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摩尔生物细胞。2009年1月15日；20(2): 600–615.
数字对象标识：10.1091/桶。E08-09-0925号
预防性维修识别码：PMC2626565型
PMID：19037097

Fas死亡受体增强内脏细胞膜交通向高尔基区汇合

毛罗·德格利·埃斯波斯蒂,通讯作者* 朱利安之旅,* 西赫姆·瓦斯蒂,* 萨斯卡·伊万诺娃,† 保拉·马塔雷斯,‡ 沃尔特·马洛尼,‡和罗亚·科斯拉维·法尔§
马科斯·冈萨雷斯-盖坦，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

死亡受体Fas/CD95通过参与包括内体在内的多种细胞器来启动凋亡。Fas信号与膜交通之间的联系尚不清楚，部分原因是不同类型的细胞可能存在差异。在对所有已知的内吞途径进行系统研究后，我们阐明了Fas激活可打开成熟T细胞中的氯氰菊酯非依赖性入口。这些入口推动表面蛋白（如CD59）的快速内化，并依赖于调节肌动蛋白Rho-GTPases，尤其是CDC42。Fas增强的膜交通总是在高尔基体周围产生内吞膜的堆积，再循环的内吞体在其中聚集。通过对各种膜标记物的共定位分析，已经证明了这种高尔基体周极化，并且也适用于与内化受体复合物相关的活性半胱天冬酶。因此，T淋巴细胞在Fas刺激后显示出内吞膜交通的转移，这似乎类似于激活后膜交通的极化。

简介

死亡受体通过“外源性”途径介导生理性细胞凋亡，因其与细胞外源性蛋白如肿瘤坏死因子-α和Fas-ligand（FasL）（CD95L）进行受体连接而得名。外源途径传统上被认为是由连接受体与衔接蛋白和相关酶形成的复合物产生的线性事件序列(Peter和Krammer，2003年). 然而，人们越来越认识到，Fas/CD95等死亡受体在触发后会迅速内化(Algeciras-Schimnich公司等人。, 2002;埃拉莫等人。, 2004;李等人。, 2006)在一个基本上等同于其他表面受体（如表皮生长因子）众所周知的内化过程中(迪菲奥雷和德卡米利，2001年). 由激活的死亡受体形成的复合物似乎在内化后维持信号传递，部分是利用内吞小泡的早期交通作为细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活的平台(李等人。, 2006; 囊性纤维变性。迪菲奥雷和德卡米利，2001年). 这种情况似乎尤其适用于I型细胞，它们不需要线粒体来激活caspase(Peter和Krammer，2003年).

我们身体的大多数细胞都需要线粒体才能沿着外源性途径进行细胞执行，通常被定义为II型(绿色等人。, 2003;Peter和Krammer，2003年). 其中包括成熟T淋巴细胞和相关细胞系，如Jurkat，这些细胞在贩运内化Fas/CD95方面与I型细胞有显著差异(Algeciras-Schimnich公司等人。, 2002;埃拉莫等人。, 2004;西格尔等人。, 2004;李等人。, 2006). 在这些细胞中，Fas刺激增加了膜探针的摄取N个-（3-三乙基丙基铵）-4-（二utilamino）苯乙烯基吡啶二溴(川崎等人。, 2000;马塔雷斯等人。, 2008)和脓毒症标志物(凯尼斯等人。, 2004;马塔雷色等人。, 2008). 此外，它还诱导内体与线粒体和其他细胞器的异常混合(瓦斯蒂等人。, 2007;马塔雷色等人。, 2008).

内吞细胞器的动力学形成了膜交通的一部分，它遵循不同的内吞入口(Conner和Schmid，2003年;市长和帕加诺，2007年). Fas触发后，氯氰菊酯依赖的内吞途径很可能在早期受到刺激，以利于受体内化(李等人。, 2006). 然而，Fas信号也通过半胱氨酸蛋白酶介导的该途径组分的裂解促进了氯氰菊酯依赖性内吞的进行性阻滞(奥斯丁等人。, 2006). 因此，尚不清楚Fas增强的内吞作用在多大程度上有助于死亡信号的传播(西格尔等人。, 2004;奥斯丁等人。, 2006;雷纳和哈辛格，2008年;Delalande链条等人。, 2008). 此外，Fas信号所涉及的特定门户尚未确定。

我们注意到Fas诱导的膜交通变化与之前记录的T细胞活化变化之间的有趣相似性。Fas信号增强内吞增加初始波后的胞吐(瓦斯蒂等人。, 2007;雷纳和哈辛格，2008年)，而T细胞活化增加了内吞作用和胞吐作用，这两种作用在细胞的不同侧面变得极化(Krummel和Macara，2006年). 鉴于这种相似性和不同的膜交通路线的复杂性，我们对T细胞中存在的每个内吞系统进行了系统研究(表1). 我们已经阐明，Fas增强了Rho-GTPase依赖的向高尔基区极化膜的途径。

表1。

T细胞内吞门户和系统

吞噬门脉或系统工具/标记此处测试和参考
吞噬作用刚果红酵母补充图S1A
巨胞饮磺胺罗丹明101补充图S1C，凯尼斯等人。(2004)
氯菊酯依赖性转铁蛋白，CD81图1C、，​C、 4D，4D、 和补充图S4A
奥斯丁等人。(2006);李等人。(2006)
氯菊酯和小窝蛋白不依赖，Rho GTPase依赖葡聚糖、CtxB、GPI锚定蛋白，如CD59图1,​,2,2,​,3,三,​,4,4,​,5,5,​,7,7、和​和88和补充图S1、S2和S3
川崎等人。(2000);凯尼斯等人。(2004);马塔雷斯等人。(2008)
微粒/外体CD59，二极管C18图5D和补充S3A；数据未显示
埃尔沃德等人。(2005)
滋养细胞增多症各种膜渍Luchetti和Degli Esposti，未出版
Davis和Sowinski（2008）

