癌症研究。作者手稿；PMC 2009年4月1日提供。
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CXC趋化因子受体4 COOH末端结构域的缺失导致乳腺癌细胞中细胞间接触的下调、运动性增强和增殖
,2 ,2 ,2 ,2和1,2
上田由纪子
2田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院癌症生物学系
尼科尔·内尔
2田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院癌症生物学系
埃维米·舒蒂泽
2田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院癌症生物学系
达亚尼迪·拉曼
2田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院癌症生物学系
安·里士满
1田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院退伍军人事务部
2田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院癌症生物学系
1田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院退伍军人事务部
2田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院癌症生物学系
转载请求：Ann Richmond，范德比尔特大学医学院癌症生物学系，Preston Research Building 432，23th Avenue South，Nashville，TN 37232。电话：615-343-7777；传真：615-936-2911；电子邮件：ude.tlibrednav@dnomhciR.nnA N.F.Neel和E.Schutyser对本文的贡献几乎相同。
- 补充资料
表1。
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表2。
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摘要
CXC趋化因子受体4（CXCR4）有助于人类乳腺癌细胞的转移。CXCR4 COOH末端结构域（CTD）似乎在调节受体脱敏和下调中起着重要作用。我们在MCF-7人乳腺癌细胞中表达野生型CXCR4（CXCR4-WT）或CTD-截断型CXCR4-（CXCR4-ΔCTD），以确定CTD是否参与CXCR4-调节乳腺癌细胞的增殖。CXCR4-WT转导的MCF-7细胞（MCF-7/CXCR4-WG细胞）在形态或生长速度上与载体转导的对照细胞没有差异。然而，CXCR4-ΔCTD-转导的MCF-7细胞（MCF-7/CXCR4-△CTD细胞）表现出较高的生长速度和形态改变，可能表明上皮细胞向间充质细胞的转变。此外，细胞外信号调节激酶（ERK）激活和细胞运动在这些细胞中增加。配体诱导这些MCF-7细胞中CXCR4-WT和CXCR4-ΔCTD与β-arrestin的受体结合。过表达的CXCR4-WT主要定位于未刺激细胞的细胞表面，而过表达的CXCR4-ΔCTD的很大一部分位于细胞内循环内体中。人类寡核苷酸芯片、Western blot和免疫组织化学分析表明，E-cadherin和闭塞带在MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中表达下调。阵列分析还表明，MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中的间充质标志蛋白和某些生长因子受体上调。这些观察结果表明：（a）CXCR4-ΔCTD的过度表达导致CXCR4-介导的信号通路功能丧失，（b）CXCR4-WT的CTD可能在该信号通路中发挥反馈阻遏作用。这些数据将有助于我们了解CXCR4-ΔCTD如何促进乳腺肿瘤向转移病灶的进展。
介绍
趋化因子及其受体在指导细胞运动和基因表达方面很重要(1,2). 根据NH上前两个半胱氨酸残基的构型，趋化因子分为（CXC）、（CC）、（C）和（CXXXC）亚类2终点(三). 从骨髓基质细胞中分离出CXC配体12（CXCL12）或基质细胞衍生因子-1（SDF-1），并将其表征为前B细胞生长刺激因子(4). CXCL12的受体是CXC趋化因子受体4（CXCR4），它对B细胞淋巴生成至关重要(4)、胃肠道血管化(5)神经元和生殖细胞迁移(6)以及HIV对宿主细胞的侵袭(7–9). CXCR4基因敲除小鼠表现出多种致命缺陷，包括B细胞淋巴细胞和骨髓造血异常，以及小脑神经元迁移的改变(5,10). 此外，CXCR4在不同类型的恶性肿瘤中广泛过度表达，包括淋巴瘤、癌和肉瘤(1,11). 因此，CXCR4的正常表达对胚胎发育和正常细胞增殖是必要的，但其不受调控的表达与肿瘤进展相关。
CXCR4与所有其他趋化因子受体一样，是一种七膜G蛋白偶联受体（GPCR）。GPCR的激活导致异源三聚体G蛋白的激活，该蛋白与受体分离并启动第二信使信号(12,13). GPCR还通过位于其细胞内COOH末端结构域上的共有结构域与许多其他蛋白质相互作用（CTD；参考文献。14). β-Arrestin与许多GPCR（包括CXCR4）的CTD结合，调节受体的功能(15). 通常，当CTD中的丝氨酸和可能的苏氨酸残基被磷酸化时，GPCR/β-arrestin复合物稳定，这一事件与G蛋白介导的信号传导的受体脱敏有关。然而，GPCR/β-arrestin复合物的形成通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活导致新信号的传播，例如c-Jun NH2-末端激酶3（JNK3）、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和p38 MAPK(16–18). GPCR/β-抑制素复合物与相互作用蛋白的结合，如网格蛋白和适配蛋白-2（AP-2），增强了GPCR的内化和转运(16,17). CXCR4的CTD截短发生在患有WHIM综合征的杂合子个体（疣、低丙种球蛋白血症、感染和骨髓增生；参考文献。19). 因此，CXCR4的CTD在细胞内信号传导中起着重要作用，尽管具体机制尚不清楚。
