免疫学杂志。作者手稿；PMC 2009年2月11日提供。
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EMSID:英国MS3526
microRNA-146a表达的快速变化负向调节白细胞介素-1β诱导的人肺泡上皮细胞炎症反应
英国伦敦帝国理工学院SW3 6LY国立心肺研究所气道疾病生物制剂研究组
*通信地址：Mark A.Lindsay，生物药剂学研究小组，英国伦敦SW3 6LY，Dovehouse Street，National Heart and Lung Institute，Airways Disease，Bioparmaceutics Research Group。传真：+44 207 351 8173，电子邮箱：ku.ca.laipmi@yasdnil.m 摘要
微RNA对基因表达的转录后调节与慢性生理和病理反应的调节有关。在本报告中，我们证明了microRNAs（miRNAs）表达的变化也可以调节人肺泡上皮细胞的急性炎症反应。因此，用白细胞介素（IL）-1β刺激可导致miRNA-146a的快速时间和浓度依赖性增加，并在较小程度上增加miRNA-145b的表达，尽管这些增加仅在高IL-1β浓度下观察到。通过过度表达和抑制对miRNA功能的检测表明，miRNA-146a表达增加对促炎性趋化因子、IL-8和RANTES的释放具有负调节作用。随后对该机制的研究表明，miRNA-146a的作用是在翻译水平介导的，而不是通过下调参与IL-1β信号通路或趋化因子转录或分泌的蛋白质来介导的。总之，这些研究表明，miRNA-146a表达的快速增加为先天性免疫反应期间严重炎症的负调控提供了一种新的机制。
关键词：炎症、趋化因子、细胞因子、基因调控、肺
介绍
由上皮细胞和免疫细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）介导的先天免疫反应是抵抗感染的第一道防线。这种反应通常通过激活Toll/白细胞介素-1受体（TIR）超家族成员介导，该超家族成员可分为两组：白细胞介素-1受体（IL-1R）和Toll样受体（TLR）。已知IL-1R家族由10个受体组成，这些受体调节对IL-1α、IL-1β和IL-18的反应，而TLR家族至少包含11个成员，这些成员参与识别入侵微生物的保守分子模式，称为病原相关分子模式（PAMPs）(1,2). 值得注意的是，该受体超家族的所有成员都包含TIR细胞质域，并被认为通过类似的细胞内途径发出信号。因此，通过TIR结构域的信号传递涉及与适配器蛋白MyD88的关联，后者在配体结合后招募IL-1R相关激酶1（IRAK1）和TNF受体相关因子6（TRAF6）。磷酸化后IRAK1与MyD88的分离导致TRAF6的激活，随后刺激TAK1/TAB1/TAB2/TAB3复合物的形成和激活。这反过来通过IκB激酶（IKK）复合物和c-jun N末端激酶（JNK）分别激活多种促炎转录因子，如核因子（NF）-κB和激活蛋白（AP）-1。为了防止TIR受体激活后出现不适当的炎症反应，各种细胞外和细胞内负反馈途径已经进化来调节这一过程。这些包括可溶性TLR的产生，与膜受体竞争配体结合，TLR/IL-1受体表达的调节，MyD88和IRAK显性负剪接变异体的产生，以及翻译后修饰，如磷酸化、泛素化和降解(三).
最近的研究表明，microRNA（miRNA）介导的RNA干扰（RNAi）是一种新的进化保守机制，用于在转录后水平调节基因表达(4,5)并鉴定了一系列内源性哺乳动物基因，这些基因被加工产生约700个miRNA（miRNA注册地址：www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/). miRNA的生物发生涉及RNA聚合酶II对初级miRNA的初始转录，随后被RNase III酶Drosha与DGCR8结合切割，产生约65个核苷酸的发夹RNA，称为前miRNA(6). 然后通过exportin 5将其输出到细胞质中，并通过RNase III酶Dicer进一步裂解，生成21到23核苷酸双链RNA双工体。miRNAs的作用是由miRNA-induced silensing complex（miRISC）介导的，miRISC使用成熟的miRNA引导链作为模板来识别靶mRNA。目前，人们认为，miRNA在引导链与miRNA-recognition elements（MRE）不完全结合后，会阻断mRNA翻译或降低mRNA的稳定性在靶基因的3′非翻译区（UTR）内。导向链的特异性被认为主要由位于5′端残基2-8处的“种子”区域介导；尽管这似乎也受到其他因素的影响，例如多个MRE之间的存在和合作(7,8)、MRE之间的间距(8,9)，接近终止密码子(8)，位于3′UTR内(8)，AU成分(8)和靶mRNA二级结构(10). 尽管单个miRNAs可能采用不同的途径，并且这些途径与P-体相关的mRNA降解过程相结合，但其抑制蛋白质合成的机制目前是一个深入研究的领域(11). 因此，最近的报告表明，miRNAs的作用可能通过mRNA的不稳定和降解而发挥作用(12,13)或者，在两种翻译起始的抑制之后(14-17)和伸长步骤(18).
