UNC-51/ATG1激酶通过调节运动-货物装配调节轴突运输

脑内轴突发育的表型分析unc-51号机组突变体

与之前关于unc-51号机组蠕虫和小鼠的轴突形成(Ogura等人，1994年;Tomoda等人，1999年)，果蝇unc-51突变体在胚胎期在腹神经索（VNC）中显示出不同程度的缺陷轴突束，包括过早截断和纵向束的异常中线交叉（H.Mochizuki、H.Toda、T.Tomoda和K.Furukubo-Tokunaga，unpubl.）。据估计，大约47%的突变体在三龄幼虫早期死亡，可能是由于胚胎期轴突形成缺陷所致。相比之下，其余的（～53%）在幼虫期存活，三龄幼虫的SGN延长（补充图S1C）并连接到正常的肌肉靶点（数据未显示），并在蛹期死亡。三龄期SGN横截面的电子显微镜（EM）分析显示，突变幼虫SGN中每个SGN的轴突数量和平均轴突管径与野生型没有区别（补充图S1D），这表明unc-51号机组存活到幼虫期的突变体在轴突形成方面几乎没有解剖学异常。

选择性膜定位缺陷unc-51号机组突变幼虫

因为最近对蠕虫和小鼠的研究表明unc-51号机组-轴突形成中介导的膜组织(Tomoda等人，2004年;Ogura和Goshima 2006)，我们测试了几种膜标记物，以确定扩展SGN中的潜在膜缺陷unc-51号机组突变三龄幼虫。我们观察到SVs在突变SGN中异常积聚，Syt-1的显著聚集证明了这一点(图1B). 与野生型相比，突变型SGN中Syt-1水平的升高与突触束数量减少、Syt-1免疫染色强度降低、束面积减少以及神经肌肉接头（NMJ）（A2段，肌肉6/7）处Syt-1总量减少有关（补充图S2）。另一个SV标记，半胱氨酸串蛋白（CSP）(Zinsmaier等人，1994年)，通过显示与Syt-1阳性聚集体在定位上几乎完全重叠来确认表型unc-51号机组突变体(图1B). 免疫电镜显示Syt-1阳性聚集物由轴突轴内的SV簇组成(图1C). 中的SV传输缺陷unc-51号机组突变体被unc-51号机组转基因表达(埃拉夫^{155立方厘米}>无人机-unc-51号机组;unc-51号机组^三/unc-51号机组²⁵)，将突变表型归因于unc-51号机组活动(图1D). 激酶缺乏unc-51号机组在ATP结合位点携带点突变的转基因未能拯救突变表型(埃拉夫^{155立方厘米}>无人机-unc-51号机组^K38A公司;unc-51号机组^三/unc-51号机组²⁵)证明了激酶活性在组织轴突膜中的关键作用(图1D).

为了进一步解决受以下因素影响的膜类型的选择性unc-51号机组检测突变和其他标记。Rab5是早期内体标记物，在突变SGN中显示出轻度聚集，与CSP阳性SVs的模式不同（补充图S3A）。晚期内体-溶酶体标记LAMP1显示了许多聚集体，其中一些聚集体与SV聚集体共定位（补充图S3B）。相反，突变体中的线粒体整体定位似乎未受影响，很少与Syt-1重叠（补充图S3C），这表明SV聚集体不是线粒体运输的物理屏障，SV和线粒体具有不同的运输途径。定量分析证实，丝裂原阳性点的大小总体分布小于20μm²野生型和unc-51号机组突变体（补充图S3D），尽管更大的点（>20μm²)出现在unc-51号机组突变体（补充图S3E），表明线粒体运输也受到影响unc-51号机组突变体。事实上，用延时视频显微镜分析线粒体标记的线粒体(OK6公司>无人机-丝裂原｜GFP)发现野生型线粒体的平均运动速度为0.25±0.02μm/sec(n个=27），而unc-51号机组突变体平均移动0.16±0.02μm/sec(n个=36）（补充电影S1）。因此unc-51号机组突变以货物类型依赖的方式导致不同程度的轴突膜缺陷。

在EM分析中，我们观察到在unc-51号机组突变轴突比野生型更频繁。这些包括致密核心小泡、多小泡体（补充图S1E）和小而透明的小泡，让人想起SV(图1C). 综上所述，这些结果表明unc-51号机组对于在幼虫SGN中组织轴突膜很重要。

