诱导活性氧对p53介导细胞命运决定的影响

腺病毒感染。

如前所述，含有p53（Adp53）、B.Vogelstein（马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学）慷慨捐赠或LacZ（AdLacZ）的腺病毒被扩增(22). 将细胞暴露于10μl适当稀释的病毒储备中。

FACS分析。

将荧光染色的细胞转移到带有细胞过滤帽（Falcon）的聚苯乙烯管中，并使用cell Quest 3.2软件（Beckton Dickinson）进行荧光激活细胞分选（FACS）（FACSan；Beckton狄金森），以进行采集和分析。FLIH和F12A分别是代表绿色和红色荧光的激光通道。

细胞周期分析。

根据制造商提供的说明，使用CycleTEST Plus DNA试剂盒（Beckton Dickinson）用碘化丙啶（PI）对细胞进行染色。然后进行FACS分析。

膜联蛋白和PI荧光染色。

如前所述，细胞用PBS洗涤、胰蛋白酶化，然后用annexin和PI与annexin-V-Fluos染色试剂盒（Boehringer-Manheim）孵育(2,三)然后进行FACS分析。膜联蛋白阳性而非PI阳性的细胞被视为凋亡细胞，两种染色阴性的细胞被认为是活细胞。

细胞内氧化的测量。

在37°C下，用每毫升5μg二醋酸二氯荧光素（DCF；分子探针）培养细胞30分钟，然后用PBS洗涤，胰蛋白酶化，并收集在1毫升PBS中，然后进行FACS分析。使用平均荧光强度值绘制图形。或者，根据制造商的指示进行比色分析，以确定细胞内GSH（GT10；牛津生物医学研究）的浓度。简言之，收集细胞，洗涤，并用提供的试剂孵育，然后用设置在400nm的分光光度计测量样品的光密度。为了专门测量ROS的线粒体水平，将细胞与每毫升10μg二氢罗丹明123（DHR123；分子探针）在37°C下孵育30分钟，然后用PBS洗涤、胰蛋白酶化并收集在1毫升PBS中，然后进行FACS分析。使用平均红色荧光强度值绘制图形。

p53的测序。

大约10⁷用Adp53病毒感染EJ细胞24小时。用酚氯仿提取DNA，沉淀，用70%冰镇乙醇洗涤两次，然后再悬浮在100μl Tris-EDTA缓冲液中。PCR检测在50μl反应体积中进行，50 ng DNA，1×PCR缓冲液，2 mM MgCl₂，0.11 mM脱氧核苷三磷酸，0.30μM每个引物（正向引物，5′-GCAGTCATCTAGCTGTAGAG-3′；反向引物，5'-GCACCACTATGTAAAA-3′），1 U铂塔克DNA聚合酶（Invitrogen）。PCR进行了35个周期，其中5个周期在60℃下进行，30个周期在59℃下进行。根据制造商的说明，使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR后产物。TET系统中使用的两微升纯化PCR产物（Adp53）和p53质粒(54)用2μM正向引物、Big Dye 1.0测序试剂盒（Applied Biosystems）和ABI 3700 DNA分析仪进行测序。

免疫印迹分析。

用冰镇PBS清洗细胞两次，并在EBC缓冲液中溶解（50 mM Tris[pH8]、120 mM NaCl、0.5%NP-40、100 mM氟化钠、2 mM钒酸钠、2 m M苯甲基磺酰氟和10μg/ml抑肽酶）。在20000×克在4°C下保持20分钟。然后用双钦酸蛋白质测定法（Pierce）测定蛋白质浓度。对每个样品40微克的总细胞蛋白进行十二烷基硫酸钠-12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移至Immobilon（Milipore）聚偏二氟乙烯过滤器。p21的存在是用Ab-1单克隆抗体（癌基因科学）检测的，p53是用1801单克隆抗体检测的。使用ECL检测系统（Amersham）。

衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色。

细胞在PBS中清洗，并在室温下用2%甲醛-0.2%戊二醛在PBS内固定5分钟。如前所述，钢板被染色(14).

活性氧在p53诱导的衰老和凋亡细胞中增加。

先前的研究表明，活性氧水平的增加与Adp53诱导DLD-1结肠癌细胞凋亡有关(45). 我们还表明，p21导致p53依赖性ROS积累，这是p21诱导的永久性生长停滞表型的原因(36). 为了研究活性氧在EJ和PC3细胞中不同p53水平触发的衰老或凋亡细胞命运中的作用，我们用绿色荧光探针DCF测量了活性氧水平，DCF是细胞氧化剂总蓄积变化的标志(50). 如图所示。​图2A，2安培对DCF染色的EJp53细胞的FACS分析显示，TET去除后ROS水平逐渐增加。诱导3天后，当首次观察到衰老形态学变化时，细胞中的ROS水平增加了约两倍，到第5天进一步增加，此时生长停滞变得不可逆转。相比之下，Adp53感染的细胞在3天内ROS水平增加了8倍（图。​（图2B2B型).