大多数已鉴定的miRNAs的生理作用尚不清楚，尽管它们在组织中的组成表达和发育过程中的变化表明它们在维持细胞表型中的重要性。因此，胰岛选择性miRNA-375表达被证明可以调节胰岛素分泌(19)，肝脏特异性miRNA-122参与胆固醇代谢体内(20,21)和肌肉特异性miRNA-1和miRNA-133被认为控制心脏发育和生理反应(22-24). 目前，对miRNAs在炎症反应中的作用知之甚少。miRNA-155在适应性免疫反应中的潜在作用来自于对敲除小鼠的研究。这表明CD3+T细胞CD3/CD28诱导的IFN-γ释放减少(25)和BCR介导的B细胞产生TNF-α(26)，这表明miRNA-155促进或正向调节淋巴细胞中的细胞因子释放。同样，miRNA-181a表达增加也显示通过下调磷酸酶来增加T细胞激活后IL-2的释放(27). 有趣的是，最近的报告显示，在单核细胞/巨噬细胞的固有免疫反应激活后，miRNA-155、miRNA-146a和miRNA-145b的表达增加(28,29). miRNA-146a和miRNA-145b的功能作用目前尚不清楚，尽管有人推测它们可能通过下调参与TIR信号传递的两种蛋白IRAK1和TRAF6来“微调”炎症负反馈调节(29). 然而，除了CMV驱动的miRNA-146a和miRNA-145b在HEK293细胞中过度表达的研究外，几乎没有实验证据支持这一假设，这些研究表明，它们抑制了包含IRAK1或TRAF6的3′UTR的荧光素酶报告质粒的活性(29). 为此，我们研究了IL-1β诱导的miRNA-146a和miRNA-145b表达与促炎性化学因子、IL-8和RANTES的释放之间的功能联系。值得注意的是，我们已经证明，miRNA-146a和较小程度上的miRNA-145b对IL-1β诱导的炎症负反馈调节至关重要，而不是“微调”炎症反应。此外，我们报告在高IL-1β浓度下观察到miRNA-146a的表达和作用，这表明这种负反馈机制仅在严重炎症时激活。对miRNA-146a和miRNA-145b作用机制的研究表明，这不太可能通过下调IL-1β信号蛋白IRAK-1和TRAF-6介导。相反，miRNA-146a和miRNA-145b似乎也不作用于IL-8和RANTES的转录或分泌，这表明它们的作用是趋化因子翻译。总的来说，这些研究表明，除了在维持细胞表型方面的作用外，miRNA水平的快速变化还参与了炎症等急性生物反应的调节。此外，鉴于观察到，在单核细胞和巨噬细胞暴露于通过TIR家族作用的一系列微生物刺激后，miRNA-146a和miRNA-145b表达也增加(29)这意味着这些miRNAs是先天免疫反应的重要调节器。
材料和方法
细胞研究
A549细胞在含有10%FCS和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM中生长，然后在75%的汇合处将其置于96、24或6孔板中，再培养4 h，然后用指示浓度的IL-1β刺激6 h和/或24 h。Beas2B（ATCC CRL-9609）第41-50代的细胞在含有5%L-谷氨酰胺、EGF和牛垂体的角质细胞培养基中生长，而THP-1细胞在补充有10%FCS、100单位/ml青霉素、100单位/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基1640中培养。从Lonza有限公司获得正常人支气管上皮细胞，并在支气管上皮培养基（BEGM）中培养最多5代®)含有生长因子、细胞因子和补充剂的混合物（BulletKit®）。为了测定细胞因子/趋化因子释放，去除上清液，并通过DuoSet ELISA（R&D Systems）测定IL-8、RANTES和IFN-α水平。用MTT法测定剩余细胞的存活率。
miRNA模拟物和抑制剂的转染
miRNA-146a/b模拟物和对照物（Pre™-miRNA-146b/b）从Ambion/Applied Biosystems Ltd获得，而miRNA-145a/b抑制剂和对照物则从Exiqon Ltd（丹麦）获得。对于96个平板的研究，将miRNA模拟物和抑制剂重新悬浮在50μl Lipofectamine 2000/Opti-MEM（Invitrogen）中，在添加A549细胞之前添加到相关平板中，并在37°C下培养4小时。
miRNA和mRNA表达的测量
总RNA使用米尔Vana™miRNA分离试剂盒（Ambion Europe）符合制造商的说明。RNA在50μl无RNase水中洗脱（Promega UK，Southampton，UK）并储存在−70°C下。使用BioTek PowerWave XS（SSi Robotics，Tustin，CA，U.S.a.）分光光度计测量RNA含量和纯度。通过两步TaqMan对总RNA提取物进行miRNA表达谱分析®逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），如前所述，标准化为18S(30). 独立井，2−（ΔΔCt）方法(31)用于测定单个miRNAs的相对定量水平，并将其表示为与相关对照组的fold-difference。如前所述，使用半定量两步RT-PCR测定IRAK1、TRAF6、RANTES和IL-8的mRNA表达水平(32)使用从英国Applied Biosystems获得的按需检测引物/探针组。
西方印迹法
如前所述，从A549细胞中提取蛋白质(33)用10%的SDS-PAGE或4-12%的PAGE凝胶（Invitrogen）分离，并转移至硝化纤维素（Amersham Ltd）。使用兔抗TRAF6抗体（H-274）通过蛋白质印迹检测蛋白质（5-10μg）(34)，兔抗IRAK1抗体（H-273）(35)山羊抗突触素-1（N-19）是从Santa Cruz Biotechnology获得的，兔抗突触蛋白-3是从Calbiochem（英国诺丁汉）获得的，兔子抗Sec23相互作用蛋白是从Novus Biologicals（美国利特尔顿）获得的。第一抗体的标记是使用与HRP结合的相关二级抗体检测的（Dako Ltd），并使用ECL试剂检测的（Amersham Ltd，UK）。
统计分析
IL-8、RANTES、IFN-α、miRNA-146a和miRNA-145b表达的统计变化通过双尾Student t检验或ANOVA确定，α使用Prism 4 for Windows（4.03版）设置为0.05。使用Alexander Sturn设计的Genesis（1.7.0版）对miRNA表达数据进行分析和显示，该Genesis来自格拉茨理工学院基因组学和生物信息学研究所。使用此软件包，通过方差分析（ANOVA）确定显著差异，然后进行Dunn的后验，α设置为0.01。
结果
IL-1β诱导的IL-8和RANTES反应
最初的研究是为了描述IL-1β诱导产生IL-8和RANTES的机制。暴露于IL-1β（1 ng/ml）可诱导炎症趋化因子、IL-8和RANTES的不同时间和浓度依赖性释放。虽然我们观察到两种趋化因子都快速释放，但IL-8反应在大约6-8小时达到稳定，而RANTES释放在24小时内持续增加(). 同样，对6小时时增加IL-1β浓度的效果的检查表明，IL-8的释放发生在低IL-1β水平（EC50~0.01 ng/ml），而RANTES反应是在较高的IL-1β浓度（EC50约0.3纳克/毫升）().
