AMPKβ亚基上的糖原结合域允许激酶作为糖原传感器

糖原制剂抑制不同浓度的纯化AMPK

接下来，我们测试了糖原对从大鼠肝脏纯化的天然AMPK复合物活性的影响(Hawley等人。，1996). 由于它们没有明确的结构，对于所有研究的多糖，我们用完全水解后获得的葡萄糖摩尔数表示浓度。牛肝糖原通过IC完全抑制AMPK₅₀（引起半最大抑制的浓度）30±9 mM葡萄糖当量(图2A） ●●●●。相比之下，大鼠肝糖原的抑制作用要小得多，导致推测的最大抑制只有44%，IC₅₀90±16 mM。尽管本文中显示的大多数AMPK分析都是在200μM AMP存在的情况下进行的，但牛肝糖原在AMP存在或不存在的条件下都受到抑制(图2B） ，尽管在AMP存在的情况下抑制作用似乎更强。

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图2

不同糖原制剂对AMPK的变构抑制作用

（A） 牛和大鼠肝糖原制剂抑制天然大鼠肝AMPK的浓度依赖性；糖原浓度表示为完全水解后产生的葡萄糖。数据已安装到IC₅₀方程式（请参见补充实验程序)，并使用估计的最佳拟合参数生成曲线。

（B） 200μM AMP存在和不存在时牛肝糖原抑制天然大鼠肝脏AMPK的浓度依赖性；曲线如（A）所示。

（C） 牛肝糖原对重组AMPK复合物的抑制作用(myc公司-α1:β1:γ1），含有全长（1-270）或截短的β1亚基，缺乏GBD（172-270）。在CCL13细胞中表达复合物，并在含有或不含有糖原（200mM葡萄糖当量）的测定之前通过免疫沉淀进行纯化。数据为平均值±SEM（n=3）。^∗经t检验，活性与不含糖原的对照组不同（p<0.05）。

（D） 牛肝糖原（200 mM葡萄糖当量）对纯化的天然大鼠肝脏AMPK（α1β1γ1和α2β1γl复合物的混合物）的抑制作用，这些AMPK是使用抗α1、抗α2或抗α1/α2抗体的混合物通过免疫沉淀（IP）回收的，或在没有免疫沉淀的溶液中进行检测的。结果表示为无糖原对照组的活性百分比，数据为平均值±SEM（n=3）。

（E） 牛和大鼠肝糖原制剂与碘络合物的吸收光谱。

我们担心牛肝糖原的更显著抑制可能是因为存在抑制AMPK的污染物，但事实并非如此。首先，糖原没有抑制大鼠AMPK-α1激酶结构域的细菌表达GST融合（数据未显示）。其次，抑制没有发生(图2C） 在人CCL13细胞中表达重组α1β1γ1复合物，其β1亚基中的残基1–171被截短，从而去除GBD(Hudson等人。，2003). 这个实验揭示了另外两个发现。首先，β亚单位截断降低了在无糖原的情况下测得的复合物的总活性。这是以前观察到的(Hudson等人。，2003)尽管解释尚不清楚。其次，当糖原浓度用于图2C（200 mM葡萄糖当量）对纯化的天然大鼠肝脏AMPK产生90%的抑制作用(图2A和2B），糖原（或任何其他测试的碳水化合物；见下文）对重组AMPK的抑制始终<50%。用于天然和重组AMPK的分析条件的关键差异（例如。，图2A和2C）是指，前者用溶液中的激酶进行，后者用重组酶进行myc公司-标记激酶偶联到抗-myc公司抗体，这是从用于表达的细胞内内源性AMPK中去除它所必需的。为了测试糖原的降低作用是否是由于在免疫沉淀物中进行检测而引起的，我们使用了大鼠肝脏AMPK（α1β1γ1和α2β1γl复合物的近似相等混合物），并在溶液中或使用抗α1、抗α2、，或抗α1和抗α2抗体的混合物。结果(图2D） 结果表明，当在再悬浮免疫沉淀中进行检测时，糖原的最大抑制率仅为30%-50%，而在溶液中进行检测的糖原抑制率大于95%。图2D还显示，糖原同样可以抑制从大鼠肝脏纯化的α1β1γ1和α2β1γl复合物。

