《维罗尔杂志》。2009年1月；83(1): 440–453.
水泡性口炎病毒进入的宿主细胞因子和功能▿
,1 ,1 ,2 ,1和1,*
赫夫娜·克里斯汀·约翰斯多蒂尔
苏黎世ETH生物化学研究所，瑞士苏黎世CH-8093 Schafmattstrasse 18，1德国海德堡D-69120德国癌症研究中心（DKFZ）细胞生物学部2
罗伯塔·曼奇尼
瑞士苏黎世联邦理工学院生物化学研究所，Schafmattstrasse 18，CH-8093，1德国海德堡D-69120德国癌症研究中心（DKFZ）细胞生物学部2
尤尔根·卡尔滕贝克
苏黎世ETH生物化学研究所，瑞士苏黎世CH-8093 Schafmattstrasse 18，1德国海德堡D-69120德国癌症研究中心（DKFZ）细胞生物学部2
利亚·阿马托
苏黎世ETH生物化学研究所，瑞士苏黎世CH-8093 Schafmattstrasse 18，1德国海德堡D-69120德国癌症研究中心（DKFZ）细胞生物学部2
阿里·海伦纽斯
苏黎世ETH生物化学研究所，瑞士苏黎世CH-8093 Schafmattstrasse 18，1德国海德堡D-69120德国癌症研究中心（DKFZ）细胞生物学部2
苏黎世ETH生物化学研究所，瑞士苏黎世CH-8093 Schafmattstrasse 18，1德国海德堡D-69120德国癌症研究中心（DKFZ）细胞生物学部2
2008年9月4日收到；2008年10月19日接受。
摘要
水泡性口炎病毒（VSV）是一种基于电子显微镜的动物病毒，其对酸性细胞隔室的感染依赖性被认为以依赖于网格蛋白的方式进入宿主细胞。然而，确切的细胞机制在很大程度上是未知的。在这项研究中，我们描述了VSV的进入动力学，并阐明了病毒在HeLa细胞感染期间对宿主细胞因子的需求。我们发现，VSV的内吞是一个快速的过程，半衰期为2.5至3分钟，早期内吞体内吞后1至2分钟内发生酸活化。大多数病毒颗粒以基于网格蛋白的、依赖于动力学蛋白2的方式被内吞。虽然与一些表面结合病毒相关，但感染并不需要经典的衔接蛋白复合物AP-2。时间推移显微镜显示，病毒要么进入预先形成的氯氰菊酯涂层凹坑，要么诱导凹坑从头形成。Dynamin-2被募集到质膜限制的病毒颗粒中。因此，VSV可以通过利用与网格蛋白相关的蛋白质和细胞功能的特定组合来诱导生产性内化。
大多数动物病毒依靠受体介导的内吞作用生产性进入宿主细胞。主要基于电子显微镜（EM）的研究表明，这些病毒中的许多病毒利用网格蛋白介导的内吞作用（CME），然后从内吞液泡渗透到胞液中。然而，越来越清楚的是，病毒可以使用多种与氯氰菊酯无关的内吞途径，有时与CME并行(13,71,82). 其中一些途径导致向酸性内吞液泡输送（参考文献综述45)而其他人将病毒运输到内质网(30,43). 一些病毒能够激活细胞信号通路，从而触发自身内化，而不是使用组成性内吞机制(13,20,63,71).
在本研究中，我们重点关注了水泡性口炎病毒（VSV）是一种特性良好的酸活化包膜RNA病毒，属于鼠疫病毒科它感染昆虫和哺乳动物，但最为人所知的是它在牲畜中引起流行病(70). 由于其易于处理、高滴度和广泛的细胞嗜性，病毒及其膜糖蛋白G（VSVG）常被用作研究内吞作用的模型(14,35,36,82)和秘密交通(18,27,49). 出于同样的原因，VSVG经常被用于逆转录病毒载体的假分型以进行基因传递(三,28,96). 此外，重组形式的病毒已被证明在动物模型中对靶向癌细胞和作为疫苗载体刺激对艾滋病和流感等疾病的免疫力是有效的（参考文献综述37).
有证据表明，VSV被氯氰菊酯包被凹坑（CCPs）和氯氰菊酯包被囊泡（CCVs）内化，这是基于薄片EM、Eps15感染依赖性以及小干扰RNA（siRNA）沉默氯氰胆碱重链后对感染的部分抑制(40,41,62,88). 病毒以Rab5依赖的方式传递到内体(80). 触发病毒包膜与内膜融合的G蛋白构象变化的pH阈值为pH 6.2(5,94). 虽然长期以来一直假设病毒包膜与内体的限制膜融合，但Le Blanc等人最近提出，病毒包膜和多泡体和晚期内体中的内囊泡之间发生融合(35). 在这种情况下，核衣壳释放到胞浆中的过程稍后会通过内囊泡与多囊泡体的限制膜的回流发生，这是一种涉及细胞融合蛋白的反应。最近对HeLa细胞中的人类激酶组（人类蛋白激酶的全补体）进行的siRNA筛选表明，生产进入过程涉及来自不同家族的大量激酶(62). 许多抑制VSV感染的激酶也抑制转铁蛋白（Tfn）的内化，这是一种内源性CME底物。VSV的细胞表面受体尚未确定，但普遍认为通过G蛋白结合是非特异性的，涉及到质膜上的负电荷(4,6-8).
在当前的研究中，我们使用多种微扰技术、单颗粒活细胞显微镜和EM检查了VSV进入组织培养细胞。我们的结果证实了CME的中心作用，并表明病毒可以进入预制CCP，尽管大多数颗粒诱导了新的网格蛋白涂层的形成。在动力依赖性内吞作用后，内化和渗透在几分钟内发生。
材料和方法
细胞和病毒。
人宫颈癌HeLa ATCC细胞保存在补充有10%胎牛血清（FCS）和1%谷氨酰胺（Gibco Life Technologies）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中。幼仓鼠肾脏（BHK-21）细胞保存在格拉斯哥培养基中，该培养基中添加了10%FCS、10%胰蛋白酶磷酸盐肉汤和1%谷氨酰胺（Gibco Life Technologies）。在添加10%FCS、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、，和1 mg/ml G418（Gibco Life Technologies），37°C和5%CO2.