IL-1β诱导的IL-8和RANTES释放的时间和浓度依赖性。在测量IL-8和RANTES释放之前，将A549细胞暴露于缓冲液或1 ng/ml IL-1β中指定的时间（a）或指定的IL-1β浓度下24 h（b）。结果表示为3个单独样品的平均值±SEM，代表了3个独立实验。
IL-1β对miRNA表达谱的影响
为了确定miRNA水平是否受到IL-1β激发的影响，我们使用基于RT-PCR的方法测量了156个miRNA的表达(30). 这表明156个miRNA中有137个在未经处理的A549细胞中表达（数据未显示）。总的来说，尽管我们仅观察到let-7g、miRNA-26b、miR-104、miRNA195、miR-296和miRNA-299的水平显著降低（p<0.01），但使用IL-1β治疗3小时后，miRNA表达谱总体下降，miRNA-146a的表达大幅增加24倍(). 在这一初步观察之后，又鉴定出一个名为miRNA-146b的额外miRNA-1456编码基因，该基因与miR-146a在导向链的3′端有2个残基不同。用RT-PCR半定量测定未处理细胞中miRNA-146a和miRNA-145b的表达，结果表明两者几乎相同，ΔCt（−18S作为对照）分别为14.5±1.5和13.1±1.1（n=5个独立实验，第页=不重要）。
IL-1β诱导的miRNA表达变化。将A549细胞暴露于IL-1β（1 ng/ml）3 h，并使用TaqMan RT-PCR测定156个miRNAs的表达谱。日志2与时间匹配的盐水对照组相比，表达fold-change的转换值表示为热图，其中红色和绿色分别表示miRNA表达的增加和减少。
为了确定miRNA-146a和miRNA-145b在炎症反应中的潜在作用，我们检测了它们表达的时间进程。IL-1β刺激了miRNA-146a和miRNA-145b表达的时间依赖性增加70倍和20倍，分别在大约3h和6h达到稳定(). 对增加IL-1β浓度的影响进行的检查表明，在IL-1β水平较高时，miRNA-146a和miRNA-145b表达，给予类似的EC50值约为0.3 ng/ml(). 由于miRNA-146a和miRNA-145b仅相差2个核苷酸，因此我们确定了各自RT-PCR探针之间的交叉反应程度。使用miRNA模拟物，我们发现交叉反应有限，miRNA-146a探针（<10%vs.miRNA-145b）的选择性低于miRNA-166b探针（<0.4%vs.miRNA-146a）。
miRNA-146a和miRNA-145b表达机制的特征。在暴露于1 ng/ml IL-1β的指定时间（a）或暴露于指定的IL-1β浓度6 h（b）后，测定A549细胞中miRNA-146a和miRNA-145b的时间和浓度依赖性诱导，并通过RT-PCR测定miR-146a和miR-146b表达的增加。为了证实在A549细胞中的观察结果，在6小时时测量了IL-1β刺激的原代人支气管上皮细胞和转化的人支气管Beas2B上皮细胞（c）或LPS刺激的单核细胞THP-1细胞（d）中miRNA-146a和miR-146b的水平。或者，用地塞米松（1μM）预处理对照组和IL-1β-（1ng/ml）刺激的A549细胞60分钟，并在指定的时间点（e）测定miRNA-146a和miRNA-145b的表达。这些结果表示为3个独立实验的平均值±SEM。ND=未检测到。
为了确保miRNA表达的这些变化不局限于肺A549上皮细胞系，我们还检测了原代支气管上皮细胞和转化的支气管Beas2B上皮细胞系的反应。这些研究表明，IL-1β刺激后，两种细胞类型中miRNA-146a的表达都有可比但有选择性的增加，而miRNA-145b的表达没有增加(). 事实上，我们无法检测到miRNA-146b在人类原代支气管上皮细胞中的表达。此外，研究表明，IL-1β诱导的反应也与LPS刺激人单核细胞THP-1细胞系后观察到的反应相似，后者导致miRNA-146a和miRNA-145b的表达分别增加约30倍和3倍().
塔加诺夫之前的研究等人。证明miRNA-146a转录受NF-κB调节(29). 为了研究该途径在调节IL-1β诱导的反应中的作用，我们还检测了地塞米松（1μM）预孵育的效果。这种皮质类固醇可以减弱包括NF-κB在内的多种促炎转录因子的作用，发现它可以抑制IL-1β诱导的IL-8/RANTES释放（数据未显示）和miRNA-146a/miRNA-145b表达70-80%(). 因此，这表明miRNA-146a和miRNA-146b的表达都受到促炎转录因子的调节，可能是对皮质类固醇敏感的NF-κB。
总的来说，基于miRNA-146a和miRNA-145b的快速时间和浓度依赖性增加，我们假设这些miRNAs可能参与高IL-1β浓度下的炎症调节。
抑制miRNA-146a和miRNA-145b增加IL-1β诱导的IL-8和RANTES释放
使用miRNA抑制剂评估IL-1β诱导的IL-8和RANTES释放期间miRNA-146a和miRNA-145b表达变化的功能相关性(20,21,36,37). 在A549细胞中转染锁定的核酸/DNA反义抑制剂和对照物4小时。我们之前已经证明，当使用siRNA智能池（Dharmacon Inc）检测IL-1β诱导的IL-8生成增加的抑制时，这足够在A549电池中获得寡核苷酸递送（数据未显示）。miRNA-146a抑制剂增加了IL-1β诱导的（1 ng/ml）IL-8和RANTES的释放，与EC呈浓度依赖性50~3-10毫微米(). 相反，miRNA-146b抑制剂在增加IL-8释放方面效果较差，对RANTES释放没有显著影响。这意味着IL-1β诱导的miRNA-146a而非miRNA-145b的增加具有更大的调节该机制的能力。miRNA-146抑制剂（10nM）在增加IL-1β浓度时对趋化因子释放的影响的研究支持了这一观点(). 因此，IL-1β诱导的IL-8和RANTES释放不受对照或miRNA-146b抑制剂的显著影响。然而，正如预期的那样，IL-1β诱导的miRNA-146a表达具有EC50约0.3纳克/毫升()在高IL-1β浓度（>1ng/ml）下，我们观察到IL-8和RANTES的释放显著增加。为了消除miRNA抑制剂的作用继发于诱导抗病毒反应和/或毒性的可能性，我们测量了细胞外干扰素-α（IFN-α）的释放和24小时的细胞存活率，没有发现显著变化(). 总的来说，这些抑制剂研究表明，在高IL-1β浓度下，IL-1β诱导的miRNA-146a表达增加与炎症反应的负反馈调节有关。