接下来，我们考虑了牛和大鼠肝糖原制剂抑制效力的差异可能是由于糖原结构的差异。考虑到AMPKβ亚基的GBD与代谢α1→6分支点的酶中发现的结构域有关，很明显，这种差异可能是由于分支内容不同所致。为了检验这一点，我们使用了一种方法，包括分支的酶水解，然后测定得到的线性α1→4链的平均链长。这表明，牛肝糖原的平均链长为13±1（平均±SD，n=3），而大鼠肝糖原平均链长则为23±3（平均±标准差，n=3），表明支点的平均密度低得多。为了用另一种方法证实这种差异，我们分析了碘络合物的吸收光谱。碘和大鼠肝糖原之间的复合物在更高的波长下比牛肝糖原吸收更强，表明平均分枝程度较低(图2E） ●●●●。

GBD中点突变对糖原抑制作用的影响

为了测试干扰糖原与GBD结合的突变是否也影响糖原对AMPK的抑制，我们在CCL13细胞中对与α1和γ1共表达的全长β1进行了突变，通过免疫沉淀通过myc公司标记α1，并在有无糖原的情况下测定激酶活性。通过印迹法（插入图3A） ●●●●。减少糖原与分离GBD结合的所有突变(图1C） 还消除了牛肝糖原的抑制作用。一个可能的例外是L146A，虽然检查了图1C表明这种突变也不能完全消除糖原结合。由于所有这些分析都是在重新悬浮的免疫沉淀物中进行的，因此野生型的抑制程度小于50%，如前一节所述。如已观察到的含有截短β亚单位的重组异源三聚体(图2C） 除K126A外，所有突变都在无糖原的情况下降低了总活性，尽管程度不同。这似乎不是因为突变体在Thr-172的磷酸化程度低于野生型。在另一个实验中，野生型β1、缺失GBD的截断β1（172-270）或W100G/W133A突变与α1和γ1共表达，α1上Thr-172的磷酸化是相同的(图3B） ●●●●。无论是通过“快速裂解”（使用含有清洁剂的冰镇缓冲液原位裂解细胞）还是“缓慢裂解”（在裂解前通过胰蛋白酶和离心分离获取细胞）来获取细胞，都是如此。后一种方法由于细胞采集期间发生的压力导致磷酸化增加。糖原缺乏抑制也不是因为突变的β1亚基未能与α1和γ1形成复合物。W100G/W133A双突变体β1与α1和γ1的回收量大致相等，无论是否通过免疫沉淀myc公司α1上的表位或通过γ1上的FLAG表位(图3C） ●●●●。

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图3

β亚基突变对糖原抑制重组AMPK复合物的影响

（A）Myc公司-具有野生型序列或指示突变的α1、γ1和β1在CCL13细胞中表达，免疫沉淀并测定±牛肝糖原（200 mM葡萄糖当量）；结果为平均值±SEM（n=3）。下面的面板显示了α1亚单位的表达，该亚单位通过使用抗-myc公司抗体；上部面板中的活动因表达上的微小变化而被校正。

（B）Myc公司-α1、γ1和野生型β1、W100G/W133A突变体或N末端截断突变体（β1 172-270）在CCL13细胞中表达，使用快速或慢速裂解程序提取，并使用抗-myc公司或抗pT172抗体。

（C）Myc公司-具有野生型序列或W100G/W133A突变的α1、γ1和β1在CCL13细胞中表达，并用抗-myc公司（左）或反-旗帜（右）抗体，并使用抗-myc公司抗体（顶部面板）或抗β1和γ1抗体的混合物（底部面板）。

（D）Myc公司-对具有野生型序列或W99G/W133A突变的α1、γ1和人β2进行共表达、免疫沉淀和测定±牛肝糖原（200mM葡萄糖当量）；结果为平均值±SEM（n=3）。如（A）所示，针对观察到的表达水平的微小变化对活性进行校正。^∗通过t检验，活性与不含糖原的对照组不同（p<0.05）。

