）变成单体(Arnold等人，1998年). 值得注意的是，这对ATP合成酶的酶活性没有影响。在这项研究中，我们发现这些线粒体含有CJ，但实际上没有嵴尖端。这与桥接嵴的数量大幅增加同时发生，桥接嵴延伸到线粒体的整个部分，在CJs的两侧终止。此外，在这些线粒体中观察到嵴的分支，与Fcj1过度表达的细胞很相似。因此，嵴的分支可能代表出现在嵴平面区域内的内部CJ，该区域通常不存在CJ。

总之，我们的数据显示了Fcj1相对于F的相反函数1F类O（运行）苏e（电子）和Su克Fcj1显然对CJ的形成至关重要，而嵴尖端的形成需要Sue（电子）和Su克这与定量免疫金标记显示的IM相应区域内这些成分的特异性富集相一致。似乎是它们的相对分布决定了线粒体的嵴结构。

基于我们的结果，我们提出了一个关于CJ和嵴尖端生成的分子基础的工作假设。在大多数物种和器官的线粒体中，可以区分以下结构元素(图9、A和B). 嵴片由两片紧密并列的IM叶组成，在两者之间留下一个狭窄的膜间空间。这些薄片由尖端或边缘划分，其中脂质双层弯曲，显示出强烈的正曲率。在它们的底部，嵴与IBM相连，后者形成了一种与OM紧密相连的第二层封套。这些连接，即CJ，具有相当复杂的3D架构。在它们通向IBM的底部，膜呈现负曲率。随后是一个狭窄的管状颈部区域，具有高度正曲率。这种结构扩大到嵴的平面，嵴是一个同时存在负曲率和正曲率的区域。

根据我们的模型，Fcj1直接或间接干扰高级低聚物的形成，从而有利于负膜弯曲。通过这种机制，Fcj1的存在影响CJ基地的建设。然而，在F低聚物形式更高的形成区域1F类O（运行）在不受干扰的情况下，这些低聚物在膜上施加正曲率，从而有利于嵴尖端的形成。F的想法1F类O（运行）最近的一项研究也提出了向IM引入正曲率并导致尖端形成的低聚物(施特劳斯等人，2008年). 我们的研究结果将这种影响归因于苏的作用e（电子）和Su克如我们在本研究中所示，它们都在边缘区域富集，它们的缺失导致嵴尖端的缺失。然而，它们在CJ中的丰度较低，支持负曲率。有趣的是，Fcj1在嵴颈中的含量非常低，嵴颈是连接CJ基底和嵴片的IM区域。这种膜具有极高的正曲率。因此，我们建议Fcj1与Su的比值e（电子）/苏克在形成嵴方面起决定性作用。脊片似乎含有Fcj1和Sue（电子）/苏克，这可能决定了它们的平面形状。这些拮抗成分的平衡分布对于嵴的动力学和裂变/融合也可能是必要的。先前提出了嵴的动态性质（有关审查，请参阅Mannella等人，2001年;曼内拉，2006年b)基于对分离线粒体的EM断层扫描研究表明，嵴形态在各种生理条件下明显发生可逆变化（有关综述，请参阅Mannella等人，2001年;曼内拉，2006年b;Zick等人，2009年).

总之，我们的假设可以解释本研究和其他研究中的所有发现(Paumard等人，2002年;施特劳斯等人，2008年). 但不排除其他成分，如禁令或OPA1或其他尚未确定的成分也有助于CJ和嵴尖端的形成（有关审查，请参阅Merkwirth和Langer，2009年;Zick等人，2009年). 此外，它还提出了几个有趣的问题，例如Fcj1是如何被招募到CJ基地的。Fcj1本身或可能的反应伙伴可能会与OM交互，从而将CJ锚定到OM。特别有趣的是Fcjl和Su的物理细节e（电子）/苏克与F的相互作用1F类O（运行）以及这些相互作用如何调节膜的曲率。最后，一个有趣的方面是，当CJ缺乏时嵴堆积是如何形成的，以及在这种情况下CM中蛋白质导入和复杂组装是如何发生的。一种可能是嵴与IBM之间存在快速融合/裂变机制。这些连接的寿命可能太短，EM无法看到，但足以扩散新插入的蛋白质和脂质。其他几种解释似乎同样可行。无论如何，研究线粒体如何在CJ完全缺失的情况下存活下来，并保持线粒体功能和遗传，将是一个巨大的挑战。