miRNA-146a和miRNA-145b的抑制剂和模拟物对IL-1β诱导的IL-8和RANTES释放的影响。将A549细胞单独暴露于转染试剂（空白）、对照抑制剂或模拟物、miR-146a抑制剂或模拟剂和miR-146b抑制剂或模拟品中4 h，然后暴露于1 ng/ml IL-1β（a，c）或指示的IL-1β浓度（b，d）中，并在6 h和24 h测定上清液中IL-8和RANTES的浓度，分别是。结果表示为3个单独样品的平均值±SEM，并代表至少3个独立实验*第页与时间匹配（a，c）或浓度匹配（b，d）转染对照组相比，<0.05。
miRNA-146a和miRNA-146b抑制剂和模拟物对IFN-α释放和细胞活力的影响。A549细胞暴露于对照miRNA抑制剂/模拟物、miR-146a抑制剂/模拟或miR-146b抑制剂/模拟4小时，然后暴露于1 ng/ml IL-1β24小时。然后取上清液样本测量IFN-α（a），并测定剩余细胞的细胞活力（b）。结果表示为3个单独样本的平均值±SEM，这些图表代表了3个独立实验。
miRNA-146a和miRNA-145b模拟物减少IL-1β诱导的IL-8和RANTES释放
为了进一步证明miRNA-146a在负反馈调节中的作用，我们使用miRNA模拟物检测了miRNA过度表达的影响。在IL-1β刺激前4 h再次用miRNA模拟物转染细胞，分别在6 h和24 h测量IL-8和RANTES释放。浓度依赖性的测量表明，当用1ng/ml的IL-1β刺激细胞时，miRNA-146a和miRNA-145b的模拟物在100 nM时显著降低IL-8和RANTES释放约60-80%(). 测量100 nM模拟物对绝对miRNA-146a和miRNA-145b水平的影响表明，转染效率存在差异，但导致这些miRNAs的基线水平增加了约500-6000倍（数据未显示）。接下来，我们研究了100 nM浓度的miRNA模拟物在增加IL-1β浓度时对趋化因子释放的作用。有趣的是，这表明miRNA过度表达导致非竞争性抑制，因为在IL-1β浓度范围内（0.001-10 ng/ml），miRNA-146a和miRNA-145b模拟物（100nM）均能抑制IL-8和RANTES释放60-90%(). 再一次，IFN-α释放和细胞存活率的测量表明，在所有测试浓度下，miRNA模拟物均无显著作用().
miRNA-146a和miRNA-145b不靶向趋化因子转录
为了确定其潜在机制，我们使用最新发布的数据库预测miRNAs靶点（TargetScan数据库(网址：www.targetscan.org) (38)). 除了多种转录因子外，这还鉴定了五种额外的蛋白质，其中两种参与IL-1β信号传导（IRAK1和TRAF6），三种参与分泌（突触结合蛋白-3、突触结合蛋白-1和sec23相互作用蛋白（sec23IP））。
最初，我们确定miRNA-146a和miRNA-145b的作用是否通过下调参与IL-1β信号通路的蛋白质介导。IL-1β刺激后24小时内的蛋白质水平测量显示TRAF6的表达没有变化，但在1-3小时IRAK1带向上移动，随后在6小时和24小时蛋白质表达减少(). 在这些条件下，IRAK1和TRAF6 mRNA表达的测量没有明显变化(). 先前的研究表明，IRAK1分子量的增加是由蛋白质磷酸化和泛素化引起的，随后导致蛋白质水解降解(39,40). 为了确定增加的miRNA-146a和miRNA-145b是否有助于IRAK1蛋白降解，我们检测了miRNA抑制剂和模拟物的作用。转染4 h后（即时间=0 h），我们观察到对IRAK1蛋白表达没有影响，而miRNA抑制剂和模拟物也对IL-1β诱导的IRAK1降解没有影响(). 因此，该蛋白表达数据表明，miRNA-146a和miRNA-145b的作用不是通过对参与IL-1β信号通路的蛋白质的作用来介导的。为了支持这一结论，并确定其作用是否可能涉及转录因子的下调，我们测定了miRNA抑制剂对IL-1β诱导的IL-8和RANTES mRNA表达的作用。对IL-1β诱导的IL-8和RANTES mRNA水平变化的时间进程的初步测量表明，这两种转录物都迅速增加，在6-8小时达到峰值，在24小时保持升高(). 在随后的研究中，我们发现miRNA-146a和miRNA-145b的抑制剂（10 nM）在6小时或24小时对IL-1β诱导的IL-8和RANTES mRNA的产生没有影响(). 相比之下，在100 nM下转染miRNA-146a和miRNA-145b模拟物可显著降低IL-8和RANTES mRNA在6 h和24 h的表达(). 有趣的是，尽管IL-1β单独刺激并没有显著增加IRAK1和TRAF6 mRNA的表达()，我们观察到在miRNA模拟物存在的情况下，IRAK1 mRNA显著减少，但TRAF6 mRNA没有显著减少(). 由于我们之前已经证明，用miRNA模拟物转染细胞后，细胞内miRNA-146a和miRNA-145b水平增加了约500-6000倍，而不是IL-1β刺激后增加了约20-70倍，这表明miRNA模拟体的这些作用，包括IRAK1 mRNA的降解，在这些超高浓度下，可能通过非生理过程介导。
miRNA-146a和miRNA-145b在IL-1β信号通路中的作用。A549细胞暴露IL-1β（1 ng/ml），在指定的时间点检测IRAK1和TRAF6蛋白（a）和mRNA（b）的表达。在单独的研究中，用miRNA-146a、miRNA-145b或相关对照miRNA的抑制剂或模拟物转染A549细胞，并在IL-1β刺激后0 h和6 h测定对IRAK1蛋白表达的影响（c）。面板（a）和（c）中的结果代表了至少3个独立实验，而面板（b）给出了3个独立试验的平均值±SEM。