为了测试糖原与GBD的结合是否导致含有β2而非β1亚型的AMPK复合物受到抑制，我们表达了含有大鼠α1和γ1与人类β2的复合物，无论是否有相当于β1中W100和W133的两个色氨酸残基的突变（W99G/W133A）。结果与β1的结果非常相似，因为糖原抑制了野生型复合物，而双色氨酸突变使总活性降低70%，也完全消除了糖原的抑制作用(图3D） ●●●●。

环α1→4连接的寡糖抑制AMPK，而线性寡糖则不抑制

牛肝糖原和大鼠肝糖原的不同结果说明了糖原作为调节分子研究中的一个主要问题，因为多糖没有明确的结构，并且在大小和分支程度上都不同。Polekhina等人。(2003, 2005)之前已经证明，β-环糊精是一种由7个葡萄糖单元组成的环α1→4连接的低聚糖，可以与糖原竞争结合到大鼠β1 GBD。因此，我们测试了β-环糊精是否也会产生抑制作用。图4A表明，这确实是在1.6 mM时出现半最大效应的情况，接近K_D类β-环糊精与细菌表达的大鼠β1 GBD结合量为0.3 mMKoay等人。(2007)这种抑制依赖于与GBD的结合，因为它被β1中的双色氨酸突变（W100G/W133A）所消除(图4B） ●●●●。

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图4

非支化寡糖对AMPK活性的影响

（A） β-环糊精对天然大鼠肝脏AMPK的抑制作用。曲线如下图所示图2答：。

（B） GBD双突变对2 mMβ-环糊精抑制重组AMPK的影响。Myc公司-α1、γ1和β1与野生型序列或W100G/W133A突变共存，免疫沉淀，并测定±β-环糊精（2 mM）。针对观察到的表达水平的微小变化，对活性进行了校正，如图2答：。^∗活性与不含β-环糊精的对照组不同（p<0.05）。

（C和D）麦芽六糖（C）和麦芽七糖（D）对AMPK活性的影响。在存在和不存在指定浓度的低聚糖的情况下，对本地大鼠肝脏AMPK进行分析。（B）至（D）中的结果为平均值±SEM（n=3）。

Polekhina等人。(2005)还发现，具有五个以上葡萄糖单元的线性α1→4连接低聚糖，即麦芽己糖和麦芽庚糖，可以在浓度大于1mM时从糖原中取代β1 GBD。麦芽庚糖相当于β-环糊精，但链中有一个断裂，因此它具有自由还原端和非还原端。令人惊讶的是，即使浓度高达100 mM，这些线性低聚糖对天然大鼠肝脏AMPK几乎没有产生抑制作用(图4C和4D），尽管我们确认他们可以绑定GBD（数据未显示）。使用核磁共振方法，Koay等人。(2007)估计K_D类麦芽己糖和麦芽七糖与细菌表达的大鼠β1 GBD结合的值分别为0.7和0.4 mM。因此，即使在结合应饱和的浓度下，这些线性低聚糖也不会抑制AMPK。

结合GBD并抑制AMPK的糖原片段的分离

为了确定与GBD结合并抑制AMPK复合物的糖原区域的化学性质，我们对牛肝糖原进行了部分酸水解，并利用β1 GBD作为亲和基质来纯化与GBD连接的水解产物。根据高效阴离子交换色谱法（HPAEC）的检测结果，选择水解条件以产生一系列含有六个葡萄糖单元的低聚糖。水解产物通过谷胱甘肽Sepharose柱，其中GST-GBD已预先结合，结合的低聚糖用丙酸洗脱。通过HPAEC分析洗脱的低聚糖(图5A） ●●●●。1.7分钟的一个大峰被证明是丙酸引起的伪影，而3.5、5.0和6.5分钟的三个峰被电喷雾电离质谱分析。3.5分钟和6.5分钟的峰似乎不含碳水化合物，但5分钟的峰产生365的质量，与二糖一致。通过碰撞诱导解离和串联质谱法证实了这种二糖含有葡萄糖(图5B） ；产物离子光谱在203处有一个子峰，对应于葡萄糖加一钠的质量⁺离子。糖原部分酸水解产生的唯一二糖是麦芽糖（α1→4键）和异麦芽糖。通过化学连锁分析鉴定双糖的尝试没有成功。然而，发现异麦芽糖标准物在5.1分钟从HPAEC柱中洗脱，而麦芽糖在10.1分钟洗脱。这些结果表明，从糖原中提取并结合到β1-GBD的二糖是异麦芽糖糖。

