胃肠病学。作者手稿；PMC 2009年8月1日提供。
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刺猬信号是有效再生外分泌胰腺所必需的
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沃尔克·芬德里奇
*马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院外科
‡德国马尔堡菲利普斯大学外科
FARZAD ESNI公司
§宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学外科
玛丽亚·维罗妮卡·加里
||科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学健康科学中心芭芭拉·戴维斯儿童糖尿病中心
乔治·费尔德曼
¶马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系
NILS哈勃
¶马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系
JAN NYGAARD詹森
||科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学健康科学中心芭芭拉·戴维斯儿童糖尿病中心
尤瓦尔·多尔
#以色列耶路撒冷希伯来大学哈达萨医学院细胞生物化学和人类遗传学系
多里斯·斯托弗斯
**宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学医学院医学系
简·詹森
||科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学健康科学中心芭芭拉·戴维斯儿童糖尿病中心
史蒂文·德利奇
*马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院外科
††马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌研究中心
ANIRBAN MAITRA公司
¶马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系
‡‡马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌研究中心
*马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院外科
‡德国马尔堡菲利普斯大学外科
§宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学外科
||科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学健康科学中心芭芭拉·戴维斯儿童糖尿病中心
¶马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系
#以色列耶路撒冷希伯来大学哈达萨医学院细胞生物化学和人类遗传学系
**宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学医学院医学系
‡‡马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌研究中心
请将转载请求发送至：Anirban Maitra，MBBS，Sol Goldman胰腺癌研究中心病理学和肿瘤学副教授，CRB-2，Suite 345，Johns Hopkins University School of Medicine，1550 Orleans Street，Baltimore，Maryland 21231。电子邮件：ude.imhj@1artiama; 传真：（410）614 0671或Steven D.Leach，医学博士，外科、肿瘤学和细胞生物学教授；索尔·戈德曼胰腺癌研究中心，约翰·霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩市奥斯勒603北沃尔夫街600号，邮编：21287。电子邮件：ude.imhj@hcaelts; 传真：（410）614 2913 V.F.和F.E.为这项工作做出了同等贡献。
S.D.L.和A.M.实验室为这项工作做出了同等贡献。
J.J.目前的地址是俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所勒纳研究所干细胞生物学和再生医学系。
- 补充资料
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摘要
尽管内分泌和外分泌胰腺都显示出显著的组织再生和更新能力，但成年胰腺中是否存在祖细胞仍不确定。使用天蓝蛋白介导的损伤和修复模型，我们证明成熟外分泌细胞，通过表达弹性酶1启动子，通过形成化生导管中间产物，积极促进胰腺上皮再生。Acinar细胞再生与Hedgehog（Hh）信号的激活有关，通过上调多途径成分的表达以及激活Ptch lacZ公司报告基因。利用药理学和遗传学技术，我们还发现成熟外分泌细胞完成胰腺再生的能力受到Hh信号传导阻断的损害。具体而言，缺乏完整的Hh途径时再生减弱，其特征是表达胰腺祖细胞标记物的化生上皮持续存在，表明抑制向成熟外分泌细胞的再分化。鉴于Hh信号在外分泌性胰腺癌中的已知作用，这些发现可能提供了损伤诱导的胰腺祖细胞激活与随后的胰腺肿瘤之间的机制联系。