miRNA-146a和miRNA-146b在IL-1β诱导的IL-8和RANTES转录过程中的作用。用IL-1β刺激A549细胞，并在指定时间（a）测定IL-8和RANTES mRNA的表达。或者，用转染试剂单独转染细胞4 h（空白）、对照抑制剂或模拟物（对照）、miR-146a抑制剂或模拟体（miRNA-146a）和miR-146b抑制剂或模拟品（miRNA146b），暴露于1 ng/ml IL-1β，在6 h和/或24 h测定IL-8、RANTES、IRAK1和TRAF6 mRNA的表达。结果表示为至少3个独立实验的平均值±SEM*第页与空白组相比<0.05。
miRNA-146a和miRNA-145b不靶向趋化因子分泌
在消除了miRNA-146a和miRNA-145b对IL-1β信号通路和趋化因子转录的作用后，我们继续研究参与IL-8和RANTES分泌的蛋白质的可能靶向性。然而，在IL-1β刺激后24小时内，我们再次观察到syntaxin-3、synaptotagmin-1和sec23IP蛋白表达没有显著降低(). miRNA-146a和miRNA-145b对分泌没有作用的其他证据来自对miRNA抑制和过度表达对细胞内IL-8和RANTES水平的影响的研究。对细胞内蛋白质生成的时间进程的检查表明，IL-8和RANTES水平随时间而增加，分别在24小时和6小时达到峰值(). 如果IL-1β诱导的miRNA-146a和miRNA-145b的作用是通过下调参与分泌的蛋白质介导的，那么这将导致细胞内IL-8和RANTES的积累。在这种情况下，miRNA模拟物可能会进一步阻断分泌，导致细胞内IL-8和RANTES水平升高，而miRNA抑制剂则会降低这些水平。未观察到抑制剂或模拟物对细胞内RANTES水平的显著影响(). 然而，我们发现，在诱导miRNA-146a和miRNA-145b产生的IL-1β浓度下，模拟物减少了细胞内表达，而miRNA-166a的抑制剂增加了IL-8水平(). 除了蛋白质数据外，这进一步证明了miRNA-146a和miRNA-145b没有靶向IL-8和RANTES分泌。
miRNA-146a和miRNA-145b在IL-1β诱导的IL-8和RANTES分泌中的作用。用IL-1β（1 ng/ml）刺激A549细胞，在指定时间，通过Western blotting（a）和IL-8以及ELISA（b）测定syntaxin-3、syntaxotagmin-1或sec23-IP的细胞内蛋白表达。或者，用转染试剂单独（空白）、对照抑制剂或模拟物、miR-146a抑制剂或模拟体和miR-146b抑制剂或模拟品转染细胞4 h，然后暴露于指示的IL-1β浓度下，在6 h测定细胞内IL-8和RANTES蛋白的表达。结果是3个单独样品的平均值±SEM，并代表至少3个独立实验*第页与空白组相比<0.05。
讨论
最近的一些出版物表明，miRNAs可能调节与适应性免疫和先天免疫相关的炎症反应。在适应性反应中，miRNA-155通过一种非典型机制被认为是B细胞和T细胞释放细胞因子的正调节因子(25,26). 同样，miRNA-181a已被证明调节T细胞的炎症反应，尽管这被证明是通过下调多种磷酸酶如CTLA-4介导的(27). 就先天免疫反应而言，塔加诺夫等人。(29)表明miRNA-146a和miRNA-145b可能通过下调IRAK1和TRAF6来负调节先天免疫反应的激活。然而，miRNA-146a和miRNA-145b的靶点是通过过度表达确定的，并且与炎症反应无关。基于这些原因，我们进行了研究，以阐明miRNA-146a和miRNA-145b表达的变化是否与炎症介质的释放有关，并阐明其作用机制。具体而言，我们已经在人肺泡A549肺上皮细胞系中检测了它们在IL-1β诱导的反应中的作用。
IL-1β暴露后对156个miRNAs的差异表达进行的检查显示，6个miRNAs、let-7g、miRNA-26b、miRNA104、miR-195、miR-296和miRNA-299的表达显著降低，miR-146a和miRNA146b的表达增加。miRNA-146a和miRNA-145b的表达增加与早期对LPS和TNF-α刺激的单核细胞系的研究一致，尽管与我们不同，这些研究人员也报道了miRNA-155和miRNA132的上调(28,29). 这些差异的原因目前尚不明确，尽管这可能与细胞差异有关，因为转基因小鼠的研究报告称miRNA-155选择性表达于淋巴细胞而非非淋巴细胞(26). 目前，let-7g、miRNA-26b、miRNA104、miR-195、miR-296和miRNA-299的功能尚未被研究，尽管预期其水平降低会导致靶蛋白表达增加。
miR-146a和miRNA-146b在调节趋化因子释放中的作用最初是根据IL-1β诱导反应的时间和浓度依赖性提出的。因此，对miRNA-146a和miRNA-145b产生的时间进程的测量表明，这与IL-8和RANTES的快速释放有关。有趣的是，尽管miRNA-146a和miRNA-145b在未经处理的细胞中表达水平相当，但IL-1β刺激了miRNA-166a绝对水平的更大增加。此外，对浓度依赖性的检查表明，miRNA-146a和miRNA-145b的表达发生在与RANTES释放平行的高IL-1β浓度下：在这些浓度下，IL-8的释放已经达到最大。从机制上讲，miRNA-146a、IL-8和RANTES都被认为受炎症转录因子NF-κB的调节，尽管这些观察表明IL-8可能由高亲和力启动子位点调节，而miRNA-145a和RANTEE则由低亲和力NF-κ的B位点调节(29,41). 这一结论得到了我们的研究的支持，该研究表明，在地塞米松存在的情况下，IL-1β诱导的miRNA-146a的表达受到抑制，地塞米松是一种皮质类固醇，已知可减弱包括NF-κB在内的多种促炎转录因子的作用。miRNA-146b的表达也被阻止，这表明其转录也由皮质类固醇敏感转录因子介导。