野生型VSV（wtVSV）（印第安纳血清型）由H.Hengartner（苏黎世大学实验免疫学研究所）提供。库存的准备如前所述(62,94). 重组VSV（rVSV）由L.Pelkmans（苏黎世联邦理工大学分子系统生物学研究所）提供，并按前述方法制备(62,77). 简单地说，通过在添加有10 mM HEPES（pH 6.5）的10 ml无血清MEM中以0.1的感染倍数（MOI）感染轻微亚流入的BHK-21细胞24小时来制备储备。细胞在37°C和5%CO下培养2在摇杆上放置1小时，然后在剩余的培养时间内加入20毫升含有30 mM HEPES（pH 7.3）、10%胰蛋白酶磷酸盐肉汤和1%FCS的MEM。当90%的细胞被取整后，采集上清液。通过在4°C下以4500rpm离心15分钟来去除细胞碎片。在pH 7.4下用10 mM HEPES缓冲原料，并在−80°C下储存。
wtVSV的纯化和荧光标记。
对印第安纳州wtVSV进行纯化，以便用荧光团共价标记。这是通过使用SW41转子在贝克曼超离心机中以25000 rpm在4°C下造粒病毒2.5小时来完成的。在4°C的TN缓冲液（50 mM Tris[PH7.4]，100 mM NaCl）中，在冰上洗脱颗粒过夜。随后，在4℃下以30000 rpm在蔗糖梯度（10至20%和25至50%[wt/vol]蔗糖梯度和0.5 ml 50%[wt%vol]蔗糖缓冲液）上纯化洗脱的颗粒1 h。将带状病毒在25000 rpm下排斥1 h，并在TN缓冲液中洗脱，如上所述。在0.1 M NaHCO中透析纯化的病毒三（pH 8.3）在4°C下过夜。测量蛋白质浓度，并且N个-旋转时以1:4摩尔比添加羟基琥珀酰亚胺活化荧光染料（Alexa Fluor 488[AF488]、Alexa Fuor 594[AF594]或Alexa Fluor 647[AF647]）。然后将标记的病毒在室温下头尾旋转2小时，然后如上文所述在蔗糖梯度上带状。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证标记正确，并通过斑块分析监测感染性。该标记仅与VSVG相关，标记的病毒保持单分散性，感染性从1×10降低约一半7PFU/mg病毒蛋白至5×104将PFU/mg标记的病毒进行校准并储存在−80°C下。
wtVSV的放射性标记。
[35S] 如前所述，制备了蛋氨酸标记的VSV(41). 简单地说，BHK-21细胞在不含碳酸氢盐的10 ml Earle’s MEM（pH 6.3）中以20的MOI感染wtVSV[补充10 mM Tris，10 mM哌嗪-N个,N个′-双（2-乙磺酸）（PIPES），10 mM吗啉丙基磺酸（MOPS），10 m M NaH2人事军官4，0.2%牛血清白蛋白（BSA）]在37°C摇杆上放置1 h。接种物替换为5 ml DMEM（不含蛋氨酸、胱氨酸和我-谷氨酰胺），含有20 mM HEPES（pH 7.3），并在37°C下培养1.5小时，然后添加[35S] 每175-cm蛋氨酸（1 mCi）2然后，按照上述wtVSV的描述纯化放射性标记的病毒。正确标记[35S] 蛋氨酸通过SDS-PAGE进行验证，通过菌斑试验监测感染性，并使用多功能闪烁计数器（LS 650；Beckman Coulter）进行放射性标记病毒的活性计数。
siRNA介导的击倒。
为了耗尽衔接蛋白2（AP-2）的α亚单位，使用了两个先前发表的siRNA，AP2-1（GAGCAUGUGCACUGCCAGCU）(26)和AP2-2（AAGAGCAUGUGCACGCUGGCCA）(53). 此外，还使用了一种针对AP-2μ亚单位的所谓已证明性能的siRNA（Qiagen），即AP2-3（ACGTGTGACTTCGTCCAGTTA）。之前发表的寡核苷酸是由Dharmacon合成的。使用AllStars阴性对照siRNA（Qiagen）作为对照siRNA。根据制造商的快进协议，使用HiPerFect转染试剂（Qiangen）进行siRNA沉默的转染。简单地说，HeLa细胞在转染前1小时接种。AllStars阴性对照siRNA（5 nM/100 nM）、AP2-1（5 nM），AP2-2（100 nM。转染后约48小时，细胞再次感染并再培养40小时，然后计数并播种进行实验，实验在电镀后8至10小时开始。通过Western blotting验证敲除作用，使用小鼠抗适应性蛋白-α（1:100）、小鼠抗适应性基因-μ（1:100/μ）和α-肌动蛋白（1:1000）进行归一化。所有抗体均购自BD Biosciences。
感染和内化分析。
在感染检测中，将MOI为1的rVSV添加到HeLa细胞中。病毒储备在RPMI培养基中稀释（补充30 mM HEPES[pH 6.8]和1%BSA）（Gibco Life Technologies）。在加入病毒之前，用RPMI培养基清洗细胞一次。在37°C的摇杆上进行感染1 h，然后用补充10%FCS和1%谷氨酰胺的MEM替换接种物，再进行3 h。为了分析Tfn摄取，用20μg/ml标记的（AF594或AF647）Tfn（Invitrogen）对样品进行脉冲处理15 min，并追踪10 min。随后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗样品，并用酸洗（0.1 M甘氨酸，0.1 M氯化钠[pH3.0]）去除任何结合的、未经修饰的Tfn。样品在室温下用4%甲醛在PBS中固定20分钟。感染可以通过FACSCalibur流式细胞仪使用CellQuest 3.1软件（Becton Dickinson Immunocytometry Systems）进行量化，也可以通过共焦显微镜进行肉眼评分。rVSV感染的检测基于GFP的表达。对于荧光激活细胞分选（FACS）分析，每个样品至少分析10000个细胞。对每个样品进行至少两个独立实验，重复三次。显微镜下分析的样品被渗透（1%[wt/vol]BSA，0.05%[wt/vol]皂苷在PBS中），并用初级抗体-小鼠抗适应性α（AP-2-α）抗体（1:100）（BD Biosciences）或小鼠抗适应性μ（AP-2-μ）抗体（1:100）（BD-Biosciencies）染色其次是二级抗体（AF488-、AF647-或AF594-标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G（Invitrogen），在室温或4°C下过夜45分钟。使用ImmuMount（Thermo Shandon）安装样品。显微镜使用蔡司510Meta激光扫描显微镜（Carl Zeiss AG）进行观察，该显微镜具有63×浸油物镜，数值孔径为1.4。使用LSM 510软件包（Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）获取图像，并使用Image J（美国国立卫生研究院）和Adobe Illustrator（Adobe Systems）进行处理。
内吞作用。
如前所述，对细胞内吞进行分析(41). 简单来说，约50000 cpm[35S] 在RPMI培养基中稀释蛋氨酸标记病毒，并将其添加到35 mm培养皿上的HeLa细胞中，MOI小于1 PFU/细胞。病毒结合在4°C下进行1小时，然后迅速将温度转移到37°C进行内化。在不同的孵育时间后，将细胞再次置于冰上，并在4°C下用1 mg/ml蛋白酶K（Roche）处理，该蛋白酶可裂解VSVG并有效去除表面结合的未融合病毒(41). 作为背景对照，在不将细胞移动到37°C的情况下进行蛋白酶K处理。将蛋白酶处理过的细胞制成颗粒，在含有0.2%BSA、1 mM苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）的PBS中洗涤，并在0.3 ml培养基和2 ml Ready-Safe闪烁混合物（Beckman Coulter）中重新悬浮。使用多用途闪烁计数器（LS 650；Beckman Coulter）测量放射性，计算每个样品5分钟内的放射性。
VSVG退化。
免疫印迹法检测VSVG降解。将VSV在添加有1%BSA和1 mM环己酰亚胺的RPMI培养基中稀释，并使用HEPES缓冲至pH 6.6，并允许VSV在4°C下与汇合的HeLa细胞结合1 h。通过交换培养基去除未结合的病毒，并将温度移到37°C进行内化。在分析时，再次将样品移到4°C，并如上所述用1 mg/ml蛋白酶K（罗氏）处理。清洗细胞后，在SDS-PAGE和Western blotting之前，将y颗粒化并重新悬浮在SDS-Laemmli样品缓冲液中。在我们实验室中，用纯化的G蛋白制备的兔多克隆抗体8685检测VSVG。
相对长度单位。
对于薄片电子显微镜，将在RPMI培养基中稀释的VSV（补充30 mM HEPES[pH6.6]和1%BSA）结合在12 mM冰盖玻片上的BHK-21细胞上1小时，然后固定，或者在固定前将其转移到37°C下10分钟。存在20 mM NH时4Cl，细胞在37°C下感染1 h。细胞用2.5%戊二醛固定（补充0.05 M二甲氨基甲酸钠[pH7.2]、50 mM KCl、1.25 mM MgCl2和1.25 mM CaCl2)在室温下保持30分钟，然后在2%OsO中保持1.5小时4如前所述进行脱水、包埋和薄片切片(30).
