Nrf2-抗氧化反应元件信号通路及其研究进展氧化活化强调^*

摘要

ARE介导的途径

许多细胞保护酶对反应的诱导化学胁迫主要是在转录水平上调节的。这个转录反应由顺式-作用元件命名是，²最初发现的在编码两种主要解毒酶GSTA2的基因启动子中(克谷胱甘肽S公司-t吨转移酶A2类)和NQO1(N个ADPH:q个乌尼酮o个氧化还原酶1)(图1)(1–4).ARE具有其结构和生物特征独特的氧化应激反应(5). 它不仅被激活响应H₂O（运行）₂但具体来说是化学物质能够进行氧化还原循环或代谢转化为活性或亲电中间体(6). 此外，化合物有与巯基反应的倾向，如马来酸二乙酯，异硫氰酸盐和二硫硫蛋白也是are的有效诱导剂活动。因此，由于水平升高，细胞氧化还原状态发生改变活性氧和亲电物种和/或抗氧化能力降低(例如谷胱甘肽）似乎是触发的重要信号由该增强子介导的转录反应。

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图1。

大鼠的调节GSTA2号机组和NQO1号机组基因表达。这两种解毒酶的诱导在由两种不同的增强子XRE和ARE介导的转录水平，分别由AhR和Nrf2控制。β-萘氟烷(β-NF公司)，3-甲基胆蒽(3-MC公司)、和苯并(一)芘(B（a）P)诱导这些基因的表达通过两种不同的途径，直接激活AhR，芳香烃受体核转运体二聚后(ARNT公司)与XRE结合以激活转录，并间接通过Nrf2-ARE途径将其生物转化为反应性中间产物。Nrf2与碱性区域亮氨酸拉链二聚(bZIP（邮编）)蛋白质并与ARE结合以激活基因转录。通过AhR-XRE途径的诱导似乎代表了防止外源性物质最终代谢转化为它们的反应形式。TCDD公司,2,3,7,8-四氯二苯并-第页-二恶英。

除了参与诱导基因表达外，ARE还参与负责几个非应激条件下的基因。因为活性氧和其他内源性活性分子是由正常的有氧运动不断产生的代谢，ARE参与控制组成基因表达暗示增强子在维持应激和非应激条件下细胞氧化还原稳态条件。

Keap1的Nrf2活性和抑制

通过ARE激活基因转录主要由编号2(n个核因子E2-第页兴高采烈的（f）演员2)，通过克隆实验首次分离(7). 隔离后，Nrf2被鉴定为作用于ARE的转录因子之一人类NQO1号机组在细胞瞬态中激活基因转录转染实验(8).随后，对其他一些国家的ARE进行了类似的观察基因(9). 值得注意的是Nrf2的参与被进一步证实体内中的研究发现几个ARE依赖基因的哪个表达严重在以下方面受损编号2^–/–老鼠(10,11)和染色质免疫沉淀分析显示内源性H4IIE细胞中的Nrf2和ARE(12). 这些研究也提供了Nrf2控制诱导型和组成型基因的证据ARE介导的表达。Nrf2具有双重作用的重要性下面将进一步讨论，因为我们试图为我们的了解Nrf2调节途径。

Nrf2活性部分由肌动蛋白相关的Keap1蛋白调节，它最初被提议通过结合和栓系转录起作用细胞质中的因子。应力信号激活Nrf2被认为是这种关联被破坏的结果，为转位到细胞核以影响其转录活性(13). 独立而言，Nrf2具有被发现是一种高度不稳定的蛋白质(t吨_½～15分钟），受到26 S催化的蛋白水解降解蛋白酶体通过泛素依赖途径。在这种情况下，激活Nrf2被认为依赖于增加其稳定性的机制，导致其在细胞内积聚(14,15). 不稳定的性质Nrf2蛋白及其通过这种动态机制的调节表明Nrf2不太可能被束缚在细胞质中的被动复合物中。这一点得到了一些研究的证实，这些研究显示了更积极的作用Keap1抑制Nrf2活性。Keap1似乎在推广Nrf2以构成方式泛素化(12,16–18)通过cullin-3依赖性途径(19–22).