材料和方法

试剂

重组FasL购自Apotech/Alexis（瑞士洛桑）。荧光探针购自Invitrogen（Carlsbad，CA）。冻干的大蜗牛凝集素（HPA）（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）通过使用Invitrogen试剂盒与Alexa350（蓝色HPA）进行荧光偶联。CDC42的检测试剂盒来自Millipore（Billerica，MA），而抗体则从以下来源购买：异硫氰酸荧光素（FITC）-和别藻蓝蛋白结合的抗CD81（JS-81），BD Biosciences（英国牛津）的GM130和Fas/CD95（DX2）的单克隆，Invitrogen的FITC-结合的抗-CD59（MEM43），来自Leinco Technologies（密苏里州圣路易斯）的藻红蛋白（PE）/Cy5偶联抗CD59，以及来自Santa Cruz Biotechnology（加利福尼亚州圣克鲁斯）的FITC-偶联抗CD43（MEM-59）和抗溶酶体相关膜蛋白-1。艰难梭菌毒素B来自Calbiochem（加利福尼亚州圣地亚哥），N个-苄氧羰基Val-Ala-Asp氟甲基酮（z-VAD）来自Alexis实验室（加利福尼亚州圣地亚哥），其他试剂来自Invitrogen和Fisher（英国拉夫堡）。塞拉明A是科奇豪森实验室（马萨诸塞州波士顿哈佛医学院；佩利什等人。, 2006).

细胞培养

不同批次的人类急性T细胞白血病细胞系Jurkat J6.1是从欧洲组织收集中心（英国索尔兹伯里）获得的。同样，将相关CEM株和caspase-8缺陷株（由英国莱斯特MRC毒理学室M.McFairlane博士提供）的细胞培养在添加10%胎牛血清、50 U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，并在5%（vol/vol）CO的湿化气氛中培养237°C时。

免疫细胞化学

细胞重新悬浮在改良的Ringer缓冲液（RB；145 mM NaCl，4.5 mM KCl，2 mM MgCl）中2，1 mM氯化钙2用不同的荧光探针负载5 mM K-HEPES，pH 7.4，和10 mM葡萄糖）20–30分钟，清洗，并在～2×10培养6/在镀到涂有聚赖氨酸的盖玻片上之前，使用重组FasL或CH-11（通常最终浓度为0.5μg/ml）。在37°C下粘附10–15分钟后，将细胞置于冰上5分钟（以减少细胞移动），然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，然后用4%（wt/vol）多聚甲醛固定在PBS中。为了免疫检测内部蛋白，用0.5%Triton X-100或0.1%皂苷渗透细胞，用适当的血清封闭，用单克隆抗体孵育30–60分钟，再次清洗，然后用与AlexaFluor 488或罗丹明X偶联的次级抗鼠抗体孵养45–60分钟(瓦斯蒂等人。, 2007). 对于表面染色，用含有牛血清白蛋白的荧光标记单克隆抗体（针对每种单独应用进行了优化）稀释溶液处理固定细胞，以最小化背景结合(纳斯拉夫斯基等人。, 2004). 使用相应的同种免疫球蛋白偶联物评估非特异性荧光染色(埃尔沃德等人。, 2005).

荧光和时间间隔显微镜

荧光成像是在广域传统显微镜（蔡司[德国耶拿卡尔蔡司]或奥林巴斯[日本东京奥林巴斯]）和DeltaVision RT系统中进行的，其中图像是在20°C下用自动奥林巴斯IX71显微镜和油浸物镜采集的。使用软件Rx。3.4.3（Applied Precision，西雅图，华盛顿州），>30层的图像z（z）-0.2μm的截面用10个循环去卷积，然后沿着z（z）-如前所述的平面(瓦斯蒂等人。, 2007). 对于延时视频显微镜，将先前用各种探针标记的细胞接种在~5×106/ml（RB）涂敷在涂有聚赖氨酸的圆形盖玻片上（MatTeK，Ashland，MA）。使用徕卡DMIRE2显微镜、高灵敏度相机（光度级联II）和63×或100×物镜，在恒温箱（37°C）中加入FasL约8分钟后获得原始数据。使用ASMDW Y1.21软件（徕卡）处理图像。

细胞死亡的评估

为了评估在与内吞作用研究相同的条件下发生的早期细胞死亡水平，我们使用了前面描述的不可逆膜泡（称为“终末”）的目视检查(Stinchcombe公司等人。, 2001). Fas导致死亡的早期标志(韦斯等人。, 1995)通过将固定细胞的图像分析与长期实验的大量活细胞图像相结合进行评估，在这些实验中，Fas刺激导致线粒体和细胞完整性的丧失（参见。马塔雷斯等人。, 2008). 独立观察者对终末滤过泡的累积评分与caspase-3激活的阳性染色密切相关。

其他分析

通过流式细胞术评估caspase-8的激活(瓦斯蒂等人。, 2007)或用10-20μM Rho-IETD-bis负载细胞后的细胞荧光(帕卡德等人。, 2001). 使用相同的底物用平板读数器（Fluoroskan Ascent；Thermo，Basingstoke，United Kingdom）测量细胞亚组分中的胱天蛋白酶激活(瓦斯蒂等人。, 2007). 使用刚果红染色酵母评估吞噬作用(卢吉尼等人。, 2003)而大胞饮作用是用液相示踪剂测量的。如前所述，进行了固定Ruby-dextran（10kDa；Sigma Chemie）的摄取(尼科尔斯等人。, 2001)并按照前面所述进行评估(Sabharanjak公司等人。, 2002)，而转铁蛋白（Tf）的稳态流量随后是Alexa594-共轭转铁蛋白(布兰查德等人。, 2002;纳斯拉夫斯基等人。, 2004). HPA和小麦胚芽凝集素（WGA）结合物被用作膜交通的广泛标记以及表面细胞修饰(Degli Esposti，2008年).