在成熟哺乳动物组织中，损伤后再生的能力意味着存在具有祖细胞功能的细胞。与组织再生是通过激活和扩增一种罕见的专用祖细胞来实现的模型不同，最近的研究已引起人们对分化的胰腺细胞类型作为兼性祖细胞的能力的关注，类似于分化肝细胞在肝脏再生中的作用。1,2例如，在部分胰腺切除术后，现有的胰岛素分泌细胞似乎是新的胰岛素分泌源β-内分泌再生过程中的细胞。三同样，有人认为成熟的腺泡细胞也保留兼性祖细胞能力，这是因为它们在体内胰腺外分泌损伤后具有去分化能力4,5以及它们在体外产生脱分化巢蛋白表达细胞的能力。6然而，引导这种祖细胞行为的信号通路尚未得到很好的描述。
最近关于胰腺外分泌再生机制的研究很大程度上依赖于使用天蓝蛋白（胰腺促分泌胆囊收缩素的十肽类似物）诱导上皮损伤。4,7水芹素诱导的上皮损伤被认为是一个完全可逆的过程，尽管这种损伤可能导致可识别的腺泡细胞几乎完全丧失。由于强有力的再生反应，天蓝蛋白给药后1周内，Acinar细胞质量完全恢复。Jensen等人4已有研究表明，在天蓝蛋白介导的损伤环境中，存活的腺泡细胞抑制末端外分泌基因程序，并诱导发育中胰腺中典型的转录物。Desai等人最近的谱系追踪研究已经证实，成熟的腺泡细胞负责胰腺损伤模型中的外分泌再生，5而Strobel等人排除了内分泌细胞参与蓝斑胰腺炎后的这一过程。8尽管这些优雅的系列报道已经确立了成熟腺泡细胞的兼性祖细胞功能（“腺泡生腺泡”），并且排除了外分泌再生过程中“转分化杂合”的可能性，导致这一现象的精液信号通路在很大程度上尚未探索。
除了它在指导胚胎组织模式形成方面的既定作用外，9Hedgehog（Hh）通路与越来越多的成体组织中的干细胞或祖细胞数量的维持有关。10–15这些部位的成熟组织内稳态似乎是Hh介导的干细胞或祖细胞在器官特异性干细胞生态位内自我更新的结果。除了在“基线”状态中观察到的作用外，最近的研究表明，Hh途径在组织损伤的再生反应中也起着关键作用。例如，雄性小鼠去势后前列腺上皮的雄激素诱导再生需要Hh途径活性，14以及萘诱导的急性肺损伤模型中的肺上皮再生过程。15根据Hh信号抑制与组织修复减少相关的观察结果，这些研究表明，Hh信号上调是对损伤作出反应的干/祖细胞扩增的先决条件。
本研究的目的是确定Hh信号在蓝蛋白诱导的胰腺炎后外分泌再生过程中的作用。最近对慢性胰腺炎存档人类标本的经验研究表明，Hh成分的异常表达，16,17但这些研究尚未探讨Hh阻断在外分泌损伤中的功能意义。为了证实先前的观察结果，我们通过谱系追踪实验证明，胰腺再生是由成熟的腺泡细胞通过形成短暂化生上皮介导的，表达胰腺祖细胞标记物（nestin，Pdx1）。此外，外分泌损伤和再生的特点是Hh成分的早期和深度上调。重要的是，我们发现Hh途径的药理学或基因中断都会导致受损外分泌室再生受损，从而加强了该途径在胰腺上皮修复中的关键作用。出乎意料的是，我们证明阻断Hh信号对腺泡细胞产生化生中间产物以应对损伤的能力影响极小；相反，缺乏Hh信号导致“再分化停滞”，即化生中间产物继续表达胰腺祖细胞的标记物，并且无法重新激活外分泌分化程序。这些发现证明了Hh信号通路在兼性胰腺祖细胞调节中的独特作用，并表明，除了Hh信号通路对专用祖细胞数量的既定影响外，该通路还可能对兼性祖细胞功能具有新的组织特异性影响。
材料和方法
实验性胰腺炎的诱导
C57BL/6J野生型小鼠（Charles River Laboratory，Wilmington，MA）或杂合型小鼠Ptch1-LacZ公司报告鼠18用于注射天蓝色素，同时或不同时进行环胺治疗。要从基因上废除Hh途径，有两种不同的方法克里驱动器用于消除胰岛特异性Smoothened（Smo），这是Hh信号转导的先决条件。首先，Pdx1-Cre/Smoflox/flox公司小鼠是通过Pdx1杂交产生的-Cre公司老鼠19带C57BL/6J Smoflox/flox公司老鼠。11Pdx1-芯/Smo+/弗洛克斯然后用Smo回交后代flox/flox公司小鼠产生Pdx1-Cre/Smoflox/flox公司老鼠。同样，他莫昔芬诱导弹性蛋白酶（Ela）-Cre-ERT2段老鼠20用于生成Ela-Cre-ERT2段/平滑（Smo）flox/flox公司老鼠；服用三苯氧胺会导致Cre公司激活条件弹性酶1调控元件，导致成熟外分泌（腺泡）室中的重组。杂合Pdx1-Cre/Smo弗洛克斯/+和Ela-CoreERT2段/平滑（Smo）弗洛克斯/+用作对照。8个日间剂量（50μ（g/kg，腹腔注射）天蓝蛋白（MP Biomedicals，Aurora，OH）于0.2 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，连续2天间隔1小时。注射天蓝蛋白的最后一天被定义为d0。每个实验组包含5只PBS注射对照小鼠和15只转基因小鼠（15只Ptch1-lacZ报告小鼠，15只他莫昔芬诱导的Ela-CreERT2段/平滑（Smo）flox/flox公司小鼠和15 Pdx1-Cre/Smoflox/flox公司分别为小鼠）。以年龄匹配的转基因小鼠作为对照。请参阅补充方法有关三苯氧胺诱导和体内环胺剂量优化的更多详细信息（参见补充方法在线时间：网址：www.gastrojournal.org).