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图2。

p53诱导后EJp53和PC3p53细胞的ROS水平。（A） 用荧光探针DCF染色后，通过FACS分析测定EJp53中的ROS水平。这些曲线对应于在TET（I）存在下培养5天或去除TET后培养2（II）或5天（III）的对照细胞。（B） 通过TET去除诱导p53 3天后或感染Adp53后3天（1:10稀释或未稀释）EJp53和PC3p53细胞中的ROS水平。结果代表三个不同实验的平均值，误差条显示标准偏差。（C） 在TET去除或Adp53感染2天后，与感染AdLacZ 2天后的对照细胞相比，按照材料和方法中的描述测量细胞内GSH水平。结果表示两个实验的平均值，误差条显示标准偏差。（D） 与感染AdLacZ 2天的对照细胞相比，用TET去除p53诱导48小时后或感染Adp53 2天后用DHR123测定EJp53细胞线粒体ROS水平。结果表示两个实验的平均值，误差条显示标准偏差。

接下来，我们研究了活性氧水平是否与PCp53细胞衰老和凋亡之间的决定相关。图​图2B2B型显示去除TET后，Adp53感染的PC3p53细胞表现出比PC3p5细胞更高的ROS水平。正如EJp53细胞所观察到的，较高的ROS水平与诱导凋亡反应相关。我们还测试了Adp53在p53阴性肿瘤细胞系DLD-1中的作用。在这种情况下，感染4天后，60%以上的细胞凋亡，ROS至少增加6倍（数据未显示）。

为了扩展这些结果，我们测量了细胞内GSH的水平，GSH是主要的ROS缓冲液之一，也是氧化应激的标志物(15). 与ROS的增加一致，在没有TET的情况下培养的EJp53细胞中GSH水平降低，在Adp53感染的细胞中更显著地降低（图。​（图2C）。2摄氏度). 此外，我们用DHR123对这些细胞进行染色，这是一种用于测量线粒体H水平的红色荧光染料₂O（运行）₂(8). 如图所示。​图2D，二维与TET去除诱导的p53细胞相比，感染Adp53的EJp53细胞的荧光增强更大。尽管DHR123也可以反映线粒体在细胞其他部位产生的过氧化物的积累，因此，它不是线粒体ROS生成的明确标记(42)这一结果证实了Adp53产生更高的细胞内氧化增加，并提示线粒体可能在p53诱导后ROS生成中发挥作用。

为了进一步确定不同的细胞命运结果是由于p53蛋白水平而不是TET和腺病毒模型之间的其他可能变量造成的，我们滴定了用于感染EJp53细胞的Adp53的量。如图所示。​图3A，3A级感染EJp53的病毒量比诱导这些细胞凋亡的病毒量低100倍，导致蛋白水平与TET去除后观察到的蛋白水平相似。这种浓度足以导致大多数细胞中的p53表达（图。​（图3B）3B公司)但没有引起细胞凋亡的显著增加。相反，这些细胞表现出细胞周期阻滞（图。​（图3C）3C公司)与TET拆除时的情况类似（见图。​图1A）。1安培). 值得注意的是，诱导的活性氧水平增加了约两倍（图。​（图3D），三维)与感染高浓度Adp53的细胞所观察到的更高ROS水平相比，这与TET去除后观察到的增加相似（见图。​图2B2B型).

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图3。

Adp53低倍感染诱导EJp53细胞生长停滞。（A） 对在TET存在下培养2天的EJp53细胞裂解液中的p53和p21表达水平进行免疫印迹分析（对照），在2天或5天通过TET去除诱导p53后，或在感染后3天用1:1000稀释的Adp53病毒库存进行诱导。（B） 用感染AdLacZ（对照）或Adp53的EJp53的p53抗体进行免疫染色。细胞用尼康Microphot-FXA显微镜拍摄（放大倍数，×200）。（C） 低浓度病毒感染Adp53 3天后EJp53细胞的PI染色。百分比表示凋亡细胞（亚G₁分数）和S期细胞。（D） 用DCF染色法测定感染AdLacZ（对照组）或低浓度Adp53后3天EJp53中的ROS水平。灰色线表示对照细胞中的平均荧光值。