图像分析

图像通过ImageJ（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院；http://rsb.info.nih.gov/ij/)或偶尔使用DeltaVision RT程序的软件例程（共定位阈值设置为50）。通常使用ImageJ的插件“共定位阈值”对共定位进行定量分析，该插件使用的阈值算法为成本等人。(2004)(http://www.uhnresearch.ca/facilities/wcif/imagej/appendix_ii). 这产生了两个互补但独立的参数，一个是根据阈值调整的单通道特定曼德系数tM1或tM2，另一个是皮尔逊全球共定位相关指数（Rtot）。Mander的tM1和tM2系数归一化为每个通道的总像素强度（适当减去背景），因此与通道荧光的绝对强度无关(成本等人。, 2004). 相反，皮尔逊指数表示覆盖在通道图像中的所有非零像素的r。它与背景无关，但对单个通道强度敏感，其值系统地低于Mander系数，部分原因是它的理论最小值为−1，最大值为1(梅纳杰等人。, 2007)而曼德系数从相当于皮尔逊值0的无偏阈值到最大值1不等。去卷积z投影的RGB.tiff文件被分割成8位图像，每种颜色具有256个灰度强度通道，然后使用细胞外的感兴趣区域（ROI）和ImageJ中的“从ROI中减去背景”例程清除背景。通过对内源性FasL进行差异染色后，使用红绿色HPA或红绿色二级抗体的共染，以10的比例因子完全消除出血和非特异性背景。阈值共定位的标准设置列在图例中图2.

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Fas改变霍乱毒素B的运输。（A）在2μg/ml四甲基罗丹明B异硫氰酸盐结合HPA（红色）和1μg/ml Alexa488-结合CtxB（绿色）存在下，FasL处理活Jurkat细胞30分钟。在所有样本的相同设置下，用100倍物镜采集去卷积图像，并使用阈值共定位插件进行分析（参见材料和方法)，计算中不包括同位像素和零像素的恒定强度。该插件生成了所示的RGB图像，其中同位像素的相对强度以255级灰度与红色和绿色通道合并呈现。棒材，5μm。（B） 使用与A中所述相同的设置进行Colocalization分析；数据表示四个独立实验的平均值±SE。Mann-Whitney检验表明，tM1（红色HPA比绿色CtxB）和tM2（绿色CtxB比红色HPA）的差异显著，分别为0.007和0.06，但后者在两个样本中也显示p<0.05t吨测试和方差分析测试。（C） 在与A中描述的实验等效的实验中，分析了不同的细胞图像（n=15），在该实验中，Fas被激动剂抗体CH-11刺激30分钟。该图表示皮尔逊总体共定位指数Rtot的95%置信区间，与计算的阈值无关(成本等人。, 2004); 统计检验表明，Mann–Whitney的显著性水平为0.0013，两个样本的p=0.001t吨测试。

CD59和CD81扩散评估

我们评估了针对不同表面蛋白CD59和CD81的单克隆抗体荧光偶联物的内部化和细胞内分布。这些蛋白质的构成性运输遵循不同的内吞途径(弗里青等人。, 2002;纳斯拉夫斯基等人。, 2005;Meertens公司等人。, 2006). 三名独立观察者对至少四个独立实验的高分辨率图像进行了形态学分析，并对细胞进行评分，当细胞显示出与正常表面模式有强烈变化的抗体染色时，细胞会“扩散”。这种传播水平与霍乱毒素（CtxB）抗体染色和亚单位B的共定位值高度相关。

统计分析

结果显示为包含平均值±SE的直方图或定义数据变化95%置信度的区间图。使用软件包MiniTab15，通过非参数Mann–Whitney检验和参数检验（如方差分析（ANOVA））对样本之间的差异进行统计显著性检验(www.4ulr.com/products/统计分析). 当至少两个独立测试得出显著性水平或p值<0.05时，统计显著性被认为很强。

结果

Fas仅刺激T细胞株的某些胞吞门

在我们努力理解Fas增强的膜交通机制时，我们首先排除了Fas刺激可能改变T细胞系吞噬和大胞饮作用的基础水平（补充图S1，参考。表1). 我们还发现，无论是用同源配体还是用激动剂抗体CH-11刺激Fas，都能同样增强caspase非依赖性的内吞波，因为caspase-8的基因消融或泛caspase试剂z-VAD的抑制并不能改变Fas增强的右旋糖酐内吞(马塔雷斯等人。, 2008)和HPA(Degli Esposti，2008年). HPA被用作参考膜标记物，因为它可以访问多种膜交通途径，类似于其他凝集素，如WGA(维特莱恩等人。, 2002;Cresawn公司等人。, 2007;Degli Esposti，2008年).

Fas激活比氯氰菊酯依赖性内吞增加更多的胞浆增多症

鉴于先前的研究报道Fas信号增加了网格蛋白依赖性的内吞作用(奥斯丁等人。, 2006;李等人。, 2006;科尔哈斯等人。, 2007)或胞饮症(凯尼斯等人。, 2004;马塔雷斯等人。, 2008)，我们对Jurkat细胞中的这些不同入口进行了直接比较。红色荧光标记物在与外部蓝色HPA的稳态平衡条件下培养，由于探针的荧光分离较大，因此允许进行严格的共定位分析。为了标记已建立的氯氰菊酯非依赖性内吞门户，我们最初使用了Ruby-dextran，它以前被描述为通过氯氰和动力非依赖性外吞内化的内吞元素的液相标记物(Sabharanjak公司等人。, 2002;柯克汉姆等人。, 2005;程等人。, 2006). 确认流式细胞术研究（补充图S1和马塔雷斯等人。, 2008)，Jurkat细胞图像显示FasL治疗后Ruby-dextran的摄取明显增加(图1、A和B）。一些装有Ruby-dextran的小泡对内吞HPA也呈阳性(图1A、 箭头）。虽然进行了定量分析(成本等人。, 2004)表明FasL处理的细胞中Ruby-dextran和蓝色HPA之间的总体共定位水平适中，这些水平非常显著，因为未处理的细胞对葡聚糖的摄取很低，因此共定位可以忽略不计（补充图S2A）。值得注意的是，Ruby-dextran在内化后早期广泛反流(查达等人。, 2007).