免疫标记和逆转录聚合酶链反应
为了进行免疫标记，按照前面的描述对组织进行染色。21初级抗体的浓度和来源列于补充表1（请参见补充表1在线时间：网址：www.gastrojournal.org). 荧光共焦显微镜使用共焦激光扫描显微镜（410LSM，Zeiss，Thornwood，NY），使用40×（NA 1.2）C-apochro或100×（NA 1.4）物镜进行。淀粉酶和DAPI染色后，通过量化复制的二维（2D）光学切片的免疫荧光图像强度分布来评估损伤严重程度的量化。纸巾来自Ptch1-LacZ公司如前所述，对报告小鼠进行X-半乳糖染色。11使用ABI 7700序列检测系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行一步多重Taq-Man实时PCR。的表达式嘘,小时,普奇,Gli1公司,平滑（Smo），并使用进行了评估PGK公司作为内部控制。如前所述，根据相应的阈值周期（Ct）值确定相对基因表达。22以未经处理的小鼠中检测到的水平与经处理小鼠中检测出的水平的比率来表示处理小鼠中的水平（单独的天蓝色素或天蓝色素+环胺）。报告的数据表示从3个或更多单独实验获得的多个测定值的平均值±SE。假设统计显著性P（P）< .05.
结果
胰腺外分泌损伤与巢蛋白表达上皮细胞增殖再生和扩张相关
按照之前的描述，经过两天的天蓝色素注射方案后，4所有接受治疗的动物都出现了严重的胰腺外分泌损伤，注射天蓝蛋白后第2天腺泡细胞几乎完全丧失，第7天几乎完全恢复(). 如前所述，再生过程包括化生上皮的短暂扩张，然后腺泡细胞团的恢复。虽然是短暂的，但这种化生上皮在慢性胰腺炎的情况下看起来与之前描述的1型管状复合体（TC1）相似。8Ela腺泡细胞“标记”的谱系追踪和形态计量学研究-证书应急响应小组;Z/AP小鼠详见补充图1和2，分别（参见补充图1和2在线时间：网址：www.gastrojournal.org). 谱系追踪研究证实了短暂化生上皮的腺泡来源。发现再生上皮高度增殖，注射蓝绿色素后第2天观察到BrdU掺入率增加50倍以上(). 为了进一步阐明这种增殖上皮的性质，我们对巢蛋白进行了免疫荧光染色，巢蛋白是一种已知在发育中的小鼠胰腺外分泌祖细胞中表达的中间丝，并且在体外进行了腺泡细胞脱分化。6,21我们观察到，在蓝蛋白损伤后，E-cadherin表达的上皮细胞室中，包括化生性导管病变中，巢蛋白早期广泛上调(). 相反，巢蛋白在未受损胰腺中的表达仅限于E-钙粘蛋白阴性的间充质成分()，如所述。21
白藜芦醇诱导的胰腺外分泌损伤的特征是巢蛋白表达细胞的增殖再生和扩张。面板A–D：天蓝蛋白诱导胰腺上皮损伤和再生的组织学进展。图像代表小鼠胰腺组织的代表性H&E染色切片，在最后注射蓝绿色素后的指定日期采集。外分泌损伤的高峰出现在第2天左右(面板B)，在第5天逐渐减弱并开始再生(面板C)，并在第7天几乎完全恢复原状(面板D).面板E–H：外分泌再生伴随着BrDU掺入评估的强劲增殖。与对照胰腺相比，在第2天的外分泌室中观察到超过50倍的BrDU掺入(面板H).面板I–L：天蓝蛋白介导损伤后巢蛋白表达的E-cadherin阳性上皮细胞的扩张。未经治疗的胰腺(我)nestin的表达仅限于偶尔出现的E-cadherin阴性间充质细胞。16小时前(J型)，多个E-cadherin阳性细胞(红色)巢蛋白染色(绿色)与残留上皮细胞中巢蛋白上调相一致。40小时时，在化生导管中间层观察到巢蛋白表达(L（左）).