随后的药理学研究确定了miRNA-146a的增加与炎症反应的负反馈调节之间的功能联系。因此，发现抑制miRNA-146a可以增加IL-8和RANTES的释放，而使用miRNA模拟物过度表达miRNA-145a可以减弱这种反应。相比之下，抑制miRNA-146b几乎没有效果，尽管在给予miRNA-145b模拟物后趋化因子释放减少，这可能与IL-1β刺激反应中miRNA-166b表达增加较小有关，而不是缺乏生物活性就其本身而言我们的观察结果也支持了miRNA-146a而非miRNA-145b在TIR介导的负反馈中的重要性，我们的观察表明，在激活人类支气管上皮细胞和单核细胞后，miRNA-141a的表达显著增加，但miRNA-166b的表达没有增加。至关重要的是，miRNA-146a的表达以及IL-8和RANTES释放的抑制剂介导的增加仅在高IL-1β浓度（>0.3 ng/ml）时出现，这一事实表明，这种负反馈途径在严重炎症期间非常重要。
为了阐明其作用机制，对TargetScan数据库的查询表明，miRNA-146a和miRNA-145b靶向蛋白参与IL-1β信号通路（IRAK1和TRAF6）以及IL-8和RANTES分泌（syntaxin-3、synaptotagmin-1和sec23相互作用蛋白）。选择最新的TargetScan数据库是因为，与早期的数据库不同，它不仅根据mRNA 3′UTR内miRNA种子区和miRNA识别元件（MRE）之间的配对来预测靶点，而且还考虑了多个MRE之间的存在和合作、MRE间的间距、，接近终止密码子，在3′UTR和AU组成中的位置(8). 然而，重要的是要记住，用于开发此算法的信息可能不准确或有偏见，因为它基于miRNA过度表达后mRNA敲除的测量。
对TargetScan数据库的检查表明，IL-1β信号蛋白、IRAK1和TRAF6包含miRNA-146a和miRNA-145b的多个MRE。这是一个重要的观察结果，因为这被认为是miRNA靶向的重要决定因素(8)并得到塔加诺夫的实验支持等人。(29)研究表明，miRNA-146a和miRNA-145b的异位过度表达导致IRAK1和TRAF6的下调。然而，我们对IL-1β诱导的蛋白质表达变化的研究表明，miRNA-146a和miRNA-146b都不可能靶向IRAK1或TRAF6。因此，IL-1β刺激对TRAF6蛋白表达没有影响，尽管我们观察到IRAK1蛋白表达减少，但这种反应不受miRNA-146a和miRNA-145b抑制剂和模拟物的影响。相反，正如之前报道的那样，IRAK1的减少可能是通过IRAK1磷酸化后的蛋白质体降解介导的(39)以及随后的泛素化(40). IL-1β暴露后1-3小时IRAK1分子量的特征性增加表明了这种磷酸化和泛素化。观察到IL-1β诱导的IL-8和RANTES mRNA表达不受miRNA-146a和miRNA-145b抑制剂的影响，进一步证明miRNA-166a和miRNA-146b均不影响IL-1β信号通路或IL-8与RANTES转录。矛盾的是，miRNA-146a和miRNA-145b模拟减少趋化因子的表达，尽管我们推测这可能是这些过度表达研究中出现的超最大miRNA浓度的结果。因此，尽管我们在IL-1β刺激后未观察到IRAK1 mRNA表达的变化，但在转染miRNA-146a和miRNA-145b模拟物后，IRAK1的mRNA表达显著降低。这些在高miRNA浓度下的观察结果也可能解释Taganov观察到的IRAK1和TRAF6 mRNA表达减少的原因等人。(29)遵循miRNA-146a和miRNA-145b的生态表达，并强调使用过表达系统确定miRNA靶点和功能的相关问题。
在消除了对IL-1β途径和趋化因子转录的可能作用后，我们继续研究miRNA-146a是否通过下调syntaxin-3、syntaptotagmin-1或sec23-IP来靶向IL-8和RANTES分泌，TargetScan预测所有这些都在其3′UTR内含有miRNA-145a MRE。先前，葡萄糖诱导胰岛素分泌的研究表明，miRNA-375和miRNA-9可以下调细胞外蛋白、肌营养蛋白的分泌(42)和嗜粒蛋白/Slp4(43)分别是。然而，这种机制似乎也不太可能，因为我们观察到IL-1β刺激后突触结合蛋白-3、突触结合蛋白-1和sec23-IP蛋白表达没有变化。此外，研究miRNA抑制剂和模拟物对细胞内IL-8浓度的影响，与IL-1β诱导的miRNA-146a作用于分泌时可能产生的反应相反，即在miRNA-145a抑制和过度表达后，细胞内IL-18浓度分别增加和减少。
如果miRNA-146a没有靶向参与IL-1β信号传导或趋化因子转录和分泌的蛋白质，作用机制是什么？消除过程表明miRNA-146a（和miRNA-145b）的作用是在翻译水平上介导的。现有算法无法识别IL-8和RANTES 3′-UTRs中潜在的MRE，这意味着miRNA-146a必须直接作用于翻译机制或靶向快速转换或诱导的翻译蛋白。有趣的是，已知许多炎症介质（包括IL-8和RANTES）mRNA的稳定性和/或翻译受其3′UTR和调节元件内富含AU的元件（are）之间的相互作用调节。其中包括稳定mRNA的蛋白质，如HuR，以及促进mRNA衰变的Tristetraprolin（TTP）家族成员(44). 值得注意的是，最近关于调节TNF-αmRNA稳定性和翻译的机制的研究表明，ARE成分和miRNA-介导的RNAi途径之间存在相互作用。因此，RISC复合体的两个关键成分，脆性X-金属阻滞相关蛋白1（FXR1）和精氨酸2（Ago2）已被证明与ARE结合，并在血清饥饿后介导TNF-α上调(45). 类似地，miRNA-16通过一种涉及TTP和Ago/eiF2C家族成员的机制与ARE中的互补序列结合来阻断TNF-α翻译(13). 另一种ARE调节蛋白HuR(14)已证明可以逆转miRNA-122介导的阳离子氨基酸转运蛋白1（CAT-1）mRNA对应激反应的抑制。因此，可以推测，miRNA-146a的快速增加可能通过ARE和miRNA介导的RNAi途径直接相互作用或下调参与转录后调控的成分来调节炎症介质的产生。相关的是，最近生物信息学对miRNA与免疫基因之间相互作用的调查意外地发现，参与调节富含AU元素和miRNA代谢的蛋白质具有优先靶向性(46). 此外，该报告指出，miRNAs的主要靶点是转录因子、辅因子和染色质修饰物，而不是受体、配体或炎症介质(46).