p53水平和相关ROS的增加与正常人成纤维细胞衰老或凋亡的诱导相关。

为了研究正常人成纤维细胞对不同p53水平的反应是否与癌细胞中的反应相似，我们使用了含有p53（Retrop53）或Adp53的逆转录病毒。如图所示。4A和B，Retrop53感染后选择的成纤维细胞表现出生长停滞、细胞增大和细胞核完整，这是衰老的特征，但没有可检测到的凋亡。相反，Adp53在3天后导致这些成纤维细胞凋亡。Retrop53诱导的ROS水平比载体对照组增加了约1.5倍，而Adp53导致ROS水平增加了三倍以上（图。​（图4C）。4厘米). 这些不同的细胞反应再次与观察到的p53蛋白增加相关（图。​（图4D）。4D（四维）). 因此，p53表达水平的定量差异与ROS诱导以及同一正常细胞的衰老或凋亡相关。

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图4。

比较不同p53蛋白水平对501T正常人成纤维细胞阻滞和凋亡的影响。（A） 与感染未稀释Adp53后48 h相比，选择嘌呤霉素后1周感染含有载体（对照）或p53（逆转录p53）的逆转录病毒的501T细胞的形态学变化。用尼康Eclipse TE200显微镜拍摄细胞照片（放大倍数，×100）。（B） 感染Retrop53（选择后1周）或Adp53（3天）（灰色条）后501T细胞中凋亡细胞的百分比，通过膜联蛋白-PI染色测定。控制细胞（黑条）分别对应于含有载体或AdLacZ的逆转录病毒感染。结果反映了至少两个不同实验的平均值，误差条显示了标准偏差。（C） 感染Retrop53或Adp53后501T细胞内ROS水平升高。对照细胞分别用含有载体或AdLacZ的逆转录病毒感染。结果反映了至少两个不同实验的平均值，误差条显示了标准偏差。（D） 免疫印迹分析感染AdLacZ、Adp53（选择后2天）、Retrop53或含有逆转录病毒的载体（选择后1周）后501T细胞裂解液中p53表达水平。

Bax和PUMA对p53诱导的ROS和凋亡的影响。

促凋亡Bax基因是一个Bcl-2家族成员，据报道可增加线粒体膜通透性(26,37). 它被DNA损伤和p53上调(39)p53诱导的细胞凋亡中Bax的需求被认为与细胞环境有关(4,7,40). 此外，感染Adp53的EJp53细胞的Bax蛋白水平高于去除TET后观察到的EJp5细胞（图。​（图5A）。5A级). PUMA是一种仅与Bcl-2和Bcl-X结合的BH3蛋白_我由p53直接调节(41,57). 当PUMA过度表达时，会导致细胞色素c（c）从线粒体释放并诱导凋亡。测试两者的作用Bax公司和彪马在Adp53诱导的ROS和凋亡中，我们使用了HCT116细胞，其中任何一个基因被体细胞基因靶向灭活(59). 如图所示。​图5B，5亿免疫染色显示，每个细胞系中表达p53的细胞比例（>50%）与Adp53相似。两个Bax^−/−和PUMA^−/−与野生型亲代细胞相比，感染Adp53后的细胞对凋亡的抵抗力显著增强，这一结果与之前的报告一致（图。​（图5C）5摄氏度) (59). 值得注意的是，在没有Bax或PUMA的情况下，响应p53的ROS积累也显著减少（图。​（图5D）。第五天). 这些发现进一步与在确定凋亡时对p53作出反应的活性氧累积量相关，并暗示Bax和PUMA是p53诱导的活性氧的重要效应器，表明线粒体在p53上调后生成活性氧中起作用。

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图5：。

Adp53感染Bax和PUMA-null细胞中ROS水平和凋亡的比较。（A） 用1:10稀释的Adp53（2天）或TET去除2天后感染EJp53细胞裂解物中p53和Bax表达水平的免疫印迹分析。（B） HCT116细胞p53抗体免疫染色（野生型，Bax^−/−，或PUMA^−/−)感染AdLacZ（对照）或未稀释Adp53。细胞用尼康Microphot-FXA显微镜拍摄（放大倍数，×200）。（C） 野生型Bax细胞的凋亡水平^−/−和PUMA^−/−通过Annexin-PI染色检测，HCT116细胞感染AdLacZ或Adp53 3天。（D） 野生型Bax的相对活性氧水平^−/−和PUMA^−/−与感染AdLacZ的相同细胞中ROS水平相比，感染Adp53的HCT116细胞。结果表示三个不同实验的平均值，误差条显示标准偏差。wt，野生型。