Hh通路在急性胰腺外分泌损伤和再生过程中被激活
Shh的免疫组织化学染色显示，未受损胰腺的导管、腺泡或胰岛室中未检测到Shh的表达(). 相反，Shh在白介素诱导的损伤后广泛表达，在残留的腺泡细胞和再生的化生上皮中均有表达。Shh的增强表达早在注射后第1天开始，在第2天持续存在，但在第5天显著减弱(). 与外分泌胰腺的完全再生一致，在第7天未观察到Shh表达，类似于在对照小鼠中观察到的Shh表达缺失（数据未显示）。杂合子的Cerulein给药Ptch1-LacZ公司报告小鼠还允许我们监测对上调的Shh配体反应的细胞的时空分布。在对照小鼠中，免疫荧光染色β-半乳糖苷酶活性证实E-钙粘蛋白表达的上皮小室中未检测到表达(). 相反，标记β-半乳糖苷酶在再生的外分泌胰腺中表达，与第2天到第5天的蓝蛋白损伤和恢复过程平行(). 使用半定量和定量实时聚合酶链反应（PCR）分析评估Hh配体的表达，对蓝斑狼疮蛋白损伤后的Hh途径活性进行额外表征(Ihh公司)，Hh受体(平滑（Smo）)和Hh-调节基因(第1部分和Gli1公司)因为这些成分的可靠抗体并不容易获得。这些研究证实了胰腺损伤和再生过程中多种Hh途径成分的上调().
白藜芦醇诱导的胰腺外分泌损伤的特征是Hh信号通路的瞬时激活。面板A–D：免疫组织化学染色显示损伤相关的Shh表达上调，随后再生后下调。面板E–H：通过对Ptc胰腺组织的X-gal染色评估Hh途径激活在蓝蛋白介导的损伤和再生过程中的时间演变-lacZ公司报告鼠。PBS处理的胰腺中没有Shh配体的外分泌表达或Hh途径激活的证据(面板A和E类). 在第1天和第2天观察到Shh配体表达和Hh途径激活(面板B和C类和F类和G公司（分别为），在第5天减少(面板D和H（H））。面板I和记者：定量实时PCR从经蓝蛋白处理的小鼠中获得的RNA显示Hh转录靶点的深度上调Gli1公司(面板I)以及第二个Hh配体，Indian Hh(面板J)，在受伤的胰腺中。当标准化到PBS处理的小鼠胰腺中相应的转录水平时，Hh途径成分的上调最早在2小时开始，在最后注射蓝绿色素后48至64小时达到峰值水平。误差条指出每次测量平均值的标准误差。X轴：最后一次注射蓝精灵数小时后；y轴：PBS治疗小鼠的相对折叠表达正常化。面板K：半定量RT-PCR分析证实了类似的上调表达平滑（Smo）和第1部分在最后一次注射蓝绿色素后2小时内（在每条车道上方标明最后一次注入蓝绿色素之后的收获时间；β-肌动蛋白用作加载控制）。
维拉帕米Abrogates Cerulein诱导的Hh信号上调
鉴于转录和免疫组织化学证据表明胰腺外分泌损伤后Hh信号广泛激活()下一步，我们探讨了该通路的扰动在损伤环境中的作用。环磷酰胺是一种甾体生物碱，通过与平滑。23成人天蓝色素治疗Ptch1-LacZ公司报告小鼠在第2天导致Hh信号显著、短暂上调，第7天恢复到基线水平(). 相反，在同时使用蓝绿色素和环胺的小鼠中未观察到上调(). Hh靶点的定量实时PCRGli1公司仅用天蓝蛋白治疗的小鼠表现出显著的上调，而在天蓝蛋白加环胺治疗的小鼠中，这种上调是最小的(). 