在转移性乳腺癌中，CXCR4过表达使肿瘤细胞侵袭细胞外基质并进入循环系统(20). 因此，CXCL12-CXCR4趋化途径是乳腺癌的潜在治疗靶点(21,22). 为了了解CTD介导的人类乳腺癌细胞CXCR4调控的机制，用野生型CXCR4（CXCR4-WT）或CTD-截断型CXCR4cDNA（CXCR4-ΔCTD）转导MCF-7细胞。CXCR4-ΔCTD在质膜上与β-抑制素相互作用，在内化时积聚在核周隔室，表达这种截短受体的MCF-7细胞表现出E-cadherin和闭塞带（ZO）-1表达的急剧减少。使用人类30000寡核苷酸阵列分析，我们观察到CXCR4-ΔCTD转导的MCF-7细胞（MCF-7/CXCR4-△CTD细胞）中间充质标记相关基因上调。通过这些数据，我们得出结论，MCF-7/CXCR4-ΔCTD乳腺癌细胞表现出更强的运动能力和增殖能力，同时伴有受体运输和基因表达的改变。
材料和方法
细胞培养和试剂
MCF-7细胞和人类胚胎肾（HEK）293T细胞（购自弗吉尼亚州马纳萨斯市美国类型培养库）保存在补充10%热失活FCS和2 mmol/L的DMEM中L（左）-谷氨酰胺。细胞在37°C和5%CO的增湿空气中培养2。所有组织培养试剂均来自Life Technologies，Inc.（马里兰州罗克维尔）。
质粒构建与蛋白表达
cDNA构建体HA-CXCR4-WT-pcDNA 3.0（参考文献。15; 中国上海大学裴刚博士）被用作PCR模板。利用这些构建物，分别用相同的正向引物5′-ATTCCGGA-ATTCATGGAGGGATCAGTATATATAC-3′和两个不同的反向引物5’-AATCCGCTCCGAGTAGCTGGAGTGAAAAC-3′和5′-AATCCCGCTCGAG-TTAAGTGTGGAGAGAAC-3′扩增出全长CXCR4 cDNA和不含HA-tag序列的CXCR4/ΔCTD cDNA。PCR产物（1071和967 bp）用限制性内切酶消化生态RI公司/Xho公司一、 通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并连接到加里·诺兰博士（加利福尼亚州斯坦福大学）提供的逆转录病毒表达载体pBMN-内部核糖体进入序列（IRES）增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。DNA结构经双脱氧测序验证。
包装假逆转录病毒，HEK 293T细胞（5×106/100 mm培养皿）转染5μg(一)pBMN-CXCR4-WT-IRES-EGFP(b条)pBMN-CXCR4-ΔCTD-IRES-EGFP，或(c)使用FUGENE 6（印第安纳波利斯罗氏分子生物化学公司）控制质粒pBMN-IRES-EGFP。它们与3μg pHCMV-g（VSV-g）和3μg p SV-Ψ-env共转染−MLV（pSV-pol/gag）由Jane Burns博士（加利福尼亚大学圣地亚哥分校）提供。在转染后48小时收集含病毒培养基，用0.45μm过滤器（纽约州东山市Pall公司）纯化，并用于感染MCF-7细胞（105/60-mm培养皿）2小时。传代5代后，流式细胞仪对稳定表达EGFP的细胞进行分选和扩增。
免疫印迹分析
细胞裂解、蛋白质分离、SDS-PAGE和免疫印迹已在前面描述过(23). 使用Odyssey系统（LI-COR Biotechnology，Lincoln，NE）扫描Alexa染料结合二级抗体（加利福尼亚州卡尔斯巴德市分子探针）发出的红外光谱，从而显示免疫反应蛋白。使用的抗体（200 ng/mL）为αE-cadherin（610181，BD Biosciences，加利福尼亚州帕洛阿尔托）、αZO-1（610966，BD bioscience）、αERK2（sc-1647，圣克鲁斯生物技术，加利福尼亚州圣克鲁斯）和α磷酸化ERK1/2（V-8031，普罗米加，麦迪逊，威斯康星州）。在细胞裂解之前，用50μmol/L MAPK激酶（MEKK）抑制剂PD98059（Calbiochem，Darmstadt，Germany）或100 ng/mL CXCL12（人SDF-1α，PeproTech，Rocky Hill，NJ）处理一些细胞3小时。
3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化盐细胞增殖试验
细胞在完全生长培养基中培养5天，每2天补充一次。在三个孔中添加3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）作为线粒体脱氢酶的底物，并培养4小时。根据标准方案监测酶活性。标准化吸光度值随倍数增加而绘制。
细胞运动/趋化性测定
使表达CXCR4-WT、CXCR4-ΔCTD或空表达载体对照的MCF-7细胞在含有完整生长培养基的六孔板中的玻璃盖玻片上汇合，并用移液管尖端刮擦以形成伤口。伤后18小时用显微镜观察伤口愈合情况。
如前所述，使用96 well室和聚碳酸酯膜过滤器（Neuroprobe，Gaithersburg，MD）测量趋化性和趋化性(24).