材料和方法

菌株和生长条件

使用的菌株和质粒列于表S2和第3章.使用标准方法培养酵母菌株(Sherman等人，1986年)30°C，在含有2%（vol/vol）乳酸的完整液体培养基上。含有质粒的菌株（表S2）在含有2%（vol/vol）乳酸和0.1%（wt/vol）葡萄糖的选择性液体培养基上生长。对于Fcj1的过度表达，野生型和Δfcj1含有质粒pCM189-Fcj1的菌株在没有强力霉素的情况下生长。为了下调Fcj1，在Δfcj1菌株，并向培养基中添加20µg/ml强力霉素。采用1:10稀释步骤进行滴稀释生长试验，并在24°C的酵母蛋白胨葡萄糖和乳酸培养基平板上培养2-4天。罗0/ρ−细胞形成是在添加0.1%（wt/vol）葡萄糖的完全甘油板上测定的。

酵母细胞的分级

如前所述，通过碱解制备酵母总细胞提取物(Herlan等人，2003年). 如前所述，对酵母细胞进行细胞亚分馏(Rowley等人，1994年). 为了提取外周结合膜蛋白，将10 mg/ml线粒体在20 mM Hepes/KOH中稀释至最终浓度1 mg/ml，pH 7.4。添加等量新制备的0.2 M碳酸钠溶液或2 M氯化钠溶液后，将样品在4°C下培养30分钟，并在92000下离心克在4°C下保持30分钟。用SDS-PAGE和免疫印迹法分析等比例的膜相关蛋白和可溶性蛋白。酵母细胞的球形成形、线粒体的制备、有丝分裂体的产生和PK处理均按照标准程序进行(Sirrenberg等人，1996年).

重组技术

酵母菌株Δfcj1（W303背景）通过整合质粒pFA6aHIS3Mx6合成的PCR产物获得(Wach等人，1997年)使用引物Fcj1-HIS3上游和Fcj1-HIS3反向。使用上游引物Fcj1和下游引物Fc j1通过PCR验证Fcjl的缺失。pCM189-Fcj1通过扩增产生Fcj1公司（YKR016w）通过PCR从酵母基因组DNA使用火球菌属聚合酶（安捷伦科技）和Fcj1正向和过度表达Fcj1reverse引物(表S4)并使用BamHI–NotI限制位点克隆到pCM189酵母过表达载体中。对于pYX242–Fcj1-His这一代6或pYX242–Fcj1-His12，引物Fcj1上游和Fcj1-His6反向或Fcj1上游和Fcj1-His12分别使用反向，并使用BamHI–XhoI限制性位点将PCR产物克隆到pYX242中。将构建物或空质粒（表S3）转化为野生型或Δfcj1使所有菌株在同一选择性培养基中生长。

抗体生产

在兔子体内培养针对Fcj1的抗血清，抗血清针对Fcj 1的214–226个氨基酸残基（CNTQYENSKREFEKN）与激活卵清蛋白（Pineda Antikörperservice）偶联的合成肽。

蛋白质纯化

利用TAP纯化蛋白质是根据先前的研究改编而来的(Puig等人，2001年). 简言之，25µl IgG Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare）珠浆用TBS洗涤三次，一次用0.1 M Gly洗涤，pH值2.5，再次用TBS冲洗三次，另一次用溶解缓冲液（10 mM Tris/HCl，pH值8.0，150 mM NaCl，1%[vol/vol]Triton X-100，蛋白酶抑制剂[完全蛋白酶抑制剂混合物；罗氏]），5 mM EDTA，1 mM PMSF、0.5 mM 1,10-菲罗啉、2µg/ml抑肽酶和1µg/ml胃蛋白酶抑制素。将1 mg分离的线粒体（Fcj1-TAP、Fcj1-His或Fcjl-TAP–Fcj1-His；表S2）在100µl溶解缓冲液中的冰上溶解30 min。样品在57000下离心20分钟克将上清液加载到制备的IgG Sepharose珠上。在4°C下培养1 h后，用含有0.1%（vol/vol）Triton X-100的增溶缓冲液清洗珠子，并用2×Laemmli样品缓冲液在95°C下洗脱结合蛋白3 min，并用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。

如前所述，通过镍-硝基三乙酸结合His标记蛋白进行纯化(Mokranjac等人，2005年). 简言之，从表达标记版本Fcj1（Fcj1-His）的细胞中制备3 mg线粒体12，Fcj1-TAP–Fcj1-他的6或Fcj1全长作为控件；表S2）在不含EDTA的含5 mM咪唑的冰上在增溶缓冲液中溶解30分钟。旋转澄清后，将上清液与30µl洗涤过的镍-硝基三乙酸珠浆（EMD）在4°C下培养1 h。用含有0.1%（vol/vol）Triton X-100和30 mM咪唑的增溶缓冲液清洗珠子。结合蛋白在95℃下用Laemmli样品缓冲液洗脱，或在4℃下用300 mM咪唑洗脱，具体取决于样品的后续处理。结合材料通过考马斯染色或SEC进行分析。