另一个Hh靶基因的实时PCR，普奇，反映了观察到的模式Gli1公司（请参见补充图3A类在线时间：网址：www.gastrojournal.org). 相反，Hh配体转录物的表达(嘘和Ihh公司)在第2天，环胺对蓝绿色素损伤的反应上调，但未能降低配体转录水平，这与这种小分子抑制剂在平滑水平上的作用一致（参见补充图3B类和C类在线时间：网址：www.gastrojournal.org). 这些实验证实了我们有能力在体内胰腺损伤期间实现Hh信号的有效药物阻断。
环磷酰胺可消除白藜芦醇诱导的Hh信号通路上调。第1部分-LacZ公司仅用天蓝蛋白治疗报告小鼠(Cae公司)或用天蓝色素加环胺(Cae公司+周期)和组织化学染色β-半乳糖苷酶在收获的全部胰腺上进行。广泛但短暂的上调β-半乳糖苷酶在经天蓝蛋白治疗的小鼠中可见(面板A–D)与Hh信号通路的激活一致。β-半乳糖苷酶在第1天开始过度表达(面板A)，第2天达到峰值(面板B)，并在第3天和第7天逐渐下调(面板C和D类)与外分泌再生相吻合。相比之下，接受蓝绿色素和环胺的小鼠胰腺组织(面板E–H)显示的最小激活β-在PBS治疗小鼠中观察到半乳糖苷酶活性与基线表达的比较(面板I). 使用定量实时PCR获得了与环胺治疗相关的Hh反应减弱的进一步文献Gli1公司成绩单(面板J)使用仅经蓝绿色素治疗后收获的胰脏(Cae公司,蓝色条)或天蓝蛋白加环胺治疗(Cae公司+周期,棕色条).X轴表示最后注射蓝绿色素后的第二天，以及y轴表示的相对折叠表达式Gli1公司与PBS处理的对照小鼠相比。值表示平均值±SEM。
药物阻断Hh信号通路对蓝绿色素介导的胰腺损伤后上皮再生的影响
我们比较了仅用天蓝蛋白治疗的小鼠与用天蓝素和环胺治疗的小鼠的胰腺组织，以确定阻断Hh信号是否会影响损伤的严重程度、再生的有效性，或两者兼而有之。在第2天进行的评估中，我们发现环丙胺治疗组和未治疗组的外分泌损伤程度没有明显差异（参见并比较补充图4A类具有在线时间：网址：www.gastrojournal.org). 相反，环丙胺治疗的小鼠胰腺再生明显受损，即使在第7天分化的腺泡细胞也持续显著减少（参见补充图4C类在线时间：网址：www.gastrojournal.org)Hh活性胰腺组织几乎完全再生的时间点。为了进一步证实环丙胺预处理导致的第7天表型是由于再生受损，而不是更严重的初始损伤所致，我们量化了水杨酸处理小鼠与水杨酸加环丙胺处理小鼠的淀粉酶表达的横截面积（参见补充图4D–G型在线时间：网址：www.gastrojournal.org). 使用共焦显微镜，我们比较了服用和不服用环胺的小鼠在第2天和第7天蓝蛋白损伤胰腺组织中DAPI和淀粉酶的表达，并在复制的2D光学切片上生成荧光强度剖面。我们发现天蓝蛋白与天蓝蛋白加环胺处理的小鼠在第2天淀粉酶表达缺失方面没有定量差异（参见)但在第7天确实观察到淀粉酶表达的显著差异，反映了在Hh途径抑制的情况下再生受损（参见补充图4D–G型在线时间：网址：www.gastrojournal.org，请参阅).