活细胞显微镜分析。
在实验开始前12小时，根据制造商的方案，使用AMAXA用CLC-mRFP或CLC-EGFP或dynamicn-2-t-EGFP转染用于活细胞显微镜的HeLa细胞。实验开始前，允许转染AP-2α-wt-EGFP的细胞表达构建物24至48小时。GFP标记的α亚基有效地并入内源性衔接蛋白复合体需要较长的表达时间(16). 所使用的结构为CLC-EGFP（pEGFP-C1）（由宾夕法尼亚州Kimmel癌症中心J.H.Keen提供）或单体红色荧光蛋白（mRFP）（pmRFP-C3）（由苏黎世联邦理工学院生物化学研究所A.Vonderheit提供）、dynamin-2-wt-EGFP。Greene，NIH，Bethesda，MD）。为了用细胞外基质（ECM）覆盖盖玻片，在成像前2天将与后续实验中使用的相同类型的细胞接种在18-mm盖玻片（Greiner）上，并生长到汇合处。在成像当天，使用20 mM EDTA从盖玻片中取出细胞，以保存细胞产生的ECM。盖玻片在冷PBS中清洗，并安装在定制的不锈钢室中（车间生物化学）。将在冷RPMI培养基中稀释的标记病毒（补充有30 mM HEPES[pH6.6]和1%BSA）添加到涂布盖玻片中，并在冰上培养30分钟，以便与ECM结合。然后使用20 mM EDTA分离用于成像的转染细胞，用PBS清洗细胞三次后，将其悬浮在300μl RPMI培养基（补充30 mM HEPES[pH6.6]和1%BSA）中，添加到盖玻片中，并在冰上附着30分钟。随后，使用定制改进的Olympus IX71倒置显微镜（带有加热室（37°C）和客观型全内反射荧光显微镜（TIRFM）装置（TILL Photonics）对样品进行活细胞成像。图像采集是使用TILL Image QE电荷耦合器件相机和TILLVISION软件（TILL Photonics）完成的。每次实验都手动调整总内反射角。使用Image J（美国国立卫生研究院）和Adobe Illustrator（Adobe Systems）处理图像。
药物抑制剂。
将细胞与药物在37°C下在补充有10%FCS和含有NH的DMEM中预孵育15-30分钟4Cl（20 mM）（Baker）、dynasore（20、80或120μM）（ASINEX）、brefeldin A（1μM）、nocodazole（1μM）（Sigma-Aldrich）或wortmannin（0.1、1或10μM）。由于氯丙嗪（Sigma-Aldrich）的高细胞毒性，在添加病毒之前，将细胞与17、70、140或280μM的药物预孵育10分钟，并将含药物接种物留在细胞上30分钟，然后用完全培养基替换。在没有血清的情况下，用孕酮（80μM）（Sigma-Aldrich）和制霉菌素（11μM）预孵育过夜，病毒没有与药物孵育。否则，在整个实验过程中都会出现药物，并且治疗不会导致细胞活性的丧失。
结果
内化和酸活化动力学。
为了分析HeLa细胞中VSV摄取的动力学，我们监测了[35S] 蛋氨酸标记病毒。为了同步进入，首先让标记的病毒在4°C下以小于1的MOI与融合细胞单层结合1小时。清洗细胞以去除未结合病毒后，添加的病毒中有2-10%仍与细胞相关。温度迅速升高至37°C，不同时间后将培养皿置于冰上长达45分钟。在4°C下用蛋白酶K处理以去除剩余的表面结合的VSV后，测量细胞相关放射性(41). 在不将细胞移动到37°C的情况下，病毒与表面结合的对照样品显示，蛋白酶K处理去除了92%±7%的表面结合病毒。
在37°C培养的样品中，高达30%的细胞相关放射性对蛋白酶K处理产生耐药性。如图所示。VSV的内化速度惊人；在升温后5分钟内，所有被内化的病毒都已经对蛋白酶K产生了抗性，其中一半在2.5到3分钟内产生了抗性。因此，VSV的内化迅速同步发生。为什么只有三分之一的病毒被内化尚不清楚，但低效内化与之前在MDCK和BHK-21细胞中的观察结果一致(41,50).