Nrf2在非应激细胞中不断降解意味着Keap1是一种组成性活性蛋白，可促进Nrf2泛素化不受管制的方式。这得到了以下观察结果的支持：Keap1过度表达导致泛素结合蛋白水平增加细胞内Nrf2的形态(12,18)，表示Keap1表达为一种功能活性蛋白。此外，Nrf2的比率非应激细胞中的泛素化及其降解似乎是在很大程度上依赖于细胞中Keap1蛋白的丰度，如由在keap1型^–/–动物(23)或遵循小干扰人工降低细胞Keap1蛋白水平核糖核酸(24). 值得注意的是，这些数据建议与Keap1互动后，Nrf2直接针对泛素化和降解。因此，这两种蛋白质之间的相互作用是更可能是短暂的邂逅，而不是持久的联系。鉴于电池中Nrf2的稳态水平部分通过其构成表达式，要求从头开始基因转录和蛋白质合成(12,14)，途径从合成到降解，Nrf2活性受到调节，需要进一步详细检查。

Nrf2-Keap1监管路径

Keap1参与促进Nrf2降解导致认识到两种蛋白质之间的相互作用是一个动态过程必须通过使Nrf2能够控制its基因的基础表达和诱导表达(12). 事实上，Nrf2控制其基因的基本表达(10,11)清楚地表明是一种组成和功能活性转录因子，值得注意的是，暗示其在稳态条件下存在于细胞核中。那个内源性Nrf2与非应激细胞中的ARE相互作用不仅提供进一步支持Nrf2的核性质，但与参与its基因的基础表达(12). 因此，证据表明在本构条件下，Nrf2定位于原子核是令人信服的并且不支持Nrf2与Keap1在细胞质(13,18,25–29).这些发现的差异被认为是由于非特异性抗Nrf2抗体的交叉反应性（C-20，Santa Cruz Biotechnology）用于许多（如果不是全部）早期亚细胞定位研究。使这一困难更加复杂的是，Nrf2蛋白的流动性变性Tris/甘氨酸缓冲SDS凝胶与其分子质量(7)，正在生成它的检测和识别更具试探性。这些技术问题因此引发了本土化研究是否使用此抗体提供了可解释和确凿的数据，特别是在非应激细胞，其中Nrf2蛋白水平较低。

我们报道了一种抗体的产生，该抗体具有高亲和力和HepG2细胞对Nrf2的特异性和最小交叉反应性(14). 使用这种抗体，内源性Nrf2主要定位于HepG2细胞核和H4IIEC3细胞(12). 这个核能定位并不是这两种细胞系所独有的，类似的观察结果也适用于各种其他类型的细胞，包括初级细胞细胞。^三以下示例Nrf2在人脐静脉内皮细胞中的核定位是如所示图2.这些研究结果，结合使用编号2^–/–小鼠和染色质上述免疫沉淀实验表明，Nrf2是一种核蛋白，在组成和应力条件。Nrf2在核内的移位核糖体上的生物合成，因此似乎不是受调控的过程。因此，核内Nrf2的激活和积累对压力信号的反应很可能是其稳定的结果，通过降低其降解速率的机制进行调节。

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图2。

人脐静脉内皮细胞Nrf2的核定位细胞。通过免疫细胞化学和共焦显微镜。Nrf2用抗Nrf2抗体染色(14)并使用二级抗体与Alexa Fluor 488偶联。原子核是4′，6-二脒基-2-苯基吲哚复染(达皮)、和用Alexa Fluor 680-结合物对F-actin丝进行染色类阴茎激素。