Hh信号传导的遗传中断会导致蓝绿色损伤后组织再生受损。面板A–L：注射PBS或蓝绿色素后第2天、第3天和第7天的小鼠胰腺代表性H&E染色切片。胰腺组织取自任一野生型(重量) (面板A–C),Pdx1-芯；平滑飞行/飞行(面板D–F),Elastase1-CreER弹性纤维T2段;平滑飞行/飞行(面板G–I)，或Elastase1-CreER弹性纤维T2段;平滑液体/重量(面板J–L)老鼠。在面板A–CPBS处理的野生型小鼠没有组织反应。类似地，他莫昔芬诱导的Ela-CreERT2；平滑液氧/重量杂合小鼠(面板J–L)，保留平滑功能，证明组织再生反应与用天蓝蛋白治疗的野生型小鼠相同（参见)损伤高峰出现在第2天，第7天接近完全再生。相反，Hh信号的中断贯穿整个上皮细胞室(Pdx1-芯；平滑飞行/飞行小鼠），或仅在腺泡细胞中(Elastase1-CreER弹性纤维T2段;平滑飞行/飞行小鼠）导致与环胺治疗后观察到的再生反应相同的受损再生反应。面板M和编号：使用2D荧光强度曲线量化初始损伤和随后的再生，如补充图3（请参见补充图3在线时间：网址：www.gastrojournal.org. (M（M）)在第2天，各组的淀粉酶染色也出现了类似的减少，表明各组的初始蓝蛋白介导的损伤的严重程度相似。(N个)在药物或基因阻断Hh信号的情况下，未能在第7天再生淀粉酶表达细胞。环磷酰胺系统性阻断Hh信号传导或缺失平滑无论是胰腺上皮还是腺泡细胞，都会导致外分泌细胞团再生失败。
受损的外分泌再生伴随着异常持续的胰岛外Pdx1-表达，6,24这意味着即使在血清损伤后第7天，仍存在具有祖细胞样表型的化生上皮(). 如前所述，4表达Pdx1的化生病变为淀粉酶阴性和E-cadherin阳性，证实其上皮性质；损伤区域内偶尔存在淀粉酶、E-cadherin和Pdx1共存的腺泡结构，表明它们是腺泡的衍生物。这些数据表明，虽然Hh信号不影响损伤的初始严重程度，也不是化生损伤形成所必需的，但Hh通路活性是腺泡细胞团有效再生所需的后续“再分化”事件所必需的。
在芥蓝蛋白损伤后第7天，在药物阻断Hh信号的情况下，表达Pdx1的胰岛外化生中间体在芥蓝蛋白胰腺炎中的持续性。保留Hh活性的小鼠胰腺中Pdx1的表达仅限于胰岛细胞。相反，在Hh封锁的情况下(Cae公司+周期)，可见核Pdx1标记的持久化生中间产物（E-cadherin阳性，淀粉酶阴性）(绿色通道). 化生中间体的腺泡衍生是由损伤区域内偶尔存在的淀粉酶、E-钙粘蛋白和Pdx1共表达腺泡结构所提示的。Pdx1标记在上皮细胞室中的特异性通过Pdx1-表达的存在得到证实(箭头)和Pdx1-负极(箭头)同一字段中的结构。
外分泌胰腺Hh信号的遗传消减也与再生障碍有关
为了证实环胺诱导的受损再生是Hh特异性的，也为了确定需要Hh信号的特定细胞类型，我们研究了另外两种抑制Hh通路的遗传策略。这两种策略都基于以下既定发现：平滑的是Hh的关键信号传感器，因此平滑的功能导致Hh活性消失。23使用克里驾驶老鼠消融漂浮物平滑的等位基因遍布整个胰腺上皮（Pdx1-Cre公司)或特定于成人腺泡细胞（Ela-CreERT2段)，我们评估了Hh信号转导的基因中断对蓝绿色损伤后胰腺再生的影响。在Pdx1中-Cre公司;平滑（Smo）flox/flox公司老鼠，Cre公司-Smoothened通过发育中的胰腺上皮介导丢失，导致多种上皮细胞系（腺泡、导管和胰岛）缺乏Hh信号。