HeLa细胞中VSV的进入动力学。（A） 预绑定VSV的内部化。[35S] 蛋氨酸标记的VSV在4°C时与细胞结合。去除未结合病毒，并将细胞移至37°C水浴中指定的时间。在这些实验中，发现约3500 cpm与细胞相关，超过20%的细胞相关病毒在变暖时对蛋白酶K产生抗性。通过蛋白酶K处理去除剩余的表面相关病毒后，使用闪烁计数器对内化病毒进行定量。误差条表示三个实验的平均值的标准偏差。（B） VSV酸活化和VSVG降解动力学。VSV在4°C时与细胞结合。去除未结合病毒，并将样品转移到37°C水浴中（NH4Cl添加[钻石]）或存在（NH4NH的Cl冲刷（圆圈）4Cl表示指定的时间。随后，NH4向样品中添加Cl（NH4Cl添加[钻石]）或移除2分钟，然后读取（NH4Cl冲刷[圆圈]）。加热4小时后，通过FACS对感染进行评分，并以不存在NH时感染细胞的百分比表示4Cl.误差条表示三个实验的标准偏差。（C） VSVG退化。VSV在4°C时与细胞结合。去除未结合病毒，并将样品在1 mM环己酰亚胺存在下转移到37°C水浴中指定时间。随后，通过Western blot分析（B组中的三角形）量化内化未分级VSVG的数量。误差条表示三个实验平均值的标准误差。
为了确定内化后酸诱导膜融合激活的时间进程，我们使用重组病毒rVSV开发了基于FACS的感染检测。rVSV在感染方面与野生型病毒相同，但经过修饰后在感染细胞中表达GFP(29,32,62,77). 为了确定酸暴露的时间，我们利用了亲脂性弱碱的事实，例如氯化铵（NH4Cl），抑制内体酸化，从而阻止pH诱导的VSVG活化(41). 将碱添加到细胞外培养基后，内体pH值几乎是瞬间升高的(54). 病毒在20 mM NH存在下正常内化4Cl，但如果小心地将培养基pH缓冲至7.2或更高，则可有效阻断渗透和感染(31)（表). 如前所述，病毒在4°C下与细胞结合1小时。去除未结合的病毒，并将样品迅速转移到37°C。全日空航空公司4在不同时间加入Cl，固定后4h用FACS分析测定感染指数。根据实验结果，未受抑制的对照组中感染细胞的百分比在20到70之间。值得注意的是，通过使用小于1的MOI，我们可以计算酸转化的平均时间；如果添加了多个病毒，则对最快病毒的动力学进行评分。
表1。
| 抑制剂 | 浓度（μM） | 感染减少（%） |
|---|
| 氯化铵 | 20,000 | >95 |
| 氯丙嗪 | 17 | 20 |
| 70 | 45 |
| 140 | 60 |
| 280 | 95 |
| 戴纳索尔 | 20 | 30 |
| 80 | 70 |
| 120 | 90 |
| 孕酮/制霉菌素 | 80/11一 | 30 |
| 布雷费尔丁A | 1 | 40 |
| 诺卡唑 | 1 | 15 |
| 沃特曼宁 | 0.1 | 0 |
| 1 | 10 |
| 100 | 40 |
结果表明，所有病毒在升温后8至10分钟内都通过了释酸步骤，在随后的时间点几乎没有其他病毒被激活（图。，新罕布什尔州4Cl插件）。一半的病毒在升温后2至3分钟或内化后几乎立即通过了酸释放步骤。鉴于该过程的快速性，关键酸诱导事件最有可能发生在早期内体中(24,46,73,76).
为了确定内吞途径中的后期细胞器是否也支持生产性渗透，我们允许病毒在NH存在的不同时期进入4Cl.NH公司4然后将含氯培养基与无抑制剂培养基交换2分钟，然后重新加入NH4Cl.感染检测在加热后4小时进行。该方案利用了NH后内体pH值几乎瞬间下降的优势4Cl洗脱和重新处理后pH值快速增加(54).
结果证实，病毒在升温后最早2分钟到达能够支持生产进入的隔间（图。，新罕布什尔州4Cl冲洗）。在加温后6至10分钟观察到感染峰值，30分钟内感染性下降到一半。加温后90分钟，感染不再被检测到。这证实了VSV穿透中的酸激活步骤在早期内吞小室中以最高效率发生，并证明进入晚期内体或溶酶体的运动减少，最终阻止生产性穿透。
早期内体在VSV进入中的作用与感染对各种药物和扰动的敏感性一致。例如，诺卡唑，一种微管解聚药物，抑制从早期到晚期内体的贩运(1,42)只导致了VSV感染性的小幅度降低（15%）（表). 此外，早期内胚体小GTPase Rab5的显性阴性形式及其siRNA-介导的敲除抑制了VSV感染，而晚期内胚体Rab7功能的同等扰动没有类似的效果(80)（H.Johannsdottir、T.Heger和A.Helenius，未发表数据）。不可逆磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶抑制剂沃特曼引起了中度、剂量依赖性的感染减少（表). 这种激酶对于生成磷脂酰肌醇-3-磷酸（一种在早期内体中具有重要调节功能的磷脂）至关重要(68,84,86,87). 早期内体隔室对VSV感染的重要性也可以解释布雷费尔丁A的作用（表)导致病毒感染率下降40%。布雷费尔丁A是一种真菌代谢物，可抑制几种ADP-核糖基化因子的核苷酸交换，并阻断早期内体和分泌途径中的共变异构体（COPI）功能(55-58,64). COPI功能受损还导致Semliki Forest virus（SFV）感染受到抑制，表皮生长因子（EGF）受体的Tfn循环和溶酶体靶向受损(14,95).
接下来，我们通过测量G蛋白的降解来确定病毒到达降解室的时间进程。纯化的野生型VSV在4°C下与细胞结合1小时。在清洗细胞并将其移至37°C不同时间后，在低温下通过蛋白酶K处理去除未能进入细胞的病毒。细胞裂解物通过SDS-PAGE和免疫印迹法分析，使用G蛋白抗体。如图所示。（三角形）并在图中量化。约三分之一的细胞相关VSVG被内化，其降解开始于升温后30至60分钟，并在120分钟前完成。
综上所述，动力学数据和微扰分析结果与一个模型相一致，在该模型中，传入的VSV从细胞表面快速传递到早期内体，在早期内体中，低pH值会导致VSVG的构象变化和膜融合反应。病毒G蛋白继续进入晚期内体和溶酶体，在那里被降解。晚期内体和溶酶体不支持病毒的生产性渗透。只有三分之一的细胞相关病毒进入，但进入过程非常迅速。
CCP和内体中的VSV。
我们还使用EM分析了VSV进入HeLa和BHK-21细胞的情况。BHK-21是这些研究中首选的细胞，因为病毒与HeLa细胞的结合效率低；只观察到少量的细胞相关颗粒。BHK-21细胞不仅结合了更多的病毒，而且就所需的颗粒数量而言，对VSV感染的敏感性约为100倍。然而，VSV进入的动力学在两种细胞类型中是相似的。
病毒颗粒在4°C下与细胞结合1小时后，样品被固定并包埋，表面结合的VSV颗粒通常与微绒毛有关（图。)或位于微绒毛底部（图。). 许多局限于表面内陷。其中，约60%位于涂层坑中（图。)其余的凹痕大小和形状相似，但没有可见的电子致密涂层（图。). 病毒颗粒相对于质膜的取向不同；一些平行于膜，而另一些垂直于膜。根据凹坑内陷程度以及相关VSV颗粒的数量和方向，CCP的大小在200到500 nm之间。如果CCP被视为CCV，可以估计其直径将对应于100至250 nm。这超过了平均CCV的直径，约为100nm(15,25).