酶联免疫吸附试验
细胞在12孔板中培养至80%汇合，清洗，并在完整的生长培养基中培养18小时。收集培养基并进行CXCL12 ELISA（Quantikine，R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯）。ELISA值以pg/10为单位按细胞数标准化5细胞。
共焦/免疫荧光显微镜
如前所述对细胞进行免疫染色(23)除非图图例中另有规定。使用的主要抗体为αE-cadherin（610181）、αZO-1（610966）、αCXCR4（克隆12G5、MAB170、R&D Systems）、αCX3R4（克隆44708、MAB171，R&D System）、抗β-arrestin2（sc-6387，Santa Cruz Biotechnology）和αRab11a（田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院James Golderning博士的礼物）。用适当的荧光结合二级抗体观察这些蛋白质。荧光图像在蔡司Axiophot立式显微镜和LSM-510 Meta激光扫描显微镜（Carl Zeiss MicroImaging，Inc.，Thornwood，NY）上捕获。
荧光激活细胞分选分析
用冷PBS清洗细胞，并用细胞分离缓冲液（生命技术）培养，直到细胞被举起。用αCXCR4抗体（12G5，MAB170）标记细胞1小时，然后用藻红蛋白（PE）结合的α-小鼠IgG培养细胞（Jackson ImmunoResearch，Westgrove，PA）。为了监测初级和次级抗体的背景染色，将细胞与正常小鼠IgG（sc-2025，Santa Cruz Biotechnology）孵育，然后再与PE-结合α-鼠IgG孵育。用FACSCalibur流式细胞仪（马萨诸塞州曼斯菲尔德Becton Dickinson）对细胞进行清洗，共对20000个染色细胞进行分析。
cDNA阵列分析
用TRIzol试剂（Life Technologies）分离总RNA，电泳以测量RNA完整性，用无RNase DNA酶处理，并反转录成cDNA。根据下列方案，CXCR4-WT转导的MCF-7细胞（MCF-7/CXCR4-WC细胞）的cDNA用Cy5标记，而MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的cDNA则用Cy3标记网址：http://www.vmsr.net将标记的cDNA与人类30000个寡聚微阵列杂交，并在范德比尔特微阵列实验室进行数据分析。或者，使用地高辛标记将相同的RNA反向转录成cDNA，并将该cDNA单独杂交到ABI平台人类微阵列（32878个探针；加利福尼亚州福斯特市Applied Biosystems公司）。
逆转录PCR
DNA酶处理的RNA（1μg）变性，然后逆转录。合成的cDNA（1μL）用PCR扩增(一)甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物(b条)CXCR4 5′末端序列的引物集，以及(c)CXCR4 3′末端序列的引物。
结果
使用逆转录病毒载体在MCF-7细胞中过度表达CXCR4-WT和CXCR4-ΔCTD
为了构建cDNA结构来检测CXCR4在乳腺癌细胞中CTD的功能意义，我们扩增了(一)CXCR4-WT cDNA（1071bp），编码CXCR4氨基酸1-353和(b条)CXCR4-ΔCTD cDNA（967 bp）编码1到318个氨基酸。将这些cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pBMN-IRES-EGFP中，并转导到MCF-7乳腺癌细胞中(). 为了确认这些转导基因的mRNA表达水平，分离RNA(,顶部)并反向转录成cDNA。用PCR扩增cDNA(一)GAPDH底漆组(b条)CXCR4 5′-末端的引物组（21-485 nt），以及(c)CXCR4 3′-末端的引物组（425–1040 nt；,中间的). 413 bp GAPDH PCR产物显示出相同的强度(车道1–4)，表明使用了相同数量的RNA(,底部). 在MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的cDNA模板上扩增了465-bp的PCR产物（5′端），616-bp的DNA片段（3′端）来自MCF-7/CX3CR4-WT细胞，表明CXCR4-WD或CXCR4-△CTD的转录物分别过表达(,底部). 后一组CXCR4引物扩增了来自MCF-7、MCF-7/Vector和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的极少量cDNA，这表明这些细胞中内源性CXCR4 mRNA水平较低(，底部). 未进行逆转录的对照样品未产生PCR产物(有限公司在里面，底部).