没想到Pdx1的胰腺-Cre公司;平滑（Smo）flox/flox公司小白鼠出生时不明显，在整个研究期间（6-8周；数据未显示），年轻成年小白鼠的情况一直如此，这意味着上皮细胞特异性Hh信号缺失对正常胰腺发育可能是不必要的。事实上，如下文所述，这些胰腺中唯一可识别的表型是在蓝斑损伤后发现的。同样，三苯氧胺诱导的Ela的胰腺-Cre公司急诊室T2段;平滑（Smo）flox/flox公司在没有天蓝蛋白介导的损伤的情况下，小鼠表现平平。相反，接受多系或腺泡细胞特异性治疗的小鼠克里-介导性缺失平滑的表明外分泌损伤后再生反应受损，与使用环胺治疗后观察到的情况相同(). 相比之下，Ela-Cre公司急诊室T2段;平滑（Smo）氟/重量小鼠，保留功能平滑的等位基因，显示出与野生型天蓝蛋白治疗小鼠相同的组织再生反应，第2天损伤达到峰值，第7天恢复到基线(). 定量图像分析证实了这些形态学观察结果()其中，在第2天，在所有4个治疗组中观察到淀粉酶表达的类似损失（仅天蓝蛋白、天蓝蛋白加环胺、Pdx1天蓝蛋白-Cre公司; 平滑（Smo）flox/flox公司背景和天蓝蛋白对他莫昔芬诱导的Ela的影响-Cre公司急诊室T2段;平滑（Smo）flox/flox公司背景），证实初始损伤的强度没有差异。相比之下，到第7天，天蓝蛋白治疗的野生型小鼠的外分泌再生恢复到基线水平，而药物或基因阻断Hh信号的小鼠继续表现出分化外分泌细胞的严重丢失。
讨论
与之前的报告类似，5,8我们的研究表明，分化的弹力酶表达细胞是成年小鼠胰腺再生胰腺上皮的来源，进一步证明这些细胞需要完整的Hh途径才能有效再生腺泡细胞团。与Hh被认为负责建立祖细胞身份和调节祖细胞数量的其他组织相比，10,11,18,25,26Hh信号在白细胞介导的损伤后的作用似乎仅限于对祖细胞的调节功能特别是去分化腺泡细胞促进组织更新的能力。事实证明，即使在药物或基因Hh阻断的情况下，腺泡细胞仍然能够充分增殖以应对损伤（参见补充图5在线时间：网址：www.gastrojournal.org). 然而，在缺乏Hh信号的情况下，这些表达胰腺祖细胞标记物的化生中间产物表现出无法再分化，损害组织修复过程。尽管这些数据表明，分化的外分泌细胞代表了蓝绿色损伤后再生外分泌上皮的主要来源，但它们当然不排除存在一个可能被其他形式损伤激活的专门祖细胞池。
分化细胞类型作为有效祖细胞的能力已经在多种环境中得到了很好的确立，包括肝脏和β-哺乳动物的细胞再生1,三两栖动物的尾巴、四肢和角膜再生。27–29在许多这样的环境中，分化细胞类型至少会经历一些去分化和细胞周期重入的过程，随后产生的祖细胞会增殖扩张，随后分化细胞类型会再生。通过这种方式，分化细胞充当“兼性”或“情境性”祖细胞。Hh信号在调节兼性祖细胞脱分化、增殖和再分化中的作用已在两栖动物尾部再生的背景下进行了详细研究。27axolotl蝾螈尾部截肢后，截肢点附近的皮肤和肌肉细胞经历去分化，生成伤口芽基。去分化的胚母细胞随后增殖，然后再分化形成软骨、肌肉和真皮。在这个过程中，胚芽细胞显示Hh途径激活的证据补丁1表达式。当这种Hh信号被环胺阻断时，去分化胚基细胞能够形成，但增殖减少，无法再分化为肌肉或软骨。28同样，对蝾螈晶状体再生的研究表明，Hh是去分化祖细胞增殖和随后再分化形成晶状体纤维所必需的。29