与BHK-21细胞质膜相关的VSV的电子显微镜。病毒在4°C下与细胞结合1h。细胞固定并薄片分析。一些膜结合病毒与电子致密的细胞质外壳（A、B、C、D和H）有关，其他病毒呈无涂层凹痕（E、F和G）。许多接近或与微绒毛相关（A、E、F和G）。变暖后，病毒开始内化（H）。在某些情况下，在单个包被的凹坑（图C和H中的开放箭头）或包被的囊泡（图H中的闭合箭头）内可以看到多个病毒颗粒。棒材，100 nm。
由于病毒的快速渗透使病毒在薄片中看不见，因此内化病毒颗粒的可视化问题更大。为了最大限度地增加未穿透的内化病毒数量，我们让MOI为5000的病毒在4°C下结合1小时。然后，将细胞放置在37°C的培养箱中10分钟，缓慢升高温度，而不去除未结合的病毒。当使用该方案时，包被囊泡中可见细胞内病毒（图。，开放箭头），在部分涂层囊泡中（图。)以及形状不规则的小膜结合结构，没有可见的外壳或内部小泡（图。，闭合箭头）。后者的直径为200至280纳米，这表明它们要么是新形成的内吞小泡，要么是早期的内吞体。我们没有看到病毒与内吞液泡的限制膜融合的过程。由于这些早期腔室中没有内部小泡，因此可以排除与它们的融合。仅当NH4添加Cl以防止酸化，我们可以观察到VSV在直径为450至600 nm的经典内体空泡中的积聚。这些通常含有几种病毒以及液泡内小泡（图。). 融合阻滞期间内体内多个病毒颗粒的积聚可能部分是由于这些实验使用的高MOI，而使用1或更低的MOI不会如此显著。
内吞囊泡中VSV的电子显微镜观察。病毒在4°C下与BHK-21细胞结合1小时，然后将细胞转移到37°C的培养箱中，以允许内部化。病毒出现在包膜或部分包膜的内吞囊泡（B[开放箭头]和C）或相对较小、紧密贴合的内吞小泡（A和B[闭合箭头]）中，表明它们存在于早期内吞小室中。（D和E）在20 mM NH存在的情况下进行加热4Cl允许内化，但不允许酸活化融合。病毒在较大的内体结构中积聚，一些内体结构含有内囊泡。棒材，100 nm。
EM结果与之前对MDCK、BHK-21和L细胞的研究一致(11,12,41). 它们也与小干扰RNA沉默氯氰菊酯重链的作用相一致(40,62,88)，这至少显示了氯菊酯介导的内吞作用在VSV进入中的部分作用。我们发现CME抑制剂氯丙嗪以剂量依赖的方式显著降低了VSVG的表达（表). 相比之下，用孕酮和制霉菌素治疗，它们可以抑制合成并从质膜上隔离胆固醇，但对CME的影响很小(2,78,81)，仅减少约30%的感染（表). 我们将这些结果解释为，VSV主要通过CME进入并感染HeLa细胞，尽管不能排除某些病毒通过平行的非网格蛋白介导途径进入的可能性。
Dynamin-2对VSV感染是必需的，而AP-2是可有可无的。
动力蛋白-2是几种内吞途径中的关键因子，包括CME和小泡/脂质筏介导的摄取途径(10,33,45,91). 相反，它对痘苗病毒（VV）的大量胞饮作用是不必要的(47)对于所谓的GPI-锚定蛋白富集的内体室（GEEC途径）(72)以及最近描述的淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）进入的非网格蛋白/非小窝途径(66). 因此，dynamin-2抑制作用是划分内吞途径的一个相当可靠的初始标准。
为了测试dynamin是否与VSV感染有关，我们应用dynasoir，一种阻止Tfn内吞的dynasoer的GTPase活性的特异性抑制剂(38). 作为阳性对照，我们使用VV，我们已经证明VV可以利用dynamin-2非依赖性大松果体细胞途径(47). 我们将HeLa细胞与dynasore预孵育15分钟，然后在细胞中添加rVSV或VV 4小时，然后通过FACS进行固定和感染评分。未观察到细胞毒性。该抑制剂导致VSV传染性下降了近10倍，呈剂量依赖性，表明大多数病毒颗粒依赖动力蛋白-2进入感染（图。和表). 正如预期的那样，VV感染没有受到影响（图。). 我们得出结论，HeLa细胞的VSV感染依赖于dynamin-2。
VSV感染依赖于dynamin-2。HeLa细胞在指定浓度的dynasoter存在下感染了VSV和痘苗病毒（VV）。通过FACS检测感染并将其归一化为未经处理的细胞感染。误差条表示三个实验的标准偏差。
基于氯菊酯的内吞途径涉及多种衔接蛋白。AP-2最初被认为是所有类型的氯氰菊酯介导的内吞作用所必需的，对Tfn的内吞很重要，但对EGF受体或低密度脂蛋白（LDL）受体的内吞不重要(9,53). 我们分析了AP-2在VSV感染中的可能参与，方法是使用之前发表的寡核苷酸（这里称为AP2-1和AP2-2），通过siRNA-介导的对HeLa细胞中AP-2的敲除，以对抗多聚体衔接蛋白复合物的α亚基(26,53)以及一种针对μ亚单位的所谓已证明性能的寡核苷酸（此处称为AP2-3）。为了获得最大的敲除，采用双转染方案，两次转染之间间隔48小时。
使用肌动蛋白作为负荷对照和抗α亚单位的单克隆抗体进行的Western blot分析表明，AP2-1的表达降低至11%，AP2-2的表达降至8%，AP2-3的表达降至30%（图。（顶面板）与转染AllStars阴性对照siRNA的样本中AP-2α亚单位的水平进行比较。AP-2μ水平的Western blot分析表明，在接受针对α亚单位AP2-1 siRNA处理的细胞中，μ亚单位的表达水平是对照细胞中检测到的84%，而对于另外两种寡核苷酸，AP2-2（抗α亚单位）和AP2-3（抗μ亚单位），AP-2μ水平仅为对照细胞的10%（图。，底部面板）。这一结果与先前发表的观察结果一致，即敲除AP-2的一个亚基会导致复合物其他亚基的下调(53).