MCF-7细胞中CXCR4-WT和CXCR4-ΔCTD的过度表达。A、，重组逆转录病毒载体pBMN-IRES-EGFP的图谱。将编码CXCR4-WT（1071 bp）和CXCR4-ΔCTD（967 bp）的PCR产物亚克隆到载体中。长期风险，长末端重复；Psi（ψ），病毒包装的一致序列。B、 顶部，琼脂糖凝胶电泳后溴化乙锭染色RNA。从（1）MCF-7细胞、（2）载体转导的MCF-7（MCF-7/vector）细胞、（3）MCF-7/CXCR4-WT细胞和（4）MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中分离出总RNA。28秒和18秒，rRNA；EB、，溴化乙锭。中部，设计用于扩增CXCR4 cDNA的PCR引物集。使用CXCR4 5′末端的引物集扩增465 bp的CXCR4 cDNA片段（21–485 nt），使用3′末端的引物集扩增616 bp的CXCR4 cDNA片断（425–1040 nt）。底部，溴化乙锭染色逆转录-PCR产物。DNase处理的RNA（1μg）在70°C下变性5分钟，然后在25μL含有1μmol/L寡聚物（dT）的反应混合物中逆转录16引物、带有AMV-RT缓冲液（Promega）的5单位禽成髓细胞病病毒（AMV）逆转录酶（AMV-RT）和0.2 mmol/L脱氧核苷酸三磷酸。用GAPDH引物（5′-TCATTGACCTCAACTATG-3′和5′-GAGTCCTCCACGATACACAA-3′，PCR产物：413 bp，110–522 nt，在NM_002046的开放阅读框中）通过PCR扩增合成的cDNA（1μL），CXCR4′（5′-CACTTCAGAATAACTACCG-3′和5′-ATCCAGACGCACACACATAGAC-3′，PCR产物：465 bp，21–485 nt，在NM_003467的开放阅读框中）5′末端序列的引物集，以及CXCR4的3′端序列的引物集（5′-CAACAGTCAGAGGCCAAGG-3′和5′-GAAGACTCAGACTCAGTGG-3′，PCR产物：616 bp，425–1040 nt）。PCR反应进行了三次。代表性凝胶。
MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞失去细胞间接触
分选GFP阳性细胞后，MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞在5～10代的过程中从上皮-间充质（EMT）样细胞形态发生变化。然而，MCF-7/Vector和MCF-7/CXCR4-WT细胞与MCF-7亲代细胞保持相同的上皮形态。事实上，GFP发射图像显示MCF-7/Vector和MCF-7/CXCR4-WT细胞的形态是上皮性的。然而，MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞表现出细胞与细胞之间的接触丧失，细胞膜的拉长皱褶边缘表明有跛足形成。为了分析细胞间接触的形成，用抗紧密连接蛋白ZO-1的抗体对细胞进行染色。在MCF-7/Vector和MCF-7/CXCR4-WT细胞中可以清楚地观察到ZO-1的存在，但在MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中没有(). 我们还分析了上皮细胞连接的粘附分子E-cadherin的表达。E-cadherin在MCF-7/Vector和MCF-7/CXCR4-WT细胞中明显存在，但在MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中不存在(). 免疫印迹分析证实MCF-7/CXCR4-ΔCTD中E-cadherin和ZO-1的下调(). 这些结果表明，MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的形态学变化与细胞连接相关分子如ZO-1和E-cadherin的下调一致范德比尔特人类遗传学核心实验室。使用八种不同探针的SNP-PCR显示，MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的遗传背景与用于逆转录病毒包装的HEK 293T细胞相同，但显著不同（数据未显示）。
MCF-7/CXCR4-ΔCTD失去电池间接触。A、，下调MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中ZO-1的表达。将MCF-7/Vector、MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞镀在玻璃盖玻片上，固定、渗透并用αZO-1抗体染色，然后用Alexa 594结合小鼠IgG（一种二级抗体）染色。代表Z轴-多个单独实验的切片图像（0.1μm厚）。B、，MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞E-cadherin的下调。将MCF-7/Vector、MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞镀在玻璃盖玻片上，并按照上述方法进行处理。细胞用αE-钙粘蛋白染色(电子cad)抗体随后是Alexa 594结合的α-小鼠IgG。代表Z轴-多个单独实验的切片图像（0.1μm厚）。C、，用SDS-PAGE分离MCF-7/Vector、MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的蛋白裂解产物并转移到硝化纤维膜上。在大约60-kDa标记处将膜切割成两块，其中包含高或低分子量蛋白质。用αE-cadherin或αZO-1抗体对膜上的蛋白质进行免疫印迹分析，然后用Alexa 680-共轭α-小鼠IgG检测高分子量蛋白质，或用α-actin抗体检测低分子量蛋白质，然后用Alexa 680共轭α-山羊抗体。使用Odyssey系统扫描发射的红外图像，显示免疫反应带。
CXCR4-ΔCTD细胞内定位增强
为了阐明与MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞形态学改变相关的事件，我们比较了过度表达的CXCR4-WT和CXCR4-△CTD的定位。αCXCR4抗体（克隆12G5，MAB170）免疫染色显示，在MCF-7/CXCR4-WT细胞中，受体广泛分布于细胞表面(). 然而，在>80%的MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中，与细胞表面相比，受体强烈定位在细胞内区域().