相反，目前的研究结果表明，在哺乳动物胰腺中，Hh信号可能在调节祖细胞样细胞方面发挥更为有限的作用，对腺泡产生的化生中间产物的“再分化”具有主导作用。这种有限的影响可能反映了对其他已知信号通路的依赖，这些信号通路可介导腺泡细胞脱分化和增殖，包括表皮生长因子和Notch通路。表皮生长因子受体配体转化生长因子α在各种形式的胰腺损伤后上调，包括蓝蛋白介导的胰腺炎，30,31以前的研究已经证明了转化生长因子的能力α诱导腺泡细胞去分化并产生巢蛋白表达的祖细胞。6,24Notch通路激活能够诱导类似的脱分化事件，并似乎在腺泡细胞脱分化过程中介导表皮生长因子信号的作用。32鉴于先前报道的天蓝蛋白介导的胰腺损伤后Notch信号的激活，4这种表皮生长因子-缺口轴似乎在胰腺上皮损伤的初始反应中起主导作用。
值得注意的是，我们没有发现腺泡细胞来源的祖细胞对胰岛或导管谱系有任何贡献（参见补充图1和2在线时间：网址：www.gastrojournal.org). 尽管这可能反映了胰岛和导管元件在很大程度上不受天蓝素给药的影响，但涉及直接胰岛损伤的其他研究同样未能确定腺泡细胞向非腺泡细胞命运的体内“转分化”，5与体外培养腺泡细胞的结果对比。33结合Strobel等人最近的研究，证实体内成熟胰岛细胞缺乏转分化为腺泡谱系的能力，8可以假设，胰腺中成熟隔室的“转分化杂乱性”就部分而言是相当有限的。换言之，虽然不能排除某些类型损伤中的转分化事件，至少在蓝斑胰腺炎的情况下，”腺泡生腺泡在当前的研究中，腺泡细胞的基因标记证实了它们的去分化作用，从而产生短暂的化生上皮，但未能证明对成熟的导管上皮有任何贡献。许多研究，包括我们自己的研究，34以前曾将这种腺泡细胞脱分化过程称为“腺泡-导管化生”35这反映了化生上皮呈导管样横切面形态，导管上皮中典型表达的细胞角蛋白染色阳性。然而，这种化生上皮也表现出其他在胰腺导管上皮中不正常表达的基因的表达，包括Pdx1页和赫斯1反映了这些细胞的去分化性质。24,32因此，在目前的研究中，我们避免了“腺泡-导管化生”这一术语，而倾向于使用简单的术语“短暂化生中间产物”来指代蓝绿色损伤后产生的短暂病变。
除了提供有关腺泡细胞源性祖细胞生物学的新信息外，目前的研究还提供了有关胰腺肿瘤发生机制的潜在见解。先前的研究表明，Hh途径激活是胰腺癌的一个特征。13,36,37除了外分泌胰腺癌生长所必需的Hh信号外，Hh信号似乎还促进非胰腺胃肠道细胞分化模式。22最近的其他研究表明，成人胰腺中强制激活Hh途径可诱导未分化胰腺癌的形成，并且Hh还与致癌KRAS协同诱导胰腺癌前体。38基于慢性胰腺炎患者患胰腺癌的风险增加16倍的事实，39我们对胰腺外分泌损伤后Hh深度激活的观察可能提供了慢性胰腺损伤与随后的肿瘤发生之间的机制联系。
致谢
由NIH拨款CA113669和DK072532以及Sol Goldman胰腺癌研究中心（A.M.）支持；NIH向S.D.L.授予DK61215和DK56211以及Paul Neumann胰腺癌研究教授职位；德国学术交流服务局博士后项目（DAAD；G.F.）的奖学金；以色列癌症研究基金会的Barbara S.Goodman胰腺癌职业发展奖（授予Y.D.）；对于老鼠饲养成本，由人类癌症老鼠模型联合会向范德比尔特大学的Robert J.Coffey拨款（U01CA084239）。
作者感谢Charles Murtaugh和Ariel Ruiz i Altaba的有益讨论。
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