VSV感染不依赖于AP-2。用针对AP-2α（AP2-1和AP2-2）或AP-2μ（AP2-3）的siRNA转染HeLa细胞。（A） 通过Western blotting对siRNA-处理细胞中AP-2α（顶面板）和AP-2μ（底面板）蛋白水平进行定量。结果显示为用AP2-1、-2或-3 siRNA处理的细胞中AP-2水平的百分比，并将其归一化为用AllStars阴性对照siRNA处理过的对照细胞中的AP-2水平，以及用作负荷对照的肌动蛋白水平。（B） 用AP2-1至AP2-3处理的细胞感染rVSV，用FACS对感染进行评分，所得值归一化为用AllStars阴性对照siRNA处理的细胞的感染水平。误差条表示三个实验的标准偏差。（C） 用AP2-1、-2和-3 siRNA或AllStars阴性对照siRNA处理的细胞感染rVSV 4小时。将AF594标记的Tfn加入样品中15分钟，固定前25分钟。分别使用小鼠抗AP-2α和AP-2μ抗体以及AF647标记的二级抗体检测AP-2α及AP-2μ水平。rVSV复制后通过GFP表达检测感染。棒材，10μm。
然后在0.5的MOI下用rVSV感染细胞4小时。为了进行荧光分析，将AF594标记的Tfn添加到细胞中15分钟。随后，在没有Tfn的培养基中再培养10分钟，然后用酸洗去除非内化Tfn。当通过FACS分析检测感染时，AP-2α或AP-2μ敲低的细胞显示，所有三种siRNA的VSV感染略有增加（图。). 荧光显微镜显示，不能内化Tfn的细胞感染了VSV（图。，打开箭头）。因此，AP-2对VSV感染显然不是必需的。
VSV与氯菊酯相互作用的动力学。
为了使用实时视频显微镜监测细胞表面相关VSV与氯氰菊酯的相互作用，我们用荧光染料（AF488、AF594或AF647）标记纯化的野生型VSV。所用细胞为瞬时转染mRFP-或EGFP-标记的氯氰菊酯轻链α（CLC-mRFP或CLC-EGFP）的HeLa细胞，或稳定表达CLC-EGFP的Vero细胞。在最初的实验中，我们将标记的病毒悬浮在为结合和内化而优化的培养基中，并将病毒添加到活细胞成像环中的盖玻片上的细胞中。在37°C下，使用TIRFM记录时间间隔视频，仅可视化那些与盖玻片表面的质膜相互作用的病毒颗粒。
当加入荧光病毒时，只有少数颗粒进入细胞和盖玻片之间的空间。视频记录显示，一些颗粒结合在细胞上，沿着质膜横向移动，直到被固定的、预先存在的网格蛋白mRFP簇所捕获（图。). 我们还观察到，在一些病例中，网格蛋白逐渐积聚在不动的表面结合病毒下面（见下文）。
VSV可以瞄准预制CCP。将AF488标记的VSV加入表达CLC-mRFP的HeLa细胞中，通过TIRFM进行活细胞成像。（A） 时间序列、（B）波形图和（C）强度图显示了标记的VSV如何从周围介质中出现在TIRF场中，并与稳定的CCP共存。
然而，进入细胞下方空间的病毒数量较少，限制了这种方法的实用性。最有可能的原因是VSV颗粒的尺寸相对较大，并且质膜与盖玻片的距离很近。为了避免这个问题，我们在盖玻片上涂上ECM，方法是让细胞生长汇合，然后使用EDTA去除细胞。然后将荧光病毒与ECM涂层的盖玻片结合。当加入表达荧光标记的CLC（CLC-mRFP或CLC-EGFP）的细胞时，由于ECM涂层，它们迅速扩散到盖玻片上并覆盖病毒颗粒。这使我们能够使用TIRFM有效地记录病毒与CLC-XFP在盖玻片表面的质膜上的相互作用。可以分析大量病毒及其与甲氰菊酯的相互作用。然而，缺点是大多数病毒颗粒被固定，无法进行内吞。
为了量化病毒颗粒和网格蛋白的共定位，使用了Image J程序。在位于传播细胞下方的88个病毒颗粒中，54个（61%）在200或400秒的记录中的某个时间点与CLC-XFP相关。在这些病毒中，有15种（28%）在记录开始时已经与CLC-XFP相关，25种（46%）诱导了氯氰菊酯的积累，17种（31%）与氯氰菊酯相关，但由于它们移出了含氯氰的区域或氯氰菌素外壳分离，它们失去了共定位。在某些情况下，氯氰菊酯出现在病毒下，并在外壳组装和拆卸周期中消失。尽管大多数观察到的VSV颗粒保持固定，但少数（共6个）变得可移动，并与CLC-XFP一起从TIRF场中消失，这表明它们被内吞在氯氰菊酯包被的囊泡中。无法与氯氰菊酯共定位的病毒是否与替代结构有关尚不确定；其中一些可能只是未能接触到质膜。
在图中。，以选定的数字图像（A）、波形图（B）和时间序列（C）中的强度图的形式显示了这些现象的示例。在图中。，AF647标记的病毒（伪红色）在初始位置静止，并在质膜的细胞质小叶上积聚CLC-EGFP（位置1，病毒和网格蛋白均由白色箭头指示）。然后，病毒离开CCP，但在质膜平面内，再次被限制，并诱导第二波CLC-EGFP组装（位置2，病毒和氯氰菊酯均由黑色箭头指示）。图中的波形图显示了相同的事件。白色箭头表示病毒和网格蛋白在位置1出现和消失，黑色箭头表示病毒与网格蛋白在地点2出现和消失（图。). 在位置1和位置2的禁闭期间，病毒在质膜平面内移动，没有任何明显的氯氰菊酯结合（由VSV-AF647 kymograph中的水平条指示）。在移动时，病毒总是没有网格蛋白关联。
VSV可诱导CCPs的形成。AF647标记的VSV（伪红色）和表达CLC-EGFP的HeLa细胞通过TIRFM进行活细胞成像。（A） 时间序列显示了一个受限的病毒颗粒（VSV-AF647中的白色箭头）及其下方的氯氰菊酯募集（CLC-EGFP中的白色图标，VSV[w/VSV]为52秒）。病毒随后分离并重新定位（VSV-AF647中的黑色箭头在131秒时出现），随后不久，坑崩塌（CLC-EGFP w/VSV在152到163秒时发生）。病毒再次确认后（VSV-AF647中的黑箭头在131秒时出现），病毒颗粒下方出现一个新的网格蛋白包被的凹坑（CLC-EGFP中的黑箭在391秒时出现VSV）。底部一行显示了无病毒（w/o VSV）关联的CCP时间序列（CLC-EGFP中的灰色箭头，w/o VSV为95秒）。（B） 与面板A中相同事件的Kymograph。白色箭头表示病毒和CLC信号在最初禁闭位置的出现和消失，黑色箭头表示第二个位置的平行事件。白色箭头（指示病毒从第一个位置消失）和黑色箭头（指示其在第二个位置出现）之间的条描述了病毒在质膜平面内运动的时间框架。（C） 强度图显示了病毒颗粒（红色方块）、病毒相关的网格蛋白（绿色菱形）和病毒依赖的CCP（灰色三角形）随时间的变化。