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在FasL处理的细胞中，右旋糖酐的吞噬作用比转铁蛋白的增强。（A） Jurkat T细胞在RB中与10μg/ml Alexa350-HPA（外蓝色HPA）和1 mg/ml Ruby-dextran（10 kDa）在无或存在0.5μg/ml FasL的情况下在37°C下孵育30分钟，然后在低温下清洗，然后进行电镀和固定。图像由DeltaVision RT反褶积显微镜（60×油浸物镜）采集，投影35–40 0.2微米z（z）-烟囱(瓦斯蒂等人。, 2007). （B） 直方图显示了如前所述计数的红色右旋糖酐阳性细胞的数量(Sabharanjak公司等人。, 2002)在三个类似实验中的一个中；>每个样本在低倍镜下对80个细胞进行成像。（C） 如A所述，用蓝色HPA和FasL培养Jurkat细胞；在低温下离心后，将其重新悬浮在含有5μg/ml Alexa594-共轭Tf的RB中，在37°C下悬浮10分钟（包括贴在盖玻片上），并在成像前固定，这是由DeltaVision RT反褶积显微镜在相同设置下对所有样品进行采集的。最右边的面板显示了使用DeltaVision RT软件例程计算的共定位像素（白色）。生成的图像与使用补充图S2A中使用的阈值设置获得的图像等效。

接下来我们用荧光标记的Tf研究了氯氰菊酯依赖的内吞作用(布兰查德等人。, 2002;奥斯丁等人。, 2006). Tf染色显示皮质和旁核的联合分布，但只有后者在FasL处理30分钟后增加(图1C） ●●●●。内化的HPA与Tf-标记元素的配色作用受到限制，并集中在高尔基体区域周围，在高尔基区域中，再循环的内体簇（平均皮尔逊指数为0.14，在图1C、 n=14个单元格）。因此，Fas介导的Tf分布变化看起来与T细胞活化后观察到的Tf受体的极化交通相似(布兰查德等人。, 2002). 通过类比，Tf分布的Fas诱导极化(图1C） 可以反映出进入再循环内吞体的增强，不同的内吞途径清空货物(Sabharanjak公司等人。, 2002;van Ijzendooron，2006年). 因此，早期Fas信号转导增加了在氯氰菊酯非依赖性内吞作用后对胞饮标记物的摄取(市长和帕加诺，2007年)而Tf是氯氰菊酯依赖性内吞作用的经典标志物。然而，Fas也使膜交通向含有再循环内体的区域极化，随后标记为“高尔基体周围”（补充图S2B）。

Fas刺激诱导HPA沿高尔基体迁移

为了有效地可视化T细胞高尔基周围区域的膜交通，我们随后使用了与膜成分（如CtxB的荧光衍生物）永久结合的标记物，该荧光衍生物沿着与网格蛋白无关的途径向高尔基周围再循环内体汇合而迅速内化(Sabharanjak公司等人。, 2002;柯克汉姆等人。, 2005;程等人。, 2006;查达等人。, 2007). 这些途径不包括小窝蛋白依赖的内吞作用，这通常有助于CtxB的运输(柯克汉姆等人。, 2005;查达等人。, 2007)，因为T细胞不表达小窝蛋白(Deckert公司等人。, 1996;奥兰迪和菲什曼，1998年). 在Jurkat和初级T细胞中，CtxB流量在孵育30分钟内达到平衡(图2). 随着Fas刺激时间的延长，CtxB染色逐渐分散到细胞外周，随后依赖caspase激活的Golgi相关膜扩散(瓦斯蒂等人。, 2007;Degli Esposti，2008年). 因此，CtxB的特征性高尔基体周围分布（通过高尔基体特异性标记GM130的反染进行验证；补充图S2B）为观察半胱氨酸蛋白酶激活前的膜交通变化提供了有价值的内部参考。

CtxB与内吞HPA共染表明Fas刺激细胞中共定位增强的模式一致(图2). FasL处理增加了CtxB的摄取，在高尔基体周围区域产生了一种与对照条件相比似乎“肥大”的积聚(图2A） ●●●●。在该区域，内吞HPA标记的元素与CtxB标记的膜强烈共定位(图2A） ●●●●。使用阈值方法评估像素共定位(成本等人。, 2004)经FasL处理后，红HPA与绿CtxB的门限调节曼德系数（tM1）平均值增加了一倍以上(图2B、 显著性为0.04，Mann-Whitney检验）。绿色CtxB与红色HPA共定位的相反tM2值也增加了，尽管与tM1值相比，其统计显著性较弱(图2B） ●●●●。然而，使用皮尔逊总体共定位指数（Rtot）进行的互补定量分析显示，Fas刺激后HPA与CtxB的总体共定位显著增加，该指数与Mander系数相比差异显著，潜在值的分布范围更广(图2C） ●●●●。

在渗透性细胞中，HPA有效地标记了CtxB聚集的高尔基周围区域(佩雷斯·维拉尔等人。, 1991;瓦斯蒂等人。, 2007). 渗透细胞的三重标记表明，Fas刺激强烈增加了内吞红色HPA与绿色CtxB和内部蓝色HPA的共定位(图3、A和B）。这在没有改变CtxB与内部HPA的强共定位的情况下发生，因为在FasL治疗后，它们的平均阈值调整曼德系数在0.684–0.657之间变化。在双HPA实验中，进一步证实了内化HPA的高尔基周分布增加（参见。瓦斯蒂等人。, 2007). 在caspase-8缺陷的Jurkat细胞中进行的相同实验显示，内化的HPA和内部HPA之间的强共定位结果相当(图3C、 右直方图），证实Fas增强的内吞膜和高尔基相关膜的共定位是独立于顶端半胱天冬酶的。

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HPA与CtxB的细胞内变化。（A） 样品按照图2A、 但在固定后，用未标记的HPA淬火（以减少表面染色），用Triton X-100渗透，用2μg/ml蓝色HPA染色以标记Golgi相关膜(Degli Esposti，2008年). 用100倍物镜采集去卷积图像。棒材，5μm。（B） 同位化水平（平均值±SE）的详细评估如下：图2B使用A中描述的三个或更多细胞图像；星号表示统计显著性较高（<0.02，Mann-Whitney检验）。（C） 在双HPA染色的单独实验中获得共定位值（参见。瓦斯蒂等人。, 2007)通过使用野生型（左边的直方图）和caspase-8缺陷的Jurkat细胞（右边）。对照细胞和FasL处理细胞之间的差异计算出0.03的显著性水平（Mann-Whitney检验）。（D） 红HPA和绿CtxB共染细胞的单帧延时视频图像（63×物镜）图2A、 经FasL处理后，聚焦于选定的场区后获得，其初始亮场图像显示在左侧。