线粒体生物能量参数分析

野生型和Δfcj1细胞生长在不可发酵的碳源上（参见菌株和生长条件），分离线粒体的氧化磷酸化酶活性基本上如前所述进行了测定(Velours等人，2001年). 氧气消耗率用氧气记录仪（Hansatech仪器）测量，并用Oxyg32 2.25版软件（Hansatech仪器）进行分析。将500µg新鲜分离的线粒体重新悬浮在2 ml呼吸缓冲液中（250 mM蔗糖、5 mM KPi、pH 7.4、1 mM EDTA、6 mM MgCl2和20 mM Hepes/KOH，pH 7.4）。添加4 mM NADH后，测量IV状态呼吸。进一步添加200µM ADP可以测定状态III呼吸。为了将呼吸与ATP合成分离，添加了3µM羰基氰化物间氯苯腙，使呼吸速率达到最大。如前所述，在添加或不添加最终浓度为10µg/ml的寡霉素的情况下测量ATP酶活性(Velours等人，2001年). 如前所述，通过测量罗丹明123的荧光猝灭来评估膜电位（Δψ）(Emaus等人，1986年).

低聚物F的分析1F类O（运行）–ATP合酶复合物

测定F的溶解度1F类O（运行）将分离的线粒体在冰上培养30分钟，培养液中的洋地黄素/蛋白质（wt/wt）比率为1（150 mM NaCl、20 mM Tris/HCl、pH 8、5 mM EDTA、1 mM PMSF、完整蛋白酶抑制剂混合物、0.5 mM 1,10-菲罗啉、100µg/mlα-巨球蛋白、2µg/ml抑肽酶和1µg/mI胃蛋白酶抑制素）。在13000℃下4°C离心10分钟后克，用1%（vol/vol）Triton X-100重新溶解非溶解材料。

秒

将分离的线粒体以1（wt/wt）的洋地黄素/蛋白质比率或30 mM Hepes/HCl、pH 7.4和150 mM醋酸钾（包括蛋白酶抑制剂）中0.5的Triton X-100/蛋白质比率在冰上溶解30分钟，如前一节所示，并在13000℃下离心10分钟克在将清除的裂解液装入Superose 6大小的排除柱之前（GE Healthcare；Meier等人，2005年).

BN–页码

将500µg线粒体在50µl洋地黄素缓冲液（30mM Hepes/HCl，pH 7.4，150mM乙酸钾，10%甘油，1mM EDTA，2mMϵ-氨基己酸和1 mM PMSF），以指示的洋地黄素/蛋白质比率（wt/wt），并在4°C和57000下离心20分钟克基本上如前所述，通过BN-PAGE和凝胶内ATP酶活性对上清液进行分析(Schager，2001年;Bornhövd等人，2006年).

荧光显微镜

为了显示线粒体，酵母菌株被质粒pVT100U转化为表达线粒体基质靶向GFP的线粒体GFP(Westermann和Neupert，2000年)生长在缺乏亮氨酸的选择性乳酸培养基上。使用共焦显微镜（LSM 510；卡尔蔡司公司）拍摄共焦图像，该显微镜配备63倍物镜和差分干涉对比度（DIC）设置。成像时，将活细胞嵌入1%低熔点琼脂糖中，并在RT512×512下观察，记录1µm焦距增量的像素图像，同时成像线粒体靶向GFP和DIC。使用LSM图像浏览器（卡尔蔡司公司）处理图像。为了分析线粒体体积，对每个酵母菌株至少10个细胞和每个细胞5个焦点增量的平均值进行了细胞内线粒体GFP比率的评分（DIC图）。

EM和电子断层扫描

使用德意志方法对化学固定、冷冻切片酵母细胞进行EM(德意志，1989年)如前所述进行定量免疫电镜检查(Vogel等人，2006年). 使用所示抗体和山羊抗兔IgG结合到10-nm金颗粒（Dianova）对细胞进行免疫金标记。金颗粒在线粒体中的位置与CJ与IBM相连的清晰可分解的CM绘制在一个单一的经验确定模型上。为了定量测定IM上蛋白质的相对密度，IM上所有点在14nm距离内的金粒子数是通过在模型中沿IM从底部向顶部移动来确定的。用德意志方法制备的整个酵母细胞的电子显微照片测量CJ直径(德意志，1989年). 为此，在每个酵母菌株的不同CJ中测量了顶部CJ开口IM中心到中心的距离。