总之，通过证明IL-1β诱导的miRNA-146a表达增加对IL-8和RANTES的释放产生负调节作用，我们确定了先天免疫反应激活后炎症负反馈调节的新机制。重要的是，这只在高IL-1β浓度下观察到，这表明它可能是严重炎症期间的重要反馈机制。值得注意的是，这些结果还表明，miRNA表达的变化能够调节急性生物反应，并表明miRNA的药理靶向性可能为炎症治疗提供一种新的治疗方法。由于在TIR介导的单核细胞和巨噬细胞激活后，miRNA-146a也有快速增加的报道，这表明这可能是先天免疫反应激活后炎症调节的共同途径。
致谢
赠款支持
Sterghios A.Moschos由BBSRC（BB/C508234/1）资助，Hanna M.Larner-Svensson由国家心肺研究所博士生奖学金资助，Mark M.Perry、Andrew E.Williams和Mark A Lindsay由Wellcome Trust（076111）资助。
脚注
披露
作者声明没有相互竞争的利益。
出版商免责声明：这是一份由作者制作的手稿，于年被接受出版免疫学杂志(JI公司). 美国免疫学家协会（AAI）联合执行，拥有此手稿的版权。此版本的手稿尚未被复制或接受编辑校对JI公司; 因此，它可能与JI公司（在线和印刷版）。AAI公司(JI公司)对于本作者制作的手稿版本或美国国立卫生研究院或任何其他第三方从中衍生的任何版本中的错误或遗漏概不负责。记录的最终可引用版本可以在网址：www.jimmunol.org.
参考文献
1Braddock M，Quinn A.在炎症疾病中靶向IL-1：治疗干预的新机会。Nat.Rev.Drug迪斯科。2004;三:330–339.[公共医学][谷歌学者] 2李旭，秦杰。Toll interleukin 1受体介导的信号传导的调节。《分子医学杂志》。2005;83:258–266.[公共医学][谷歌学者] 三。Liew FY，Xu D，Brint EK，O'Neill LA。类收费受体介导免疫反应的负调控。Nat Rev.免疫。2005;5:446–458.[公共医学][谷歌学者] 4Ambros V.动物microRNA的功能。自然。2004;431:350–355.[公共医学][谷歌学者] 5He L、Hannon GJ。MicroRNAs：在基因调控中起重要作用的小RNA。自然修订版遗传学。2004;5:522–531.[公共医学][谷歌学者] 6.Han J，Lee Y，Yeom KH，Nam JW，Heo I，Rhee JK，Sohn SY，Cho Y，Zhang BT，Kim VN。Drosha-DGCR8复合物识别初级微小RNA的分子基础。单元格。2006;125:887–901.[公共医学][谷歌学者] 7.Doench JG、Petersen CP、Sharp PA。siRNAs可以作为miRNAs发挥作用。基因发育。2003;17:438–442. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Farh KK、Grimson A、Jan C、Lewis BP、Johnston WK、Lim LP、Burge CB、Bartel DP。哺乳动物MicroRNAs对mRNA抑制和进化的广泛影响。科学。2005;310:1817–1821.[公共医学][谷歌学者] 9Saetrom P、Heale理学学士、Snove O，Jr.、Aagaard L、Alluin J、Rossi JJ。microRNA靶点之间的距离限制决定了疗效和合作性。核酸研究。2007;35:2333–2342. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Long D，Lee R，Williams P，Chan CY，Ambros V，Ding Y.靶结构对microRNA功能的影响。国家结构。分子生物学。2007;14:287–294.[公共医学][谷歌学者] 11Pillai RS、Bhattacharyya SN、Filipowicz W.miRNAs抑制蛋白质合成：有多少机制？趋势细胞生物学。2007;17:118–126.[公共医学][谷歌学者] 12.Giraldez AJ、Cinalli RM、Glassner ME、Enright AJ、Thomson JM、Baskerville S、Hammond SM、Bartel DP、Schier AF。微RNA调节斑马鱼的大脑形态发生。科学。2005;308:833–838.[公共医学][谷歌学者] 13Jing Q，Huang S，Guth S，Zarubin T，Motoyama A，Chen J，Di Padova F，Lin SC，Gram H，Han J.微RNA参与AU-富元素介导的mRNA不稳定性。单元格。2005;120:623–634.[公共医学][谷歌学者] 14Bhattacharyya SN、Habermacher R、Martine U、Closs EI、Filipowicz W.缓解受压力人类细胞中microRNA-介导的翻译抑制。单元格。2006;125:1111–1124.[公共医学][谷歌学者] 15Kiriakidou M、Tan GS、Lamprinaki S、Planell-Saguer M、Nelson PT、Mouralatos Z。人类Ago2中的mRNA m7G帽结合样基序抑制翻译。单元格。2007;129:1141–1151.[公共医学][谷歌学者] 16Thermann R，Hentze MW。果蝇miR2诱导假多聚体并抑制翻译起始。自然。2007;447:875–878.[公共医学][谷歌学者] 17Chendrimada TP、Finn KJ、Ji X、Baillat D、Gregory RI、Liebhaber SA、Pasquinelli AE、Shiekhattar R.通过RISC招募eIF6沉默微RNA。自然。2007;447:823–828.[公共医学][谷歌学者] 18Petersen CP，Bordeleau ME，Pelletier J，Sharp PA。短RNA在哺乳动物细胞中启动后抑制翻译。分子细胞。2006;21:533–542.[公共医学][谷歌学者] 19Poy MN、Eliasson L、Krutzfeldt J、Kuwajima S、Ma X、Macdonald PE、Pfeffer S、Tuschl T、Rajewsky N、Rorsman P、Stoffel M。胰岛特异性微RNA调节胰岛素分泌。自然。2004;432:226–230.[公共医学][谷歌学者] 20Esau C、Davis S、Murray SF、Yu XX、Pandey SK、Pear M、Watts L、Booten SL、Graham M、McKay R、Subramaniam A、Propp S、Lollo BA、Freier S、Bennett CF、Bhanot S、Monia BP。体内反义靶向揭示miR-122对脂质代谢的调节。单元格元数据。2006;三:87–98.[公共医学][谷歌学者] 21Krutzfeldt J、Rajewsky N、Braich R、Rajeev KG、Tuschl T、Manoharan M、Stoffel M。体内用“antagomirs”沉默微RNA自然。2005;438:685–689.[公共医学][谷歌学者] 22Care A、Catalucci D、Felicetti F、Bonci D、Addario A、Gallo P、Bang ML、Segnalini P、Gu Y、Dalton ND、Elia L、Latronico MV、Hoydal M、Autore C、Russo MA、Dorn GW、Ellingsen O、Ruiz-Lozano P、Peterson KL、Croce CM、Peschle C、Condorelli G.MicroRNA-133控制心肌肥大。纳特·梅德。2007;13:613–618.[公共医学][谷歌学者] 23Yang B，Lin H，Xiao J，Lu Y，Lu X，Li B，Zhang Y，Xu C，Bai Y，Wang H，Chen G，Wang Z。肌肉特异性microRNA miR-1通过靶向GJA1和KCNJ2调节致心律失常潜能。纳特·梅德。2007;13:486–491.[公共医学][谷歌学者] 24Zhao Y、Ransom JF、Li A、Vedantham V、von Drehle M、Muth AN、Tsuchihashi T、McManus MT、Schwartz RJ、Srivastava D。