为了进一步验证内吞HPA向高尔基周围区域的极化，我们接下来在与红色HPA和绿色CtxB共染后，对附着在多聚赖氨酸涂层孔上的Jurkat细胞进行了活细胞成像。虽然以这种方式获得的宽视野图像缺乏固定细胞的去卷积图像的分辨率，但它们为用FasL处理后HPA标记的膜向CtxB标记的膜的动态运动提供了明确的证据(图3D） ●●●●。

Fas刺激CD59流量

接下来，我们跟踪了CD59特异性荧光标记抗体的细胞分布，CD59是一种丰富的T细胞蛋白(Deckert公司等人。, 1996)通过糖基-磷脂酰-肌醇（GPI）固定在质膜外部。至于其他GPI-锚定蛋白，CD59的构成性交通是由与氯氰菊酯和动力学无关的内吞门户特异驱动的(尼科尔斯等人。, 2001;Sabharanjak公司等人。, 2002;纳斯拉夫斯基等人。, 2004;市长和帕加诺，2007年). 此外，CD59的分布通常局限于Jurkat细胞表面的簇(Deckert公司等人。, 1996). 因此，我们推测CD59可能是评估Fas诱导的结构性内吞变化的理想报告物。

FasL处理后不久，由于快速内化，荧光抗CD59抗体的表面限制性分布消失，随后在细胞内部广泛重新分布(图4、A和B）。在Fas刺激后30分钟内，几个细胞出现CD59阳性膜，并汇聚到内吞的HPA上，增加了它们在高尔基周围区域的共定位(图4、B和C）。作为相关的对照，我们跟踪了CD81特异性荧光抗体的内化，CD81是一种主要通过网格蛋白依赖性内吞作用进行的表面蛋白运输(弗里青等人。, 2002;Meertens公司等人。, 2006). 与CD59相反，在Fas刺激后，CD81仍局限于皮层和表面元件，与HPA的内部共定位非常少(图4D） 。CD59在高尔基体周围区域的特异性积累随后在CtxB的共线性实验中得到了定量证实(图5).

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Fas刺激改变CD59流量。（A） 用非活化抗CD59-FITC（1:10）和红色HPA标记的细胞在FasL孵育前（对照组）和孵育30分钟后，获得低增强图像（非退化60×，以显示细胞染色的整体外观）。箭头表示高尔基体周围的染色积聚。相应的差分干涉对比度图像显示在右侧。（B） 在与a.Arrows的实验相同的条件下，用100倍物镜获得了去卷积图像。Arrows指向高尔基体周围的共聚焦膜元件。（C） B组实验中n=9（对照组）和n=20（+FasL）细胞的皮尔逊共定位指数区间图。0.0014时数值分布显著不同（Mann-Whitney检验）。（D） 用FITC-CD81抗体对Jurkat细胞进行典型染色，在加入FasL 30分钟前后30分钟达到平衡，如B所述。注意与内化红HPA的有限共定位。棒材，5μm（B和D）。

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Fas导致CD59相对于HPA和CtxB的流量发生变化。（A） 图像是在实验中获得的图4A.最右边的面板显示了阈值插件应用于内吞HPA（红色）和内吞CD59（绿色）的合并通道时获得的共定位像素（灰色）的轮廓。（B） 面板显示在与A中所述相同的条件下获得的代表性图像，不同之处在于PE/Cy5缀合的抗CD59（红色）与绿色CtxB共染色图2.（C）直方图表示三个独立实验的平均值±SE，如A中的平均值（绿色直方图，报告CD59绿色对红色HPA的阈值调整曼德系数）和B中的平均数（右侧的红色直方图中，报告CD59-红色对绿色CtxB的阈值调整曼德系数）。通过Mann-Whitney试验，FasL处理的细胞在0.0265（tM2）和0.0074（tM1）时的值存在显著差异。棒材，5μm。（D） 时间推移图像（使用100倍物镜获得，如图3D） 选自补充电影1。细胞与红色HPA和绿色CtxB共染图4A.注意细胞内染色聚合后，共染色膜颗粒（红色箭头）被排出（白色箭头）。棒材，5μm（A和B）。

Fas诱导的改变包括外部突起中抗CD59抗体的增加，其中一些抗体脱落在细胞体外(图4A和​和5D5D和补充电影1）。凋亡细胞的质膜脱落（有时称为“胞吐”）以前曾被描述过(Distler公司等人。, 2005;皮尔泽等人。, 2005)据报道也存在于Fas刺激的Jurkat细胞中(埃尔沃德等人。, 2005). 然而，富含CD59的膜颗粒的释放强烈依赖于顶端半胱天冬酶的激活(埃尔沃德等人。, 2005). 通用抑制剂z-VAD阻断半胱天冬酶不仅减少了Fas诱导的膜颗粒排出，还增强了抗CD59抗体的内化(图6A和补充图S3A）。重要的是，Fas刺激也增强了初级活化T淋巴细胞中CD59的内化（补充图S3B）。这表明CD59流量的快速改变是Fas刺激T细胞的一般反应。

