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.2005年1月；25(1):162-71.
doi:10.1128/MCB.25.162-171.2005。

BTB蛋白Keap1通过Cullin 3-Roc1连接酶靶向抗氧化转录因子Nrf2实现泛素化

Manabu Furukawa公司 1, 岳雄
附属公司

BTB蛋白Keap1通过Cullin 3-Roc1连接酶靶向抗氧化转录因子Nrf2实现泛素化

Manabu Furukawa公司等。 分子细胞生物学. 2005年1月.

摘要

许多真核生物蛋白质的浓度和功能都受到泛素途径的调控，泛素途径包括泛素激活（E1）、结合（E2）和连接（E3）。Cullins是一个进化上保守的蛋白质家族，组装了迄今为止最大的E3连接酶复合物家族。Cullins通过一个保守的C末端结构域与环指蛋白Roc1结合，以补充E2的催化功能。通过一个独特的N末端结构域，单个cullin与多个蛋白质中的蛋白质基序结合，以招募特定底物。Cullin 3（Cul3），而不是其他Cullin，直接与BTB结构域结合，构成潜在的大量BTB-Cul3-ROC1 E3泛素连接酶。在这里，我们报道了人类BTB-Kelch蛋白Keap1，一种抗氧化转录因子Nrf2的负调控因子，分别通过其BTB和Kelch结构域与CUL3和Nrf2结合。KEAP1-CUL3-ROC1复合物在体外促进NRF2泛素化，并通过短干扰RNA敲低KEAP1或CUL3，导致NRF2蛋白在体内积累。我们认为Keap1通过靶向Nrf2，使其通过CUL3-ROC1连接酶泛素化并随后通过蛋白酶体降解，部分负调控Nrf2功能。通过抑制蛋白酶体活性或敲低Cul3，阻断表达KEAP1和NRF2的细胞中NRF2降解，导致NRF2在细胞质中积累。这些结果可以调和先前观察到的KEAP1对NRF2的细胞质螯合，并表明KEAP1-NRF2结合和NRF2降解之间可能存在调节步骤。