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图5

AMPK抑制剂异麦芽糖的分离

（A） 牛肝糖原进行部分酸水解，水解产物通过谷胱甘肽Sepharose柱，GST:GBD融合物已预先结合到该柱上。用丙酸洗脱柱，并用HPAEC分析结合低聚糖。5分钟洗脱峰是唯一一个含有碳水化合物的洗脱峰。

（B） 用串联ES-MS分析5分钟时的峰洗脱，使用碰撞诱导解离。低聚糖片段被观察为与钠的加合物⁺离子的质量增加了23。

（C） 麦芽糖和异麦芽糖对AMPK活性的影响。异麦芽糖曲线是使用最佳拟合参数生成的，如图2答：。

（D） GBD双突变对20 mM异麦芽糖抑制重组AMPK的影响；结果为平均值±SEM（n=3）。^∗经t检验，活性与不含异麦芽糖的对照组不同（p<0.05）。

有趣的是，异麦芽糖在16 mM浓度下抑制天然大鼠肝脏AMPK，效果为一半最大，而麦芽糖浓度高达100 mM时没有引起任何抑制作用(图5C） ●●●●。与牛肝糖原一样，异麦芽糖不能抑制细菌中表达的α1激酶结构域的T172D突变（数据未显示）。与其他抑制性葡聚糖一样，异麦芽糖抑制野生型重组α1β1γ1复合物，但不抑制β1中含有双色氨酸突变的复合物(图5D） ●●●●。

合成分支寡糖对AMPK活性的影响

为了测试大于具有α1→6键的异麦芽糖的低聚糖是否是更有效的抑制剂，我们化学合成了一系列α1→4键的低聚糖，包含3到6个葡萄糖单元，具有单个α1→5键(图6A） ●●●●。由于具有自由还原端的低聚糖以α和β单体的混合物形式存在于溶液中，因此这些低聚糖在还原端葡萄糖的碳1处以甲氧基合成，呈α构型。为了比较，我们还合成了甲基α-麦芽糖苷和甲基α-异麦芽糖甙。

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图6

合成分支寡糖对大鼠肝脏AMPK的抑制作用

（A） 显示标识（ID）号、结构和估计IC的表₅₀±扫描电镜。

（B） 低聚糖对纯化大鼠肝脏AMPK的抑制作用。这些数据用于生成IC₅₀值如（A）所示，并使用最佳拟合参数绘制曲线。右侧显示了每个低聚糖的ID键。

（C） 合成低聚糖对重组野生型和W100G/W133A突变型AMPK（α1β1γ1复合物）的抑制作用，编号如（A）和（B）所示。数据以低聚糖的形式呈现，从左到右依次增加效力；结果为平均值±扫描电镜（n=3）。通过双向方差分析，野生型的显著差异±低聚糖。^∗p<0.05；^∗∗∗p<0.001。

测试了这些低聚糖抑制AMPK的能力(图6B；结构和估计IC₅₀值如所示图6A） ●●●●。令人惊讶的是，虽然带有自由还原基团的麦芽糖没有抑制AMPK，但甲基α-麦芽糖苷确实抑制了AMPK₅₀1.7 mM。甲基α-异麦芽糖苷（IC₅₀=0.6 mM）比异麦芽糖（IC₅₀=16 mM）。有趣的是，含有三到六个葡萄糖单位和一个α1→6键的α1→4键葡萄糖低聚糖是更有效的抑制剂，所有这些都与IC有关₅₀值小于0.5 mM。最有效的是在二级（支链）链上含有两个葡萄糖单位的三糖和在主链上含有一个α-甲基葡萄糖苷的三糖（Glcα1→4Glcα1→6Glcα-OMe），其具有IC₅₀90μM。