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Fas增强的CD59的运输被Rho-GTPase抑制剂阻断。（A） 这些图代表了实验中n>6个细胞图像中CD59和CtxB共定位的95%置信区间，该实验相当于图5B.对照细胞用非活化Fas抗体处理30分钟，而其他细胞在没有（仅CH-11）或存在50μM z-VAD、20μM塞卡明a或100 ng/ml的情况下用CH-11处理30分钟艰难梭菌毒素B（所有这些化合物在激活Fas前均预先孵育30分钟）。含有抑制剂的对照细胞在未处理细胞的间隔内显示值。对照样品的差异显著，CH-11单独为0.008，CH-11+z-VAD为0.002（Mann-Whitney检验），但其他样品的差异不显著（例如CH-11+secramine为0.83）。相反，对于加赛克拉明的样品和加赛克拉敏的样品，仅CH-11的差异在0.024和0.017显著艰难梭菌毒素B。值得注意的是，在一项平行流式细胞术实验中，塞卡明将CtxB的摄取减少了30%。（B） 结合三名观察者的独立评分评估CD59细胞扩散的药理学特征。抗CD59荧光抗体的细胞分布在高分辨率图像中进行，表现出CD59染色的细胞与正常表面模式发生强烈变化，并对其进行评分，以显示“扩散”（细胞内分布增加）。直方图表示所示实验次数的平均±SE。差异在<0.03时具有统计学意义（Mann-Whitney检验）。（C） CD81细胞扩散的平均值（参见。图4D） 在n=4个实验中，通过使用与CD59相同的形态学评分进行评估，并用与B中所述相同的量表进行表示。Fas刺激没有显著改变CD81的主要表面染色（Mann–Whitney或ANOVA检验的p>0.3）。

Fas刺激Rho-GTPase依赖性细胞内吞

接下来我们研究了Fas诱导CD59分布改变的机制。氯菊酯非依赖性内吞运输CD59需要肌动蛋白调节Rho-GTP酶(Sabharanjak公司等人。, 2002;柯克汉姆等人。, 2005;程等人。, 2006)，被毒素B累积阻断艰难梭菌(市长和帕加诺，2007年). 预处理艰难梭菌毒素B的浓度可阻断Rho GTPases而不损害其活性(奥多利等人。, 2005)强烈抑制Fas诱导的CD59内化及其与CtxB和HPA的共定位(图6和​和7）。7). 通过定量分析CD59和CtxB之间的共定位，获得了互补结果(图6A） 通过CD59标记膜的细胞扩散评分，与CD81相反，Fas刺激细胞的细胞扩散显著增加(图6、B和C）。事实上，当毒素存在时，在Fas刺激前后CD59染色几乎没有改变，类似于CD81染色的不变模式(图7A和补充图S4A）。我们证实了艰难梭菌这种毒素主要通过使用赛克胺A阻断CDC42，赛克胺是一种专门抑制CDC42的化合物(佩利什等人。, 2006). 塞克拉明A的结果基本上与塞克拉敏A的结果重叠艰难梭菌CD59和CtxB共定位后的毒素B(图6A） 以及CD59的内部分布(图6B和​和77B） 。

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Rho-GTPase抑制可消除Fas诱导的CD59分布变化。（A） FasL处理（15分钟）增加了与红色HPA共孵育的绿色CD59的内吞流量，如图40.1μg/ml预处理后，FasL没有改变CD59的细胞分布艰难梭菌毒素B（底部）。用100倍物镜拍摄去卷积图像。（B） 在没有或存在20μM塞卡明的情况下，用FasL孵育30分钟之前（顶部）和之后（底部），具有代表性的60×内部化CD59-FITC染色图像，在Fas刺激前30分钟孵育。棒材，5μm。

Fas和Caspases与HPA在高尔基体周围区域的定殖

迄今为止所获得的结果强调了Fas诱导的膜交通改变的一个共同特征，即向心收敛于高尔基体周围区域。接下来，我们讨论了这个问题，即这是否与Jurkat细胞和I型细胞之间内在化Fas受体流量的记录差异有关(阿尔基西拉斯·希姆尼奇等人。, 2002;埃拉莫等人。, 2004;索德斯特伦等人。, 2005;李等人。, 2006). 在I型细胞中，结扎的死亡受体及其相关的DISC遵循快速的网格蛋白依赖性内化，最终进入晚期内体/溶酶体。这在Jurkat细胞中少量存在(李等人。, 2006)，而其他II型细胞显示出死亡受体的有限或延迟内化(埃拉莫等人。, 2004;奥斯丁等人。, 2006;马塔雷斯等人。, 2008).

为了追踪T细胞中连接的CD95/Fas的途径，我们首先分析了在饱和其同源受体的浓度下添加的FasL的内化(图8A、 参见。埃拉莫等人。, 2004). 40–60分钟后，在与CtxB共定位的细胞内元件中发现与Fas结合的FasL比例(图8A） 或内吞HPA(图8、A和B；另请参见图9A和补充图S4B）。因为在受体内化过程中也会发生DISC组装和procaspase-8的募集，所以连接Fas的细胞内位置与顶端caspase的初始细胞内激活相一致(李等人。, 2006). 然后，我们使用对caspase-8名义上特异的荧光底物罗丹明110-IETD-双酰胺（Rho-IETTD-bis）研究活性caspase的亚细胞分布，从而能够直接测量细胞内caspase激活(帕卡德等人。, 2001). 当对照细胞在装载Rho-IETD-bis后偶尔出现亮绿色染色时，它也显示出晚期死亡的迹象，并有累积的液泡，部分原因是底物在酸性条件下与组织蛋白酶D反应（S.Ivanova，未发表的数据）。除此背景外，Rho-IETD-bis的点状染色发生在Fas刺激的30至60分钟之间，在高尔基体周围逐渐累积。因此，活性半胱天冬酶与内吞HPA广泛共定位，这与通常的共定位分析进行了定量验证(图8、C和D）。