CXCR4-WT和CXCR4-DCTD的亚细胞分布和贩运。A、，CXCR4-ΔCTD显示细胞内定位增加。MCF-7/Vector、MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞在完全生长介质中的玻璃盖玻片上生长，固定、渗透并用αCXCR4抗体（克隆12G5，MAB170）染色，然后用Alexa 594结合的α-小鼠IgG染色。使用蔡司Axiophot立式显微镜，使用0.1μm Z堆叠捕获荧光图像。如图所示，使用抗体通过FACS分析来分析细胞表面上CXCR4的表达。B、，截断的CXCR4与内源性β-抑制素（β-阿珥). 在37°C下，隔夜用血清饥饿细胞，并用/不用500 ng/mL CXCL12刺激细胞5分钟。细胞用4%多聚甲醛固定，用0.2%Triton X-100渗透。用小鼠单克隆抗体（克隆12G5，MAB170）和山羊多克隆抗β-arrestin2抗体（与β-arristin1，sc-6387的交叉反应较小）β-arretin2探测CXCR4。用Cy3驴抗鼠抗体（715-165-150，Jackson ImmunoResearch）观察受体，并通过兔抗羊抗体（BA-5000，Vector Laboratories，Burlingame，CA）和Cy5驴抗兔抗体（711-175-152，Jackson-ImunoResourch）的顺序结合观察β-arrestin2。白色箭头，在转导的MCF-7细胞中CXCR4受体和β-受体2共定位的小泡。
C、，改变了CXCR4-ΔCTD的贩运和分布情况。隔夜血清饥饿，用载体[0.1%牛血清白蛋白（BSA）/PBS刺激细胞；未经处理]或500 ng/mL CXCL12 30或60分钟。采用αCXCR4（克隆44708，MAB171）和αRab11a进行免疫荧光染色，共聚焦成像，切片厚度为0.48μm。叠加图像是伪彩色的。红色，CXCR4；绿色，拉布11a。
外荧光图像显示的CXCR4的差异分布与荧光激活细胞分类分析中CXCR4细胞表面标记一致。用正常IgG标记的对照组MCF-7/Vector、MCF-7/CXCR4-WT或MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的荧光强度没有任何变化(，底部). αCXCR4抗体（克隆12G5）与MCF-7/CXCR4-WT细胞结合，增加了PE的平均发射水平。然而，在MCF-7/CXCR4-ΔCTD和MCF-7/CX3CR4/载体细胞中PE的发射水平相似(，底部).
为了探讨β-抑制素是否调节CXCR4的贩运，用CXCL12刺激MCF-7/Vector、MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞，并用共焦显微镜研究CXCR4和内源性β-抑止素的定位模式。在未刺激的MCF-7/载体细胞中，CXCR4的染色很低，内源性β-抑制素主要分布在细胞质中，少量分布在质膜上(，顶行). 由于CXCR4在MCF-7/载体细胞中的染色非常微弱，因此未确定β-抑制素与CXCR4的配体激活共定位。在未刺激的MCF-7/CXCR4-WT细胞中，WT受体定位于质膜，但受体与β-抑制素没有明显的共定位模式。CXCL12-激活CXCR4-WT受体进入靠近质膜的细胞内小室，这种模式表明在几个离散的小泡中与β-抑制素共定位(). 在未经刺激的MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中，截断受体主要分布在核周隔室（扩散染色模式）和膜皱褶处。β-arrestin也主要位于核周区域和前沿，并与这些前沿的截短受体共定位(). CXCL12激活时，截短的受体定位于质膜下方和核周区域的小泡。免疫染色模式表明截断受体与β-抑制素在这些囊泡中共定位().
另一种αCXCR4抗体（克隆44708，MAB171）似乎可以识别内小体室中的受体构象，用于检测MCF-7细胞中CXCR4的内小体运输。该CXCR4抗体确实显示出载体控制细胞的一些染色，而克隆12G5（MAB170）没有。在没有CXCL12的情况下，CXCR4-WT定位在质膜上，而CXCR4-ΔCTD主要与Rab11a共定位，Rab11b是再循环内体的标记(). 配体刺激30分钟后，CXCR4-WT受体完全内化到不同的细胞质小泡中，配体刺激60分钟后，受体与Rab11a循环室共定位(). 与WT受体相反，配体处理30分钟后，CXCR4-ΔCTD完全内化并与Rab11a循环室共定位，同时膜褶皱处的受体消失。配体刺激60分钟后，CXCR4-ΔCTD回到膜皱褶，类似于未刺激状态。这些图像表明(一)CXCR4-WT主要在质膜上表达，但CXCR4-ΔCTD主要内化(b条)质膜上的两个受体在CXCL12刺激下内化，并以不同的方式分类到再循环室。这些差异可能由以下两种原因造成(一)CXCR4-ΔCTD在膜上的停留时间更短(b条)CXCR4-ΔCTD内化率较高，或(c)大多数CXCR4-ΔCTD的循环抑制。
MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的细胞运动性增强
与MCF-7/CXCR4-WT细胞或载体转导的对照细胞相比，MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞经常出现跛足形成。为了确定细胞运动的差异在体外进行伤口闭合试验。MCF-7/Vector和MCF-7/CXCR4-WT细胞单层的创伤在创伤后18小时仍未愈合()而此时MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞单层的伤口已经愈合(). 为了确定MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞运动增强是否与较高的CXCL12水平有关，我们通过ELISA分析了CXCL12的内源性分泌。MCF-7/Vector、MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞分泌的CXCL12水平没有显著差异。CXCL12小于100 pg/105在完全生长培养基中培养的细胞()当细胞在无血清培养基中培养时无法检测到（数据未显示）。
MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的运动性增强。A、，伤口闭合细胞运动试验。让MCF-7/Vector、MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞在六孔板中的玻璃盖玻片上的完整生长介质中汇合，然后用吸管尖端划伤(a、 c（c）、和e（电子）). 18小时后用显微镜监测伤口的愈合情况(b、 d日、和（f）). 来自两个单独实验的代表性数据。B、，分泌到培养基中的CXCL12的定量。CXCL12的内源性分泌物（pg/105通过ELISA分析测量来自MCF-7/Vector、MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞在完全生长培养基中18小时的细胞）。未检测到无血清培养基中的ELISA值（数据未显示）。来自两个单独实验的代表性数据。C、，趋化试验。使用96 well小室和10μm孔聚碳酸酯膜过滤器测量化学动力学。将滤膜浸泡在含有1 mg/mL IV型胶原的分析缓冲溶液（含1 mg/mL BSA的DMEM）中2小时。MCF-7/Vector、MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞用细胞分离缓冲液提升，105将200μL趋化性缓冲液中的细胞接种在顶部室中。用50 ng/mL CXCL12在上下室的分析缓冲液中培养细胞。培养4.5小时后，细胞迁移到过滤器底部，并用Diff-Quik（佛罗里达州迈阿密DADE Behring公司）固定。然后用1%结晶紫对其进行染色，并在五个随机场中用放大倍率为200倍的亮场显微镜进行计数。来自三个实验之一的代表性数据。D中，趋化试验。趋化试验的条件/准备与上述趋化试验相同，只是0至250 ng/mL CXCL12仅添加在下室中。三个实验之一的代表性数据。
为了进一步评估CXCR4-ΔCTD细胞的运动增强，进行了趋化性和趋化性分析（浓度范围为0–250 ng/mL CXCL12）。与MCF-7/CXCR4-WT或载体转导的对照细胞相比，MCF-7/CXCR4-ΔCTD表现出7到8倍的运动能力，与CXCL12的存在无关(). MCF-7/CXCR4-WT细胞对CXCL12产生趋化反应，呈现典型的正态分布()而MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞即使没有CXCL12也表现出较高的运动能力，并且对CXCL12梯度基本没有反应().
MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的增殖和ERK活化增强
在这些培养物的维持期间，MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的增殖速度似乎快于MCF-7/Vector或MCF-7/CXCR4-WT细胞。因此，这些细胞的生长通过MTT分析在5天内进行监测。在MTT试验中，MCF-7/Vector和MCF-7/CXCR4-WT细胞的生长速度相似，但MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的生长速率较高(). MCF-7/Vector和MCF-7/CXCR4-WT细胞的估计加倍时间为50小时，而MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的加倍时间为35小时。通过计算细胞数量确定的MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的增殖率也高于MCF-7/Vector或MCF-7/CXCR4-WT细胞（数据未显示）。
MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞增殖增强。A、，MCF-7/Vector、MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞的MTT分析。细胞被放置在24孔板（2×104每5天用MTT孵育4小时。将产物formazan晶体溶解在含有0.4 N盐酸的异丙醇中，并使用分光光度计测量570 nm处的吸收。通过减去590 nm处的非特异性吸光度，对每个吸光度测量值进行归一化。SE是使用三个重复井的数据得出的。第0天的归一化吸光度值设置为1，以下归一化测量值表示为倍增。细胞培养期间，每2天更换一次培养基。来自三个单独实验的代表性数据。B类和C、，CXCR4-ΔCTD细胞中构成性ERK2激活。细胞裂解前，用50μmol/L MEKK抑制剂PD98059或100 ng/mL CXCL12（人SDF-1α）处理细胞3小时。使用的抗体（200 ng/mL）为αERK2（sc-1647）和α磷酸化ERK1/2（V-8031）。通过使用Odyssey系统扫描Alexa 680和Alexa 800结合二级抗体的发射红外图像，可以显示免疫反应蛋白带。
由于乳腺癌中细胞增殖与ERK激活之间有很强的相关性，因此我们在CXCR4表达的MCF-7细胞中检测了ERK在有/无50μmol/L MAPK激酶抑制剂PD98059的情况下的激活。结果表明，与MCF-7/Vector和MCF-7/CXCR4-WT细胞相比，MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中磷酸化ERK水平显著升高(). CXCL12的加入在MCF-7/CXCR4-WT中诱导ERK激活，但在MCF-7/载体细胞中没有().