缺乏miRNA-1-2的小鼠心脏发生、心脏传导和细胞周期的失调。单元格。2007;129:303–317.[公共医学][谷歌学者] 25Rodriguez A、Vigorto E、Clare S、Warren MV、Couttet P、Soond DR、van Dongen S、Grocock RJ、Das PP、Miska EA、Vetrie D、Okkenhaug K、Enright AJ、Dougan G、Turner M、Bradley A.正常免疫功能对bic/microRNA-155的要求。科学。2007;316:608–611. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Thai TH、Calado DP、Casola S、Ansel KM、Xiao C、Xue Y、Murphy A、Frendewey D、Valenzuela D、Kutok JL、Schmidt-Supprian M、Rajewsky N、Yancopoulos G、Rao A、Rajevsky K。microRNA-155对生发中心反应的调节。科学。2007;316:604–608.[公共医学][谷歌学者] 27Li QJ、Chau J、Ebert PJ、Sylvester G、Min H、Liu G、Braich R、Manoharan M、Soutschek J、Skare P、Klein LO、Davis MM、Chen CZ。miR-181a是T细胞敏感性和选择的内在调节剂。单元格。2007;129:147–161.[公共医学][谷歌学者] 28O'connell RM、Taganov KD、Boldin MP、Cheng G、Baltimore D.在巨噬细胞炎症反应期间诱导MicroRNA-155。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2007;104:1604–1609. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Taganov KD，Boldin MP，Chang KJ，Baltimore D.NF-kappaB依赖性诱导microRNA miR-146，microRNA是一种靶向天然免疫反应信号蛋白的抑制剂。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2006;103:12481–12486. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Moschos SA、Williams AE、Perry MM、Birrell MA、Belvisi MG、Lindsay MA。体内表达谱显示，在脂多糖诱导炎症后，肺部microRNA水平迅速变化，但糖皮质激素的抗炎作用没有变化。BMC公司。基因组学。2007;8:240. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Livak KJ，Schmittgen TD.使用实时定量PCR和2（-Delta Delta C（T））方法分析相关基因表达数据。方法。2001;25:402–408.[公共医学][谷歌学者] 32.Moschos SA、Jones SW、Perry MM、Williams AE、Erjefalt JS、Turner JJ、Barnes PJ、Sproat BS、Gait MJ、Lindsay MA。使用与TAT（48-60）结合的siRNA和渗透素揭示肽诱导的基因表达减少和先天免疫诱导的肺部给药研究。生物魔术。化学。2007;18:1450–1459. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33De Souza PM、Kankaanranta H、Michael A、Barnes PJ、Giembyz MA、Lindsay MA。Mst1的半胱氨酸蛋白酶催化裂解和激活与嗜酸性粒细胞凋亡相关，但与中性粒细胞凋亡无关。鲜血。2002;99:3432–3438.[公共医学][谷歌学者] 34Hacker H、Redecke V、Blagoev B、Kratchmarova I、Hsu LC、Wang GG、Kamps MP、Raz E、Wagner H、Hacker G、Mann M、Karin M.通过TRAF3和TRAF6的不同效应器功能实现Toll样受体信号的特异性。自然。2006;439:204–207.[公共医学][谷歌学者] 35Takaesu G、Ninomiya-Tsuji J、Kishida S、Li X、Stark GR、Matsumoto K。白细胞介素-1（IL-1）受体相关激酶通过诱导IL-1信号通路中的TAB2易位而激活TAK1。分子细胞生物学。2001;21:2475–2484. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 36.Esau C、Kang X、Peralta E、Hanson E、Marcusson EG、Ravichandran LV、Sun Y、Koo S、Perera RJ、Jain R、Dean NM、Freier SM、Bennett CF、Lollo B、Griffey R.MicroRNA-143调节脂肪细胞分化。生物化学杂志。2004;279:52361–52365.[公共医学][谷歌学者] 37Hutvagner G，Simard MJ，Mello CC，Zamore PD。小RNA功能的序列特异性抑制。公共科学图书馆。生物学。2004;2：E98。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 38Grimson A、Farh KK、Johnston WK、Garrett-Engele P、Lim LP、Bartel DP。哺乳动物中靶向MicroRNA的特异性：种子配对以外的决定因素。分子细胞。2007;27:91–105. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Cao Z，Henzel WJ，Gao X.IRAK：与白细胞介素-1受体相关的激酶。科学。1996;271:1128–1131.[公共医学][谷歌学者] 40Yamin TT，Miller DK。白细胞介素-1受体相关激酶在磷酸化后被蛋白酶体降解。生物化学杂志。1997;272:21540–21547.[公共医学][谷歌学者] 41.Henriquet C、Gougat C、Combes A、Lazennec G、Mathieu M。肺腺癌细胞中RANTES和IL-8表达的差异调节。肺癌。2007;56:167–174. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42.Poy MN、Eliasson L、Krutzfeldt J、Kuwajima S、Ma X、Macdonald PE、Pfeffer S、Tuschl T、Rajewsky N、Rorsman P、Stoffel M。胰岛特异性微RNA调节胰岛素分泌。自然。2004;432:226–230.[公共医学][谷歌学者] 43Plaisance V、Abderrahmani A、Perret-Menoud V、Jacquemin P、Lemaigre F、Regazzi R.MicroRNA-9控制Granuphilin/Slp4的表达和胰岛素分泌细胞的分泌反应。生物化学杂志。2006;281:26932–26942.[公共医学][谷歌学者] 44巴雷奥C、佩拉德L、奥斯本HB。AU-丰富元素和相关因素：有统一的原则吗？核酸研究。2006;33:7138–7150. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 45Vasudevan S，Steitz JA公司。FXR1和Argonaute 2通过AU-rich-element介导的翻译上调。单元格。2007;128:1105–1118. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 46Asirvatham AJ、Gregorie CJ、Hu Z、Magner WJ、Tomasi TB。微RNA靶向免疫基因和Dicer/Argonaute和ARE机械部件。分子免疫学。2007印刷前的epub。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