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Fas增强了高尔基周区活性半胱天冬酶的收敛。（A） 超FasL处理是在与绿色CtxB和蓝色HPA混合的细胞中进行的，如在图1和​和2。2培养50分钟后，将Jurkat细胞贴在盖玻片上，用冷甲醇固定(西格尔等人。, 2004)然后用FasL单克隆抗体处理，然后用罗丹明X共轭二级抗体检测连接的CD95/Fas（参见。埃拉莫等人。, 2004). 去卷积后获得未处理（顶部）和FasL处理（底部）细胞的代表性100倍图像。中央面板显示红色（反FasL）和绿色（CtxB）通道之间的同位像素图像，而最右边的面板显示合并的RGB图像。（B） 这两个面板由阈值共定位插件生成，显示了A中描述的相同图像的红色（抗FasL）和蓝色（内吞HPA）通道之间的共定位像素。定量分析显示，未经处理的细胞的平均Pearson指数分别为～0，FasL处理的细胞为0.162（n=4）。（C） 在10μM Rho IETD bis存在下，用FasL处理Jurkat细胞长达1小时，产生染色，这主要是由于胱天蛋白酶-8的激活。用活性半胱天冬酶的Rho-IETD-bis染色对红色HPA的共定位进行定量评估，使用7个（对照）到10个（FasL处理45分钟）细胞图像，这些图像用阈值法进行分析，如图2阈值调整曼德系数的平均值在0.0008时显著不同（曼恩-惠特尼检验）。（D） 评估主动DISC的内部化(李等人。, 2006)，我们用荧光Rho-IETD-bis追踪顶端caspase活性的进展。caspase-8的功能染色逐渐向高尔基体周围区域极化，如下图所示获得的灰度同位像素图像所示图2（最右边的面板）。棒材，5μm。

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Fas刺激通过caspase激活和细胞死亡的扩散增强其内在化。为了评估CD95/Fas的全部补体，我们对固定的细胞进行染色图8使用抗CD95单克隆抗体DX2的FITC-偶联物(李等人。, 2006). Fas刺激40分钟后，检测到显性caspase-3激活的时间（补充图S4C），该染色与内部HPA共定位的比例增加，如阈值插件获得的共定位像素图像所示（最右边的面板）。（B） 活性caspase-3的染色是在一项平行实验中获得的，HPA标记的细胞用0.1%的皂甙渗透，方法是使用针对活性caspase-3的兔抗体，然后是Alexa488-共轭次级。顶部面板显示了一个细胞，显示了caspase-3标记元素在细胞外围的典型早期分布，逐渐向紧密的高尔基体周围区域极化。下图显示了具有晚期胱天蛋白酶激活的细胞的典型模式，其中高尔基体区域已经分散和碎裂。请注意，由于Alexa488的荧光比FITC的荧光更亮，因此绿色染色比A更清晰，这也使得检测比以前的工作更灵敏（例如。，埃拉莫等人。, 2004). 棒材，5μm。（C） 直方图表示在不同实验中评估的终末气泡的平均±SE值，对一组包含每个样本>1000个细胞的～60个字段进行评分。对于仅用CH-11处理的细胞样本，+z-VAD、+secramine和+艰难梭菌毒素B（使用针对领带进行调整的Mann-Whitney测试）。使用参数测试，样品+塞卡明也显示出显著差异（单因素方差分析p=0.024，双样品p=0.033t吨测试；n=6个实验）。

通过直接染色细胞内存在的所有CD95/Fas补体，也可以检测到Fas与HPA的共定位，并且在受体刺激40分钟后，细胞内元件中的Fas明显增加(图9A） ●●●●。此时，我们一致检测到细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活与荧光底物和蛋白酶活性形式的免疫染色(瓦斯蒂等人。, 2007). 通过后一种方法，我们追踪了激活的caspase-3、caspase-8的主要底物和主要执行者caspase的细胞内分布(图9B） ●●●●。随着Fas信号传导的进行，caspase-3阳性元件从细胞外周向细胞内移动，积聚在高尔基体周围区域，与内吞的HPA共定位(图9B） ●●●●。高尔基体依赖半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解后(瓦斯蒂等人。, 2007)、caspase-3-和HPA阳性膜在整个细胞中继续密切相关(图9B、 底部）。

有趣的是，Rho-GTPase的抑制略微降低了Fas刺激细胞内caspase激活的整体强度（补充图S4C），这表明Rho-GTP酶依赖的膜交通途径不太可能促进DISC组装。那么Rho GTPases是否影响了死亡传播的下游步骤？为了回答这个关键问题，我们通过分析确定了终末期气泡的水平，这是Fas诱导死亡的早期标志(韦斯等人。, 1995)这可以在与我们的内吞作用研究相同的条件下进行评估（见材料和方法和补充图S4D）。伴随着caspase激活的初始增加，终末起泡的基础水平增加了10倍以上(图9C） ●●●●。正如预期的那样，用z-VAD阻断胱天蛋白酶降低了这种早期死亡的指标(图9C） ●●●●。然而，也有赛克拉明和艰难梭菌毒素B显著减少Fas增强的终末气泡(图9C） ●●●●。因此，我们的结果表明，在DISC组装后早期激活的Rho GTPases可能有助于T细胞中的死亡传播，这与之前的证据一致，即受体刺激的内吞作用和凋亡信号之间存在联系(李等人。, 2006;马塔雷斯等人。, 2008).

讨论

尽管在多份报告中得到确认(川崎等人。, 2000;凯尼斯等人。, 2004;李等人。, 2006;瓦斯蒂等人。, 2007;马塔雷斯等人。, 2008)Fas增强内吞作用的机制和意义尚不清楚(西格尔等人。, 2004;奥斯丁等人。, 2006;Delalande链条等人。, 2008;雷纳和哈辛格，2008年). 在这里，我们澄清了Fas刺激的T细胞打开了驱动CD59流量的Rho GTPase依赖门户(图4​4​–7). Fas信号也会导致内吞膜向高尔基体的整体极化，这是一项新发现，其重要意义将在下文中讨论。

我们已经广泛使用HPA作为一种通用的膜标记物，可以进入不同的内吞入口和分泌细胞器。该标记对于观察Fas刺激诱导T细胞膜交通的特殊变化至关重要，即高尔基体周围区域早期和再循环内体的积累。此前，我们报道FasL处理的细胞显示，内化的HPA与早期分泌系统的膜标记物GM130和ERGIC-53的融合增加(瓦斯蒂等人。, 2007). 同时，HPA标记的膜也与线粒体共定位(瓦斯蒂等人。, 2007)进而与早期内体相关(川崎等人。, 2000;马塔雷斯等人。, 2008). 其他研究表明Fas与CtxB在细胞内共定位(西格尔等人。, 2004;勒让布尔等人。, 2005)，通常集中在哥尔基周边地区(图2和补充图S2B；囊性纤维变性。Sabharanjak公司等人。, 2002). 我们现在可以将所有这些证据合理化为Fas增强的内吞交通在高尔基体周围区域的表达，高尔基体膜和线粒体聚集在一起（有关综述，请参阅Degli Esposti，2008年). 因此，先前观察到的线粒体和其他细胞器的混合可能代表了Fas诱导的膜交通极化。