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数字

图1。
图1。
NRF2被蛋白酶体迅速泛素化和降解。（A） 用表达FLAG-标记NRF2（NRF2-FLAG）的质粒转染293T细胞。转染后24小时，首先用MG132（25μM）或二甲基亚砜（DMSO）处理细胞5小时，然后用环己酰亚胺（CHX）（75μg/ml）处理细胞10分钟至6小时。细胞被裂解，总裂解物的50μg（1区）或100μg（2区至7区）被SDS-PAGE溶解，然后用抗FLAG（α-FLAG）或抗肌动蛋白（α-Actin）抗体进行免疫印迹（IB）。（B） 用表达FLAG标记的NRF2和HA标记的泛素（HA-Ub）的质粒转染293T细胞。转染后20小时，在细胞裂解前用MG132（25μM）处理细胞2小时。细胞在SDS裂解缓冲液中裂解并煮沸15分钟。然后用NP-40裂解缓冲液稀释裂解产物，并用抗FLAG抗体进行免疫沉淀（IP）。洗涤后的免疫沉淀物和50μg裂解物用SDS-PAGE溶解，然后分别用抗HA和抗FLAG抗体进行免疫印迹。
图2。
图2。
KEAP1促进NRF2降解。（A） 本研究中NRF2蛋白和突变的示意图。BZIP，碱性区亮氨酸拉链；氨基酸。（B） 293T细胞与表达HA标记的KEAP1（HA-KEAP1）和Myc-标记的NRF2（Myc-NRF2）（野生型[WT]或突变型NRF2）的质粒共转染。转染后20小时，细胞在裂解前用MG132（25μM）处理4小时，并用IP-Western检测NRF2-KEAP1相关性。免疫印迹法；α-Myc，抗-Myc抗体；α-HA，抗-HA抗体。（C） HeLa细胞与表达HA标记KEAP1和FLAG标记野生型或突变NRF2的质粒共转染。转染后24小时，细胞被裂解，裂解产物（0.1 mg）被SDS-PAGE溶解，然后用抗FLAG（α-FLAG）或抗HA抗体进行免疫印迹（IB）。（D） GFP标记的NRF2单独或与表达DsRed标记的KEAP1的质粒一起转染HeLa细胞。转染后24小时，用荧光或相控显微镜检测GFP-NRF2和DsRed-KEAP1的表达水平。
图3。
图3。
Keap1中的BTB结构域与CUL3的N末端结合。（A） 野生型（WT）和突变体Keap1。（B） SKP1、PLZF和Keap1的BTB/POZ褶皱中保守的α/β结构。相同和保守的残基分别用深灰色和浅灰色阴影表示。SKP1中与CUL1接触的残留物用星号标记。β-片S3和α-螺旋H4（KEAP1）中的突变残基S3H4型突变体）显示在底部。（C） 野生型CUL3、ΔN41（其中N末端41个残基被删除的CUL3）和螺旋2螺旋5突变体（H2H5）CUL3的示意图。（D） CUL1和CUL3的螺旋2（H2）和螺旋5（H5）的序列比较。CUL1的H2和H5螺旋中与SKP1接触的残留物用星号标记。CUL3中保存的残留物用阴影标记。CUL3中突变的残基过氧化氢突变体显示在底部。（E） 293T细胞与表达Myc-tagged CUL3（Myc3-CUL3）或HA-taged KEAP1（HA-KEAP1）（野生型[WT]或突变型CUL3或KEAP1。转染后24小时，细胞被裂解，用IP-Western检测CUL3-KEAP1相关性。免疫印迹法；α-Myc，抗-Myc抗体。
图4。
图4。
Keap1直接与Nrf2和CUL3结合。（A） 从细菌中纯化His-tagged NRF2（His-NRF2）融合蛋白，并与固定在谷胱甘肽琼脂糖微球上的细菌纯化GST或GST-KEAP1融合蛋白混合。免疫印迹法（IB）检测NRF2-KEAP1结合。α-NRF2，抗NRF2抗体；α-GST，抗GST抗体。（B） His-CUL3公司N197号从细菌中纯化融合蛋白，并与固定在谷胱甘肽琼脂糖微球上的细菌纯化GST或GST-KEAP1融合蛋白混合。细菌3N197号-用免疫印迹法（IB）检测KEAP1结合。α-CUL3，抗CUL3抗体。
图5：。
图5：。
内源性CUL3、KEAP1和NRF2形成复合物。293T细胞在裂解前用MG132或DMSO（−）处理4小时。细胞裂解物用CUL3（α-CUL3）、KEAP1（α-KEAP1）或NRF2（α-NRF2）抗体免疫沉淀（IP）。洗涤后的免疫复合物通过SDS-PAGE进行解析，然后用指示的抗体进行免疫印迹（IB）。IgG（H）、免疫球蛋白G（重链）。
图6。
图6。
体外KEAP1-CUL3-ROC1复合物泛素化NRF2。（A） KEAP1-CUL3-ROC1复合物。293T细胞与表达所指示的蛋白质、Myc标记的CUL3（Myc-CUL3）、T7标记的KEAP1（T7-KEAP1）和HA标记的ROC1（HA-ROC1）的质粒共转染。转染后24小时，用抗Myc抗体（α-Myc）裂解细胞并免疫沉淀（IP）。用SDS-PAGE溶解总裂解物（1和2道）和免疫沉淀物（3和4道），然后用所示抗体进行免疫印迹（IB）。（B） NRF2的体外泛素化。利用myc抗体通过免疫沉淀法从三重转染细胞中制备KEAP1-CUL3-ROC1复合物，并用作E3连接酶的来源。细菌表达和纯化的FLAG标记的NRF2与KEAP1-CUL3-ROC1复合物、E1、E2、泛素（Ub）和ATP孵育，反应混合物通过SDS-PAGE进行解析，并用指示的抗体进行免疫印迹。
图7。
图7。
当Cul3或Keap1沉默时，NRF2积累。（A） 293T细胞与表达FLAG标记的NRF2质粒和指示的短发夹RNA质粒（shCul3和shKeap1）共转染。用嘌呤霉素（1μg/ml）筛选转染细胞。转染后96小时，对所选细胞进行裂解，并用SDS-PAGE对50μg样品的总裂解物进行解析，并用所示抗体进行免疫印迹。RNA干扰。（B） 将GFP-NRF2或GFP-NRF2和DsRed-Keap1的表达载体与CUL3短发夹RNA质粒或对照短发夹DNA质粒共转染到HeLa细胞。选择嘌呤霉素后，通过荧光或相差显微镜检查GFP-NRF2和DsRed-KEAP1的表达和定位。
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