为了证实这些低聚糖的抑制依赖于与GBD的结合，我们测试了它们对CCL13细胞中表达的重组α1β1γ1复合物的影响。正如预期的那样，它们都抑制野生型AMPK，尽管在使用的单一浓度（2 mM）下，甲基α-麦芽糖苷的抑制作用并不显著。然而，它们都没有抑制β1中含有双W100G/W133A突变的重组复合物(图6C） ●●●●。正如在其他实验中观察到的那样，在没有寡糖的情况下，双突变体的活性下降了约70%。

支链寡糖对AMPK磷酸化/去磷酸化的影响

到目前为止观察到的抑制作用代表变构抑制，即直接影响不同部位碳水化合物结合的AMPK激酶结构域的活性，即β亚基上的GBD。重要的是要确定碳水化合物是否也会影响上游激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化。图7A和7B表明，最有效的抑制性支链寡糖（Glcα1→4Glcαl→6Glcα-OMe）对蛋白磷酸酶2Cα（PPM1A）对纯化大鼠肝脏AMPK的去磷酸化作用无显著影响。使用蛋白磷酸酶1的催化亚基也获得了类似的阴性结果（数据未显示）。然而，三糖确实引起CaMKKβ对Thr-172磷酸化的显著抑制(图7C和7D）和LKB1(图7E） 。为了证实后者对LKB1没有影响，我们测试了低聚糖对合成肽底物磷酸化的影响，即LKBtide(利兹卡诺等人。，2004). 在1 mM低聚糖浓度下无明显抑制作用(图7F） 当大鼠肝脏αβγ复合物的磷酸化抑制基本完成时(图7E） ●●●●。

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图7

低聚糖5号的作用，参见图6关于PP2Cα对AMPK的去磷酸化以及CaMKKβ和LKB1的磷酸化

（A） 低聚糖对PP2Cα脱磷酸的影响。在存在和不存在1mM低聚糖的情况下，用PP2Cα孵育大鼠肝脏AMPK；在不同时间，通过western blotting评估Thr-172的总α亚基和磷酸化水平。

（B） （A）中结果的量化；指两个实验的±SEM。

（C） 低聚糖对CaMKKβ磷酸化的影响。使用PP1对大鼠肝脏AMPK进行去磷酸化，添加冈田酸以抑制磷酸酶，并在存在和不存在1mM低聚糖的情况下，将该蛋白与MgATP和CaMKKβ孵育。在不同时间，通过蛋白质印迹评估总α亚基和Thr-172磷酸化的水平。

（D） （C）中结果的量化；平均值为±SEM（n=2）。

（E） 低聚糖对LKB1磷酸化作用的时间过程，如（C）所示，但用LKB1代替CaMKKβ。

（F） 低聚糖对LKB1合成肽底物磷酸化的影响（平均值±SD；n=2）。

（G） 牛肝糖原、磷酸化酶极限糊精和模拟处理样品对AMPK的抑制作用。集成电路₅₀值确定如下图2A和由最佳拟合参数生成的曲线。

（H） 极限糊精对野生型和W100G/W133A突变型β1重组α1β1γ1复合物的影响。结果为平均值±SEM（n=3）。^∗活性与无限制糊精对照组不同（p<0.05）。

本研究得到了威康信托基金的项目拨款、欧盟委员会资助的EXGENESIS综合项目（LSHM-CT-2004-005272）以及支持邓迪信号转导治疗部的制药公司（阿斯利康、博林格尔海姆、葛兰素史克、默克公司）的支持。默克公司（Merck KgaA）和辉瑞（Pfizer）。A.M.获得了Wellcome信托基金的博士生奖学金。