基因表达的微阵列分析显示，MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中与间充质细胞相关的基因上调，与上皮细胞相关的蛋白下调
为了了解MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中细胞间接触缺失的可能原因，我们使用人类30000微阵列分析了这些培养物中差异表达的基因。对总RNA进行电泳以测量RNA完整性(). 根据两个标准选择人类寡核苷酸阵列数据：(一)差异表达表示为Cy5/Cy3强度比大于3且(b条)差异表达基因的功能已经确定。在补充数据I比较MCF-7/CXCR4-WT细胞和MCF-7/载体细胞中的基因表达，列出了967个上调基因和991个下调基因。在补充数据II比较MCF-7/CXCR4-WT细胞和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中的基因表达，列出2062个上调基因和2415个下调基因。在这些差异表达基因中，CXCR4在MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中表达上调(). MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中E-cadherin、ZO-3和ZO-1表达下调()，支持在和在该阵列分析中，探索了可能与细胞增殖和EMT相关的差异表达基因，并绘制了这些基因之间的关系图(). 在MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中，细胞极性蛋白基因PAR-6表达下调，但间充质标志物，包括波形蛋白（VIM）、纤维连接蛋白-1（FN1）和SNAIL同源物-2（SNAIL-2）表达上调。在MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中，生长因子受体，包括表皮生长因子受体（EGFR）、成纤维细胞生长因子受体-1（FGFR1）和转化生长因子β受体I和II（TGFBR1和TGFBR2）也上调。我们使用相同的人类30000基因阵列（Vanderbilt Microarray Core Laboratory）和不同的人类微阵列系统ABI平台（32878个探针）重复了阵列分析，获得了相似的差异表达基因图谱（数据未显示）。
差异基因表达显示MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中间充质相关基因上调，上皮相关基因下调。A、，RNA完整性指数。从MCF-7/Vector、MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/ΔCTD细胞中分离出总RNA，并用DNA酶处理。真核生物总RNA Nano-DE114000902中的RNA电泳得出99%的RNA完整性指数值。B、，通过微阵列分析确定的差异表达基因列表。用Cy5标记将MCF-7/CXCR4-WT衍生的总RNA反转录到cDNA中。用Cy3标记将MCF-7/载体衍生RNA和MCF-7/CXCR4-ΔCDT-衍生RNA反转录到cDNA中。将标记的cDNA与人类30000寡核苷酸阵列杂交，并使用GeneSpring软件分析荧光比率Cy5/Cy3。中的数组数据补充数据表示为比较MCF-7/CXCR4-WT细胞和MCF-7/载体细胞中的基因表达，以及比较MCF-7/CXCR4-WT-细胞和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中基因表达的基因表达的倍数变化。表中列出了该阵列分析中可能与细胞增殖和EMT相关的基因，并绘制了这些基因之间的关系图().重量，MCF-7/CXCR4-WT细胞；ΔCTD，MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞；矢量，MCF-7/载体细胞；↔, Cy5/Cy3的差异表达率不显著（<3倍）。在补充数据I和二，列出了所有表达差异大于3倍的上调或下调基因。
讨论
在极化上皮中，紧密连接和粘附连接维持相邻细胞之间的细胞间接触。紧密连接包含通过蛋白质网络连接到细胞骨架的跨膜蛋白质，包括ZO。在上皮粘附连接中，跨膜蛋白E-cadherin通过几个膜下蛋白（包括β-catenin）与肌动蛋白连接。本报告所述的研究表明，MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞表现出EMT样的形态学改变，并伴有E-cadherin和ZO-1的下调(). E-cadherin和ZO1的这种下调非常显著，因为紧密连接和粘附连接中蛋白质复合物的任何分离或下调都会导致细胞运动增加，并对肿瘤进展产生显著影响(25). 事实上，表达CXCR4-ΔCTD的MCF-7细胞表现出运动增强，但失去定向运动反应。先前的研究已经将趋化因子受体的CTD与改变的贩运和对趋化因子的生物反应联系起来。
在没有CXCL12的情况下，过度表达的CXCR4-WT主要存在于细胞表面，而过度表达的CX3CR4-ΔCTD主要定位于细胞内，也与质膜皱褶边缘有关(). 已知许多GPCR在与配体结合后会发生内吞作用(26). 这一途径的具体步骤通常包括(一)GPCR-CTD上丝氨酸残基的磷酸化；(b条)arrestin与磷酸化CTD的结合，其募集网格蛋白和网格蛋白相关的AP-2；和(c)动态素分子对氯氰菊酯包被囊泡的内陷和断裂作用(27,28). 然而，一些在CTD结构域上不能磷酸化的突变GPCR在没有arrestin结合的情况下内化，这表明arrestin-能够结合其他受体结构域，或者β-arrestin对于GPCR内化不是必需的(29,30). 众所周知，CXCR4在没有CXCL12刺激的情况下自发齐聚(31). 事实上，CXCR4在缺乏CXCL12的情况下的组成性内化已在多种细胞系中报道(一)上皮细胞和中性粒细胞(32,33), (b条)T和B细胞(34), (c)皮肤朗格汉斯细胞(35)、和(d日)人造血祖细胞(36). 有趣的是，在大鼠白血病细胞中，转导的CXCR4-ΔCTD也在CXCL12刺激下内化(37). 这些先前的研究表明(一)CXCR4内化作为配体依赖和配体依赖过程发生(b条)CXCR4的CTD可能有帮助，但不是受体内吞所必需的。内部化的GPCR可能经历两种命运之一：降解或再循环回质膜。在arrestin缺乏的细胞中，GPCR被困在核周再循环室中，不能再循环到质膜，这表明GPCR在缺乏arrestin-的情况下可以内化，但不能再循环到细胞表面(38).
在CXCL12刺激的MCF-7/CXCR4-WT细胞中，WT受体以β-阻遏素依赖的方式内化()似乎被分类为膜下的小泡，可能是早期内体。然而，离散细胞质小泡中的受体亚群与β-抑制素没有共定位。这可能是由于WT受体通过替代途径（如脂筏或小窝蛋白介导途径）内化所致(39).