在病毒颗粒存在的情况下，CLC在形成CCP处的平均招募时间（从其最初出现到荧光强度达到稳定平台）为112 s±45 s。相反，如果没有任何相关病毒，CCP形成的平均速率（图。，灰色箭头）仅为53 s±17 s（图中的示例。图中的[底部面板]和强度图。[灰色三角形]），与之前发布的动态CCP数据一致(17)以及将网格蛋白募集到小货物中，如LDL和Tfn(15). 招募时间越长，可能与CCP的规模越大以及之前建议的其他大型货物所需的氯氰菊酯三倍剂量越多有关(15). 或者，与氯氰菊酯的长期结合可能反映出病毒被固定，CCP无法掐断。
VSV与dynamin-2和AP-2的关联动力学。
当表达dynamin-2-EGFP的HeLa细胞被固定在AF594标记的病毒上时，大多数（80%）的病毒颗粒(n个=59）与dynamin-2相关，其中36%在录音过程中被发现招募GTPase。此外，病毒有时会诱导一个以上的结合周期（图。). 图中的时间序列。图中显示了一个封闭的AF594标记的VSV（VSV-AF594）粒子（白色箭头）向质膜募集动力-2（68秒时为黑色箭头）。动力蛋白-2与质膜分离（114秒时为黑色箭头），但第二次被吸收（162到199秒时是黑色箭头）。GTPase的平均募集时间为55 s±17 s(n个=15），因此比CLC的招募时间更短。考虑到dynamin-2（在相当晚的一步）在囊泡形成中的临时作用，这是可以预期的。与VSV无关的质膜上随机选择的dynamin-2点的平均募集时间为25 s±9 s(n个=10），即约为病毒存在时的一半（图。，灰色箭头；8B，底板；和8C，强度图）。同样，差异可能是由于盖玻片上病毒颗粒的固定状态，或者仅仅是由于病毒周围形成了大尺寸的小泡。不幸的是，我们仅限于两个荧光团，这使我们无法同时监测VSV、氯氰菊酯和dynamin-2。
Dynamin被招募到血浆膜结合VSV。AF594标记的VSV和dynamin-2-EGFP表达的HeLa细胞通过TIRFM进行活细胞成像。（A） 时间序列显示一个受限的病毒粒子（VSV-AF594中的白色箭头）及其下方的动态素招募（动态素-2-EGFP中的黑色箭头，VSV[w/VSV]在68秒时出现）。随着时间的推移，动态信号变得较弱（动态-2-EGFP w/VSV，114秒），但随后强度再次增强（动态-2-EGFP，w/VSV，162秒）。底部一行显示了与VSV无关的dynamin-2-EGFP中dynamin-2-EGFP的质膜募集时间序列（114秒时无VSV[w/o VSV]）。（B） 如上文所述的面板A（C）相同事件的Kymograph图。强度图显示了病毒粒子（红色方块）、相关的动态蛋白（绿色钻石）和病毒依赖的动态蛋白质膜募集（灰色三角形）随时间的变化。
我们还使用TIRFM可视化了AP-2α-EGFP与VSV的关联。虽然AP-2在感染中没有作用（见上文），但我们可以看到它与38%的细胞相关的固定化病毒有关(n个= 344). 大多数这些病毒从记录开始就与衔接蛋白复合体相关，其中只有12%的病毒招募AP-2。在这些病例中，募集发生在136 s±66 s内，这比VSV诱导的CLC和dynamic-2的募集时间更长。在许多情况下，AP-2招募（图。，打开箭头）到受限病毒颗粒（图。，闭合箭头）的特点是强度在很长一段时间内逐渐增加（图。). 由于感染不需要AP-2，因此观察到的与VSV的关联可能反映了AP-2被困在非生产性氯氰菊酯涂层结构中。鉴于VSV的快速内化（图。)，与AP-2的结合太慢，无法参与内吞作用。
AP-2在质膜上与VSV共定位，但可能不会被病毒吸收。AF594标记的VSV和AP-2α-EGFP表达的HeLa细胞通过TIRFM进行活细胞成像。（A） 血浆膜结合病毒（VSV-AF594中的白色箭头）的时间序列及其与AP-2α的共定位（AP-2α-EGFP中的黑色箭头与VSV[w/VSV]从63秒开始）。最低一行显示AP-2α向质膜的募集与VSV无关（AP-2α-EGFP中的灰色箭头在63秒时无VSV[w/o VSV]）。（B） 时间序列中显示的相同事件的Kymograph。（C） 强度图显示了病毒颗粒（红色方块）、同位化AP2α（绿色菱形）和病毒依赖性AP-2α（灰色三角形）在质膜上随时间的变化。
讨论
在这项研究中，我们重新研究了VSV与宿主细胞（主要是HeLa细胞）的初始相互作用，并根据所需的动力学和细胞因子对进入进行了表征。我们发现VSV被迅速内吞但相对无效，并且酸诱导的激活几乎在内吞后立即发生。大多数病毒颗粒依赖CME进行内吞和感染。该过程依赖于向CCP招募的dynamin-2。虽然经典的衔接蛋白复合物AP-2与一些膜结合的VSV颗粒相关，但它在功能上是不必要的。该病毒与CCP有两种联系方式；它可以沿着膜横向移动并被捕获在预先形成的氯氰菊酯涂层的膜域中，也可以保持不动并在其限制位置诱导氯氰菊酯的结合。对于小型货物，如Tfn或LDL，氯氰菊酯补充阶段的持续时间比之前报告的更长，这可能是因为吞没颗粒所需的涂层坑的尺寸更大。Dynamin-2和在某些情况下AP-2也被招募到固定的病毒颗粒中。尽管大多数病毒是通过CCP进入的，但我们不能排除病毒颗粒可能使用低效替代途径的可能性。
VSV与细胞表面的结合效率很低，对pH值和细胞类型等外部因素很敏感(41,50). 内化也相对低效，只有三分之一的表面结合的病毒颗粒进入细胞。然而，内吞事件发生得很快，大多数进入的病毒颗粒在6至7分钟内内化，半时间为2.5至3分钟。因此，VSV内化过程比其他病毒（如SFV、流感a病毒和LCMV进入）更快(23,39,66). 动力学类似于Tfn摄取，其半衰期为2.5分钟(65,92).