一个重要的问题是Keap1如何针对Nrf2进行泛素化它们位于不同的细胞隔室中。看起来Keap1是能够参与核质穿梭活动，如图所示几项研究(12,30,31)在最近的一份报告(32).然而，在另一项研究中没有观察到Keap1的这种穿梭活动(33)，以及原因不理解差异。我们实验室的研究表明Keap1短暂进入细胞核并靶向Nrf2，以实现泛素化隔间。这是基于蛋白酶体抑制MG132的活性导致完整和泛素化形式的积累核内的Nrf2，表明泛素化和降解过程可能在这个隔间开始并结束(12). 相反，它一直是提示，除了在促进细胞质Nrf2的作用外在无应力条件下降解，Keap1也进入细胞核在压力条件下将Nrf2护送至细胞质进行降解。该结论基于Nrf2主要定位的观察结果在与野生型Keap1共转染但被定位的细胞的细胞质中主要在与核输出信号共同转染的细胞核中Keap1的突变体类似物，被困在细胞核中。然而，在同一研究中的亚细胞分馏分析发现，Nrf2与细胞质相比，主要分布在细胞核部分部分，无论是来自与野生型Keap1共转染的细胞还是与核输出信号突变型Keap1。这些矛盾的原因结果不清楚(32).

除了上面讨论的实验证据外，还有其他几个很难与Keap1的建议相一致的意见靶点Nrf2在细胞质及其上游降解反式激活功能(即Nrf2无法驾驶其基因在基础水平的转录）和Keap1的抑制应激信号的活性促进Nrf2转运到细胞核(13,18,25,26,34–36).例如，由于Nrf2是在细胞中组成性表达的，因此调控途径意味着Nrf2是Keap1降解的靶点直接遵循其从头开始合成，因此表示相对于细胞的基因调控机制相当低效能源使用。此外，尽管其营业额很高，但事实上Nrf2表示为电池中的稳态水平，表示存在经过的时间间隔(即t_½～15分钟）在其生物合成之后和降解之前。这样的间隔可能代表Nrf2激活其基因的时间窗，发挥其推动其构成表达的作用。核能Keap1的穿梭将通过促进Nrf2基因转录激活后快速降解。Nrf2被Keap1降解的确切机制是没有很好的理解。然而，值得注意的是，许多转录因子与它们的反式激活能力有关域，通常被发现包含或重叠于它们的degron(37). 因为Nrf2是高度不稳定，并拥有与Keap1-相互作用Neh2域(38,39)，Nrf2可能通过与其转录相关的机制进行降解活动。根据这里讨论的实验和生物证据，Keap1控制Nrf2稳定性的调控途径总结如下图3.

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图3。

建议的Nrf2-ARE信号通路。Nrf2表示组成性地在细胞内，然后直接转移到细胞核它的合成。在其基因的反式激活之后，Nrf2被靶向Keap1在细胞核中的降解，这一过程需要瞬态Keap1穿梭进入这个隔间。在承受压力的细胞中，稳定Nrf2被认为依赖于预防或减少的机制Keap1接入Nrf2。该图摘自参考文献。12.

控制Nrf2稳定化的分子机制

Nrf2在反应性化学胁迫下的稳定性最强可能受到导致其发病率下降的机制的调节退化。在早期的研究中，使用翻译检查Nrf2稳定性抑制剂环己酰亚胺(14,15)，Nrf2的半衰期为发现未经处理的细胞从～15分钟延长到～30分钟暴露于应激诱导剂下，表明Nrf2仍然受到在压力条件下，降解速率很高，但较慢。因此，除了促进Nrf2稳定的调节机制外应力，似乎存在促进其退化的本构机制可能是为了防止其在不受控制的方式。这两个机构是独立运行还是目前尚不了解协调时尚，仍有待进一步研究调查。

控制Nrf2稳定性的一个成熟机制是介导作者：Keap1。由于其初级中有大量Cys残基结构，Keap1为通过巯基反应性化学物质及其抑制调节活性被认为是Nrf2活化的重要机制(13,18,25,26). 事实上，许多Keap1中的活性Cys残基（位置257、273、288和297）由识别在体外将研究标记为假定的攻击位点被认为对调节它与Nrf2的相互作用(25). 这个概念是基于细胞的研究表明赛斯¹⁵¹，塞浦路斯²⁷³，或Cys²⁸⁸不利影响Keap1功能活性(18). 发现Keap1经历一个尚待描述的赛斯¹⁵¹-中的相关修改细胞暴露于t吨-丁基对苯二酚，产生Keap1物种变性凝胶的流动性降低。这一点的意义和性质然而，修改并不明确，因为这只是Keap1的一小部分蛋白质种群受到t吨-丁基对苯二酚处理(18). 在一项独立研究中，Cys突变²⁷³或Cys²⁸⁸被类似地观察到取消Keap1的阻遏活性，这可能是由于Keap1突变体不能形成分子间二硫键需要发布Nrf2(26).另外，据报道Keap1半胱氨酸残基的修饰通过亲电化合物使泛素化的目标底物从Nrf2切换到Keap1(34,35). 最近，分子Nrf2和Keap1之间的相互作用，无论是野生型还是Cys突变型发现类似物不受不同亲电诱导物的影响(36). 这与活性半胱氨酸残基修饰的早期研究人类Keap1蛋白对其与Nrf2的Neh2域(40).因此，Nrf2的激活似乎涉及更复杂的机制而不是修改后与Keap1关联的物理释放活性半胱氨酸。