在未刺激的MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中，截短受体的内化速率可能超过导致净优势核周定位的再循环速率，这可能反映了这些细胞中主要的核周定位。相反，在CXCL12刺激的MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中，截短的受体与β-arrestin在质膜附近和核周室的内涵体中的几个离散囊泡中共定位。这些截短的CXCR4蛋白与β-arrestin结合，如这一结果并不奇怪，因为β-arrestin已被证明不仅与CXCR4的CTD结合，而且还与细胞内结构域的第三环结合(40). 在截断CXCR4的情况下，CTD的缺失可能会持续暴露第三个细胞质环，这可能部分解释了配体依赖性内化。对CXCR4-ΔCTD与β-arrestin关联的这种解释与以下观察结果一致：对于GPCR视紫红质，COOH末端的尾巴向后折叠，覆盖处于非活性状态的第三个细胞质环，然后在受体激活时移开以暴露环。
免疫染色显示，在缺乏配体的情况下，大多数过度表达的截短受体共同定位于核周再循环室(). 这些数据表明，在MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中，CXCR4-△CTD可能经历配体诱导的内化和再循环。同样重要的是要注意，CXCR4的CTD结构域与其他GPCR的CTD结构域一样，包含一个降解基序SSLKILSKGK，其中三个赖氨酸残基可以被泛素化。这种配体诱导的泛素化导致CXCR4的溶酶体分选和降解(41). 由于缺乏CTD中包含的降解基序，CXCR4-ΔCTD也可能抵抗泛素介导的降解。这种对泛素介导的降解的抵抗可能导致CXCR4-ΔCTD在回收室中的定位增强。
MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞也表现出ERK的结构性激活(). ERK在不同的激活模式下被完整的GPCR和CTD-截断的GPCR激活：CTD-依赖性ERK激活对配体敏感，但CTD-独立性ERK活化对配体不敏感(42). 已知CTD-结合蛋白β-arrestin可降低G蛋白介导的信号转导并激活ERK(43). 内吞的GPCR/arrestin复合物可以招募多种信号分子，包括激活ERK和JNK MAPK级联的Src家族酪氨酸激酶(43,44). 有趣的是，微阵列分析显示，与CXCR4-WT细胞相比，MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中β-arrestin1的表达增加。
微阵列数据还显示，MCF-7/CXCR4-WT细胞表达下调(一)间充质标志物，如VIM、整合素α6、和FN1，以及(b条)肿瘤标志物，如纤溶酶原激活物和EGFR(). 阵列数据一致表明，在MCF-7/CXCR4-WT细胞中，过度表达的CXCR4沉默了致瘤性进展的下游效应器。过度表达的野生型受体可能保留正常功能，包括负反馈和自我表达能力。WNT-1诱导信号蛋白-3在炎性乳腺癌中发挥抑癌作用(45)并且在MCF-7/CXCR4-ΔCTD中显著下调，这可能开启WNT信号。在我们的微阵列分析中，MCF-7/Vector、MCF-7/CXCR4-WT和MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中WNT信号通路中β-catenin的表达水平没有变化。然而，激活的WNT信号可能会增加β-catenin磷酸化，从而破坏与E-cadherin的结合。MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中E-cadherin表达减少可能会加强β-catentin的核定位。E-cadherin的下调与MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中β-catenin的细胞定位之间的关系有待进一步研究。阵列数据还表明，生长因子受体介导的涉及FGFR1、EGFR、TGFBRI和TGFBRII的信号通路在MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中被激活。尽管人表皮生长因子受体2（HER-2或ErbB2）的表达水平没有显著变化，但在微阵列分析中ErbB2-相互作用蛋白（ErbB2-signaling的激活物）上调，ErbB2-1型传感器（ErbB2-signalization的抑制剂）下调。这表明ErbB2信号也可能在MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中被激活。在MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞中，SNAIL蛋白也上调。SLUG/SNAIL蛋白是E-cadherin启动子的转录阻遏物，受FGFR、TGFBR、EGFR和HER-2受体上调(46). 我们还注意到PAR-6显著下调，PAR-6是MCF-7/CXCR4-ΔCTD细胞紧密连接处的一种顶端-基底极性调节蛋白()这可能导致紧密连接形成中断。
我们发现CXCR4-ΔCTD的存在可能与乳腺细胞ERK的组成性激活有关。这可能传播生长因子受体介导的信号，导致E-cadherin和ZO-1的下调。这并不是一个意外的发现，因为其他突变的GPCR被证明具有组成活性并促进肿瘤发生(47). 已知CXCR4的CTD截短对细胞内信号传导有显著影响体内与我们的研究相反，WHIM综合征患者的淋巴细胞对CXCL12的反应表现出增强的趋化性(19,48). CXCR4/CXCL12介导的趋化性对B细胞淋巴生成至关重要(4)以及HIV对免疫宿主细胞的入侵(7–9). 此外，CXCR4在不同类型的恶性肿瘤中广泛过度表达，包括淋巴瘤、癌和肉瘤(1,11). 我们在这里显示，CXCR4-ΔCTD的贩运模式发生改变，与乳腺上皮癌细胞的增殖和运动增强相关，同时伴有E-cadherin和ZO-1的下调。这些数据清楚地将趋化因子受体的贩运与趋化因子的生物功能反应联系起来，并加强了先前的观察结果，即病毒编码的GPCR以配体诱导依赖的方式组成性地活跃，并且这些受体促进了成瘤性(49).
致谢
拨款支持：国家癌症研究所拨款CA34590和退伍军人事务部。
我们感谢范德比尔特微阵列实验室、范德比特细胞成像共享资源、退伍军人事务流式细胞术资源、James Golderning博士提供的Rab11a抗体、Snjezana Milatovic提供的免疫染色，以及Linda Horton和Kevin Vo提供的实验室协助。
工具书类
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