ROS抑制部分阻断EJp53细胞的衰老和凋亡。

为了研究活性氧在p53诱导的衰老和凋亡中的作用，我们测试了抗氧化剂N个-乙酰半胱氨酸（NAC），一种减少的谷胱甘肽提供者和活性氧的直接清除剂(10,47)能够保护细胞免受永久性生长停滞表型的影响。大约100个EJp53细胞被电镀，通过去除TET诱导p53细胞长达4天。然后将TET添加回培养基中，再培养细胞2周以分析菌落形成。研究表明，这种细胞接触p53的时间越长，p53下调后能够恢复的菌落就越少(54). 图​图6A6A级结果表明，向培养基中添加10 mM NAC可增加能够逃避p53诱导的衰老的细胞数量，表明ROS的抑制可保护细胞免受这种结果的影响。在存在NAC的情况下培养的EJp53诱导的细胞中，衰老标记SA-β-gal阳性的细胞比例也降低（图。​（图6B）。6亿). 这些细胞的DCF染色证实NAC处理显著减少了ROS积累（图。​（图6C）。6摄氏度). NAC在所用浓度下没有诱导细胞死亡（见图。​图6F）。第6页). 作为进一步的对照，10 mM NAA是NAC的一种结构类似物，没有抗氧化活性，对菌落恢复没有影响（数据未显示）。所有这些结果都表明，活性氧的积累是p53诱导衰老的重要介质。

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图6。

抗氧化剂对p53诱导的衰老和凋亡的影响。（A） 集落形成试验的代表平板，其中约100个EJp53细胞被平板。细胞在没有TET的情况下维持0（对照组）、2、3或4天，然后再次将TET添加到培养基中。细胞再培养14天，然后进行10%福尔马林固定和Giemsa染色。如有指示（加号），在实验开始时和每次随后的培养基改变时加入10mM NAC，直到TET被添加回培养基。（B） 在存在TET的情况下培养的EJp53对照细胞中，以及在存在或不存在10 mM NAC的情况下诱导p53诱导5天后，SA-β-gal阳性细胞的百分比。（C） 用DCF染色法测定同一细胞内ROS水平。结果表示至少两个不同实验的平均值，误差条显示标准偏差。（D） 在存在或不存在10 mM NAC的情况下，对感染Adp53的EJp53细胞裂解液中p53和p21表达水平的免疫印迹分析。（E） 在存在TET（对照）的情况下培养的EJp53细胞中的ROS水平，以及在存在或不存在10mM NAC、1mM GSH或10mM NAA的情况下感染Adp53的细胞。（F） Anenxin-PI染色显示对照EJp53在TET存在下培养2天，同时向培养基中添加10 mM NAC或1 M GSH，以及在Adp53感染后3天，在相同浓度NAC或GSH存在或不存在的情况下，活细胞百分比。结果表示三个不同实验的平均值，误差条显示标准偏差。*，Adp53与Adp53+NAC的统计分析(P（P）< 0.00001); **, Adp53与Adp53+GSH的统计分析(P（P）< 0.000001).

接下来我们测试了抗氧化剂对p53诱导的细胞凋亡的影响。如图所示。​图6D，6D、 NAC治疗对Adp53感染诱导的p53或Bax蛋白水平没有影响。在Adp53感染之前，用10 mM NAC或1 mM的EJp53治疗可显著抑制ROS水平增加的幅度（与在缺乏抗氧化剂的情况下观察到的增加相比），而非活性NAC类似物NAA对ROS积累没有影响（图。​（图6E）。第六版). NAC和GSH处理也导致24小时后存活细胞的统计显著增加（图。​（图6F）。第6页). 由于在较高浓度下抗氧化剂对细胞存活有不利影响，因此无法确定是否可以实现ROS的进一步中和，如果可以，p53凋亡反应的幅度是否会进一步降低。

我们感谢B.Vogelstein（马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学）慷慨提供HCT116 Bax^−/−cells和Adp53，I.George来自Mount Sinai流式细胞术核心设施，L.Goldin和J.Leung寻求技术援助。

S.Macip获得了西班牙教育与文化部的支持，并获得了Forchheimer基金会的博士后奖学金。P.Berggren获得了瑞典癌症协会（Cancerfonden 477-BO2-01SAA）的支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款CA80058和CA85214（给S.A.A.）以及CA78356和CA82211（给S.W.L.）的部分支持。