然而，这些研究的数据为以下机制提供了证据：通过其活性半胱氨酸残基调节Keap1活性。这个导致Nrf2稳定的确切机制尚待阐明，然而。根据我们发现的Nrf2的核性质(12)，之间的相互作用Nrf2和Keap1被认为代表发生在然后Keap1穿梭进入这个隔间。控制Keap1对Nrf2的稳定性通过机制在空间和时间上进行调节这将他们的互动限制在特定的时间和地点。建议使用介导Nrf2对亲电诱导物的稳定反应通过阻止或减少Keap1访问Nrf2的机制分子。在这方面，Keap1中的活性半胱氨酸可能很重要在这个过程的调节中。然而，这种机制并不涉及Keap1核质穿梭活性的调控(12,36).

据报道，Nrf2激活的调节也由各种主要蛋白激酶途径(27–29,41–44).虽然Nrf2的磷酸化已经在一些研究中得到证实(27–29),没有一种磷酸化与它有关稳定。因为这些激酶途径控制许多信号细胞中的过程，需要额外的研究来探索它们是否与Nrf2蛋白稳定性的调节密切相关对氧化应激的反应。

Nrf2-ARE通路作为治疗神经退行性疾病

许多神经退行性疾病的发病机制被认为是与ROS积累引起的氧化应激相关。以前的工作我们的实验室证明，经过氧化还原循环的化合物形成ROS和氧化剂，如H₂O（运行）₂激活Nrf2-ARE转录途径(5). 其他人的工作实验室已经证明，Nrf2-ARE途径的激活提供了防止谷氨酸和H₂O（运行）₂-诱导细胞死亡(45,46). 此外，星形胶质细胞表达Nrf2保护神经元免受氧化应激(46).自然频率2^–/–小鼠出现空泡白质脑病，其特征是血管变性，涉及所有主要脑区。在白束中，血管变性是伴有广泛的反应性胶质增生(47). 最后，初步数据表明实验性自身免疫性疾病的发展脑脊髓炎是多发性硬化的实验模型在中加剧编号2^–/–，老鼠暗示Nrf2-ARE通路在多发性硬化症发病机制中的可能作用硬化(48).

目前正在临床测试的一种化合物，用于治疗多发性硬化症硬化症是富马酸二甲酯的口服制剂，称为BG12。临床前实验表明，BG12可以激活Nrf2-ARE通路(49–51).它还抑制粘附分子和细胞因子的表达，提示潜在的抗炎特性。在随机分组中，双盲、安慰剂对照、剂量范围2b期研究，BG12复发缓解患者的脑部MRI活动显著降低多发性硬化(52). 这些数据表明，BG12可能在不能耐受或不能耐受的复发性多发性硬化症患者选择不开始胃肠外治疗。目前正在进行第三阶段临床研究正在更大的患者群体中进行，以确认2b期的发现研究。

总之，Nrf2-ARE转录途径在控制关键蛋白质表达的基因调控ROS和电泳物的解毒和消除。令人惊讶的是，Nrf2-ARE通路的激活在治疗多发性硬化症。是否患有其他神经退行性疾病例如阿尔茨海默病或帕金森病可能会受益于这种激活路径尚待确定。

补充材料

笔记

^*这篇迷你评论将在2009年迷你评论简编中重印，该简编将于2010年1月推出。

脚注

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