分离线粒体的冷冻分离

冷冻分离基本上如前所述(Dubochet等人，1988年). 将新制备的线粒体重新悬浮在等渗Hepes缓冲液（10 mM Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA和600 mM山梨醇）中，蛋白质浓度为10 mg/ml。将3-5µl的线粒体悬浮液涂敷在EM网格（R2/2；Quantifoil；或定制）上，并安装在配备定制加湿装置的柱塞中(Cyrklaff等人，1990年). 在添加3-5µl基准标记溶液（等渗Hepes缓冲液中的3-nm蛋白A–金[Sigma-Aldrich]）后，去除多余的液体，并将网格快速冷冻在液态乙烷泥浆中并存储在液氮中。

玻璃体切片的冷冻电镜

如前所述进行样品玻璃化、冷冻切片和成像(Al-Amoudi等人，2004年). 简言之，在等渗缓冲液中将与基准标记物混合的球形酵母细胞浸泡在20%右旋糖酐（～40 kD）中，吸入直径为300µm的铜管中，并使用EMPACT1（徕卡）在>2000巴的高压下冷冻。玻璃样品在切片机（Ultracut UCT；Leica）中进行冷冻切片，切片的标称厚度为120 nm，最终厚度为～200 nm，这是使用35°冷冻金刚石刀（Diatome）或45°玻璃刀（间隙角为6°）对样品进行压缩的结果。

电子断层扫描

将冷冻水化样品安装在70°倾斜的冷冻样品架（型号626；Gatan GmbH）中，并在配备场发射枪、柱后能量过滤器（GIF 2002；Gatan-GmbH）和2048×2048像素的慢扫描电荷耦合器件相机（Gatan-GmbH）的冷冻电子显微镜（CM 300；Philips）中进行检查。低电子剂量系列（4000–5000电子/nm2)典型的60–70张图像中，有一张是使用数字缩微仪软件包（Gatan GmbH）记录的，其倾斜范围为±60°至±70°，倾斜间隔为2°，标称放大倍数为43000（0.82 nm/像素）或52000（0.68 nm/象素），物镜散焦为6–10µm。化学保存的材料在类似的条件下成像，但选择用于记录断层倾斜系列的区域用>10000电子/nm的电子剂量进行预辐照2使用基准标记对齐倾斜序列图像，并使用EM图像处理软件包通过加权反向投影将其合并到3D重建中(Hegerl，1996年)以及线粒体OM包的转定位酶(Nickell等人，2005年)用于对卷进行后处理。EM断层图的最终厚度在300-500nm之间。AMIRA可视化软件包（Mercury Computer Systems）用于原始重建中线粒体膜和分子的表面绘制，以及以图形显示结果。

在线补充材料

图S1表明FCJ1型(AIM28/FMP13/YKR016W)与丝裂原的序列相似性很低。图S2显示，含有Fcj1的低聚物蛋白质复合物是Fcjl自我作用的结果。图S3显示了Fcj1定向抗体和免疫电镜在Δfcj1细胞。图S4显示Fcj1缺失导致嵴形态改变。图S5显示了双缺失菌株的分析Δfcj1/Δsue和Δfcj1/Δsug以及一株过度表达Fcj1的菌株。视频1和2显示了化学固定野生型和Δfcj1 酿酒酵母单元格。视频3显示了一张孤立野生型的冷冻电镜断层图酿酒酵母线粒体。视频4和5显示了分离的Δfcj1 酿酒酵母线粒体。表S1显示了野生型和Δfcj1细胞。表S2–S4分别显示了本研究中使用的菌株、质粒和寡核苷酸。在线补充材料可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200811099/DC1.

致谢

我们感谢Carsten Bornhövd博士、Stéphane Duvezin-Caubet博士、Kai Hell博士和Julio Ortiz博士的有益讨论，感谢Gabriele Ludwig博士和Margit Vogel博士的出色技术援助。

这项工作得到了德国Forschungsgemeinschaft Sonderforschungsbereich 594项目B8（授予A.S.Reichert）、德国法兰克福歌德大学优秀大分子复合物集群项目EXC 115（授予A.S.Reichart）、慕尼黑综合蛋白质科学中心的支持，研究基金会（授予V.Soubannier）和欧洲生物化学学会联合会博士后奖学金（授予V.Soubanier）。前两位作者贡献均等，按字母顺序排列。

脚注

本文使用的缩写词：BN-PAGE，蓝色原生PAGE；CJ，嵴连接；CM，嵴膜；DIC、差分干涉对比；IBM，内界膜；IM，内膜；线粒体DNA；OM，外膜；PK，蛋白酶K；SEC，尺寸排除色谱法；TAP，串联亲和纯化。

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文章来自细胞生物学杂志由提供洛克菲勒大学出版社