内化后立即发生酸活化，第一批病毒颗粒已经通过NH4加温2分钟后进行Cl-敏感步骤。EM观察支持病毒实际上与内吞液泡的限制膜融合；除非使用NH提高pH值，否则在内胚体隔室中很少发现可识别的病毒颗粒4很可能已经发生了熔合和穿透，子弹形状的衣壳被拆开了。当观察到颗粒时，它们主要位于包被的、部分包被的或较小的、相对紧密的、光滑的囊泡中，没有内膜。只有在NH在场的情况下进行内部化4由于病毒融合和渗透受损，我们能够看到Cl在内吞室中积聚。
酸活化的最有效时间点是升温后3分钟左右，这比之前看到的时间更早，例如SFV和LCMV(22,66,93)，但与人类胚胎肾（HEK）293FT细胞中的VSV融合一致(74)以及VSV诱导的脂质体体外融合(5). 如果通过添加NH人为延长内化和酸活化之间的时间窗口超过10分钟4Cl在进入过程中，能够感染细胞的病毒比例降低，如果酸激活延迟超过1小时，内化的病毒几乎失去了所有的传染性。这表明，在内化后10分钟左右，大多数内化病毒仍具有融合能力，并存在于融合支持的细胞室中。随后，大多数病毒进入内吞室，在那里，酸激活的融合和穿透细胞溶质不再可能。最终，这些病毒颗粒很可能最终进入溶酶体，在那里VSVG被降解，在感染后30到60分钟开始。
Le Blanc等人提出，VSV的酸激活融合及其渗入细胞质分两步进行(35); 当pH值高于5.5时，病毒包膜首先与多囊泡内体内的内囊泡融合。一旦多囊泡内体成熟为晚期内体，病毒核衣壳就会通过细胞融合机制的作用，通过内囊泡与限制膜的回流释放到胞浆中。我们的结果表明，酸诱导步骤早在内化后2至3分钟在早期内体中发生。由于小泡在内吞作用的后期出现，与内部小泡融合的可能性不大。早期发生的融合与G蛋白活化的pH依赖性相一致，该活化已经在pH 6.2下发生(5,94). 早期内体的融合也符合VSV感染的Rab5依赖性和Rab7独立性(80)，我们已经确认（数据未显示）。
通过TIRFM监测病毒与内吞机制的相互作用，我们观察到病毒与网格蛋白外壳相互作用的两种不同机制。第一个例子是病毒颗粒从周围介质进入TIRF场，与质膜结合，并横向移动，直到被限制在先前存在的网格蛋白包被的膜域内。在其他情况下，在不动的病毒颗粒下面出现了一层网格蛋白。其他货物也观察到了这两种机制(15,71,75,79). 对于某些配体，靶向仅限于两种机制中的一种，而在其他情况下，两者都可以观察到。Ehrlich等人报告称，具有高表面迁移率的小货物，如Tfn和LDL，主要被分选成质膜上的预制凹坑(15). 活化的G蛋白偶联受体也显示出类似的结果(75,79)其中激动剂的激活导致arrestin-3在预制凹坑中积聚。
据报道，只有较大的货物（如病毒）才会在货物诱导下形成网格蛋白涂层的凹坑。Ehrlich等人报告说，经过280到1500秒的滞后阶段后，在表面结合的呼肠孤病毒颗粒下方出现了网格蛋白(15). 作者推测，氯氰菊酯的补充不是由货物引起的，而是由随机组装后病毒的外壳稳定引起的。这是基于计算得出的，计算结果表明，在病毒下方形成CCP的可能性与质膜上的随机点相同。在另一项研究中，流感病毒被证明能够利用这两种机制，尽管从头形成是目前最常见的事件(71). 作者提出，氯氰菊酯的募集是由病毒引起的，因为病毒禁闭部位的凹坑形成比质膜周围区域更频繁。我们的研究结果表明，VSV既可以利用已有的涂层凹坑，也可以诱导或稳定新的凹坑。氯氰菊酯对VSV的补充是病毒诱导信号的结果，还是稳定的随机形成的凹坑的结果，尚待确定。
在任何时候，大约40%与质膜相关的病毒颗粒没有与氯氰菊酯共定位。只有20%没有与dynamin-2相关，这与dynasore存在时VSV感染的有效减少相一致。另一方面，在我们的记录中，超过60%的病毒未能与AP-2共定位。此外，氯氰菊酯的募集事件百分比远高于AP-2（分别为46%和12%），且病毒颗粒的募集时间AP-2比氯氰菊酯长（分别为136 s±66 s和112 s±45 s）。
形成外径为90至100 nm的氯氰菊酯包被囊泡所需的时间约为32 s(15). 形成较大的涂层结构所需的时间相对较长。已经证明，对于小（5-nm）货物（如Tfn），氯菊酯的补充时间为25到50秒，对于较大货物（如呼肠孤病毒），则高达400秒(15). 由于VSV相对较大（～80×180 nm），因此预计病毒颗粒周围形成小泡所需的时间会延长。Ehrlich等人报告说，AP-2被招募到货物中的速度甚至比氯氰菊酯更快(15). 我们没有看到这一点，可能是因为观察到VSV感染不需要AP-2。
衔接蛋白复合物AP-2被认为是基于网格蛋白的内吞机制的核心成分之一（参考文献综述10,69、和90). 因此，出乎意料的是，AP-2缺失的细胞和对照细胞一样支持VSV感染。然而，考虑到最近描述基于氯氰菊酯但不依赖AP-2的进入途径的研究结果，VSV利用这样一种机制进入宿主细胞似乎是合理的。在过去的几年中，越来越多的所谓替代适配器被发现，像典型适配器AP-2一样，可以同时与质膜磷脂、甲氰菊酯和货物受体结合，并据此被归类为替代适配器（参考文献中综述52,60,61,69,85,89、和90). 其中一些与AP-2一起与货物交互(19,21,34)而其他人似乎能够在缺乏AP-2的情况下支持内吞作用(51). 经典的氯氰菊酯依赖性货物，如Tfn、LDL和EGF，在经典衔接蛋白复合物的AP-2需求方面表现出不同(9,26,53). 虽然Tfn的内吞严格依赖于AP-2，但LDL和EGF的内吞均发生在缺乏典型适配器的情况下。然而，EGF的持续摄取可能基于其氯氰菊酯非依赖途径的转变(59,83). 因此，AP-2耗竭对EGF的任何潜在影响都可以得到补偿，而LDL内化严格依赖于CME，并在没有AP-2的情况下由替代适配器Dab2维持(44).
Dynamin-2对病毒的补充速度快于氯氰菊酯的补充速度，在没有病毒的情况下，补充时间甚至更短（25 s）。这证实了以前关于动态蛋白的报道(15,48). VSV-associated dynamin-2相对较长的募集时间（55 s）可能反映了病毒周围需要形成的囊泡的大小，如氯氰菊酯。这与Rappoport和Simon的观点一致，他们认为CCP中氯氰菊酯及其相关dynamin2的量之间存在线性关系(67). 动态蛋白的停留时间更长也可以解释为病毒被固定，因此不可内吞。
总之，我们的研究结果表明，VSV颗粒在进入早期内体后很快被内部化并进行酸活化融合。虽然一些病毒颗粒通过预先形成的氯氰菊酯包被的小孔进入，但其他病毒颗粒通过诱导形成氯氰菊酯包被小孔来触发其内部化。很明显，VSV属于可以诱导形成网格蛋白外壳的病毒，在这样做时，它不仅是被动的乘客，而且利用了网格蛋白相关蛋白和功能的特定组合。
致谢
这项工作得到了瑞士国家研究基金会和苏黎世ETH的支持。
我们感谢苏黎世理工大学生物化学研究所的T.Heger对手稿的批判性阅读和实验支持。野生型VSV由苏黎世大学实验免疫学研究所H.Hengartner善意提供。重组VSV由苏黎世理工大学分子系统生物学研究所L.Pelkmans善意提供。疫苗病毒由苏黎世理工大学生物化学研究所J.Mercer善意提供。我们感谢J.H.Keen（宾夕法尼亚州费城Kimmel癌症中心）、A.Vonderheit（苏黎世联邦理工学院生物化学研究所）、M.McNiven（明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所）和L.Greene（马里兰州国家卫生研究院，贝塞斯达）提供的结构。我们还感谢苏黎世理工大学电子显微镜中心（EMEZ）对EM工作的帮助。
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