这些考虑可以扩展到其他II型细胞，但不适用于I型细胞。CD95/Fas表面下调后获得的大量证据表明，I型细胞通过增强氯氰菊酯依赖性内吞作用对Fas刺激作出反应，伴随着这种内吞作用，连接的受体迅速内化并形成移动信号平台(Algeciras-Schimnich公司等人。, 2002;李等人。, 2006). 这种内吞途径最终对Fas及其相关DISC进行内溶酶体降解分类，从而导致信号衰减。

II型细胞没有表现出快速降解的等效分类(李等人。, 2006;瓦斯蒂等人。, 2007)表明膜交通从晚期内体/溶酶体转移。为了证实这种可能性，我们在此证明Fas刺激将膜交通集中并极化到T细胞的高尔基周围区域，在该区域内循环的内体将内吞途径连接到外吞途径(van Ijzendoorn，2006年;梅纳杰等人。, 2007). 交通流转向再循环的内体可以提供进入细胞的Fas信号的空间分离，从而产生两种相互联系：1）在内吞元件和胞吐之间，这也驱动Fas诱导的新死亡受体分子传递到细胞表面(莱茵和哈辛格，2008年); 和2）在内吞元件和线粒体之间，它们的混合可能有助于线粒体膜启动Bcl-2蛋白的促凋亡作用(马塔雷斯等人。, 2008).

这两种相互连接突显了II型细胞的特征，如连接Fas受体的延迟下调(埃拉莫等人。, 2004;Delalande链条等人。, 2008)线粒体对caspase扩增的关键作用(Peter和Krammer，2003年). 此外，进入再循环内体的流量增加可能有助于将活性半胱天冬氨酸酶路由至选定的细胞隔室，特别是分泌细胞器，在分泌细胞器中，它们的作用促进内膜向外运动(埃尔沃德等人。, 2005;瓦斯蒂等人。, 2007;Rheiner和Häussinger，2008年). 这些内膜含有新合成的Fas，一旦传递到细胞表面，就可以通过与其他FasL分子结合而产生信号持久性。这一过程将部分补偿结扎受体的持续内化，并可能增强细胞内信号传递，直到线粒体完全参与。

在交通转向回收内体的新观点中，Fas信号如何在不同细胞类型中产生不同种类的内吞膜？我们最简单的解释是，组装好的DISC促进T细胞和其他II型细胞中Rho GTPase的激活，但在I型细胞中不起作用。除了我们的Rho-GTPase抑制数据(图6和​和7），7)，研究苏巴斯特等人。(2000)和索德斯特伦等人。(2005)为CDC42和相关GTPase的早期激活提供支持性证据，而这在I型细胞中并不存在。此外，Rho GTPases也存在于再循环内体中，在其中它们可能进一步刺激膜交通。

小Rho-GTPase CDC42主要驱动T细胞中Fas刺激的膜交通，原因如下：1）它促进GPI-锚定蛋白如CD59的选择性交通(Sabharanjak公司等人。, 2002;市长和帕加诺，2007年)我们发现Fas活化后迅速改变(图4​4​–7); 2） Fas刺激后早期激活(苏巴斯特等人。, 2000)如我们的实验所证实的（未公布的数据）；3） 它被半合成化合物塞卡明A选择性抑制(佩利什等人。, 2006)，取消了CD59流量的更改(图6和​和7）；7); 4） 它位于Rac的上游，促进丝状伪足和其他表面突起，这些突起被艰难梭菌毒素B(马洛尼等人。, 2003)以及CD59交通变更的减少(图6); 5） 它是细胞极性的中央调节器(艾蒂安·曼尼维尔，2004年)我们发现Fas刺激增加了向高尔基体区域的膜交通极化(图2​2​​–7); 和​和6）6)当以其组成活性形式表达时，它促进Jurkat细胞的细胞死亡(创等人。, 1997)我们发现，塞卡明对其抑制可减少早期细胞死亡(图9C） ●●●●。

在阐明内吞作用和Fas细胞内信号之间的联系时，我们的工作为理解膜交通在T细胞死亡程序中的生物学作用开辟了新的视角。值得注意的是，膜交通的极化再循环是活化T细胞的一个关键特性，它使细胞与免疫系统的其他细胞进行细胞间通信(Krummel和Macara，2006年). 我们目前正在研究Fas诱导的细胞死亡过程中细胞内膜交通和细胞间通讯形式之间的联系。

补充材料

【补充资料】

鸣谢

我们感谢Jose’Rodriguez Arellano、Martin Lowe、Francesca Luchetti、Gareth Griffiths（IMAGEN，英国曼彻斯特）和Boris Turk博士的讨论和支持。我们感谢R.Paddon、M.Xie、C.Roberts、J.Reid和曼彻斯特大学生物成像设施提供的技术帮助。M.D.E.的研究得到了生物技术和生物科学研究委员会（Biotechnology and Biological Sciences research Council）拨款BB/C50846的支持，而R.K.承认国家卫生研究院/国家心脏、肺和血液研究所（National Health Institutes of National Heart，Lung，and Blood Institute）拨款HL080192。

使用的缩写：

空气污染指数别藻蓝蛋白
高性能放大器大蜗牛凝集素
Rho-IETD-bis罗丹明110羰基-Ile-Glu-Thr-Asp-bisamide
体育课藻红蛋白
皇家银行改良振铃缓冲区
z-VAD（z-VAD）N个-苄氧羰基-Val-Ala-Asp-氟甲基酮
世界黄金协会小麦胚芽凝集素。

脚注

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E08-09-0925)2008年11月26日。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会