unc-51号机组SV传输中的功能

中的SV聚合unc-51号机组突变体(图1B)让人想起了关于动蛋白重链(科赫（Khc）)(赫德和萨克斯顿1996)，Kinesin轻链(Klc公司)(Gindhart等人，1998年)、和Dynein重链(Dhc公司)(Martin等人，1999年). 就像这些变种人一样，unc-51号机组突变体表现出缓慢的幼虫爬行和偶尔的尾巴翻转（数据未显示），这是与轴突运输缺陷一致的表型。SV主要产生于神经元胞体，并通过顺行运输机制传递到突触。可视化SV传输缺陷unc-51号机组突变SGN，进行延时视频显微镜检查（补充电影S2）。野生型三龄幼虫(OK6公司>无人机-系统-1｜eGFP)，大多数标记有Syt-1｜eGFP的囊泡以正常轴突运输的典型速度移动（速度高达2.26μm/sec；平均0.89±0.06μm/s，n个=47），53.2%的囊泡向前移动，46.8%的囊泡向后移动，这与最近的一项研究非常一致(Barkus等人2008). 相反，在unc-51号机组在观察期（30秒）内，突变体和聚集物外约95%的小个体点状突起不动或移动速度低于0.2μm/sec。小于5%的Syt-1｜eGFP阳性囊泡是可移动的unc-51号机组突变体为0.05±0.01μm/sec(n个=62）（补充电影S2）。因此，unc-51号机组在幼虫期SV转运中起重要作用。

unc-51号机组与驱动蛋白1依赖性轴突转运成分的遗传相互作用

鉴于此unc-51号机组在SV转运中的功能，我们研究了unc-51号机组之前通过检测SV转运缺陷，发现一些基因与轴突转运有关。其中，unc-76型(Gindhart等人，2003年)和Klc公司显示出与unc-51号机组在双杂合方案中(unc-76号机组^+/−;unc-51号机组^+/−或Klc公司^+/−,unc-51号机组^+/−)(图2；补充图S4），通常用于识别运输基因之间的功能相互作用(Martin等人，1999年). UNC-76是一种KHC衔接蛋白，对驱动蛋白-1介导的轴突运输是必要的(Gindhart等人，2003年)KLC是驱动蛋白-1的辅助成分(Gindhart等人，1998年). 定量分析表明unc-76号机组^+/−;unc-51号机组^+/−双杂合子的SV聚集体（～7/50μm）比unc-76号机组^+/−或unc-51号机组^+/−单一杂合子（<2/50μm）(图2，图）。同样地，Klc公司^+/−,unc-51号机组^+/−与之相比，双杂合子具有显著更多的SV聚集体Klc公司^+/−或unc-51号机组^+/−单一杂合子（补充图S4，图表）。相反，科赫（Khc）,Dhc公司,unc-104号机组(伊马克)(Pack Chung等人，2007年)，星期日司机(雪梨)(鲍曼等人，2000年)，清单-1(Liu等人，2000年)、和阿普利普1(Horiuchi等人，2005年)与unc-51号机组（补充图S4，图表）。这表明unc-51号机组-轴突运输的依赖性调节涉及与驱动蛋白-1介导的细胞器运输有关的成分。

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图2。

unc-51号机组与基因相互作用unc-76号机组在轴突运输中。野生型SGN或指示突变体在三龄幼虫期用抗CSP免疫染色。箭头显示CSP阳性聚集物。棒材，20μm。对每个基因型（图）的每50μm神经干中发现的聚集物数量进行评分。Student评估的统计显著性t吨测试。(**)对< 0.01. 误差条显示±SEM。基因型为w个^-(A类)，unc-51号机组^三/+ (B类)，unc-76号机组^{英国国防部（1）107}/+ (C)、和unc-76号机组^{英国国防部（1）107}/+;unc-51号机组^三/+ (D类).

UNC-51通过UNC-76与KHC形成复合物

提供关于如何unc-51号机组我们研究了UNC-51和UNC-76或KLC之间的物理相互作用。尽管UNC-51不与KLC结合（数据未显示），但在HEK293T细胞的共免疫沉淀分析中，UNC-51与UNC-76结合。使用一系列UNC-51和UNC-76缺失结构进行的额外共免疫沉淀分析显示，UNC-51的C′末端尾部与UNC-76 N′末端结构域结合，该结构域以UNC-76为轴突靶点(布鲁姆和霍维茨1997)，也绑定到UNC-76 C′末端结构域，其中包含线圈基序(图3A；补充图S5）表明UNC-76以二分方式结合UNC-51。GST下拉实验证实了UNC-51和UNC-76之间的直接相互作用(图3B). 图3C总结了UNC-51和UNC-76的关联域。此外，在联合免疫沉淀试验中，UNC-51能够在UNC-76的存在下沉淀KHC(图3D). 因此，我们假设UNC-51通过与UNC-76相互作用，在运动蛋白-1依赖的轴突运输中发挥作用。

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图3。

UNC-51、UNC-76和KHC的物理相互作用。(A类)如图所示，在HEK293T细胞中共表达Myc-tagged UNC51（全长）和HA-taged UNC-76（截断突变体）。细胞裂解物经抗HA免疫沉淀，然后用抗myc免疫印迹。（*）抗HA抗体检测到的非特异性带（22 kDa）。(B类)UNC-51在体外与UNC-76结合。GST单独或GST与全长UNC-76融合产生于大肠杆菌，在谷胱甘肽Sepharose珠上纯化，并与体外翻译（IVT）产生的myc标记的UNC-51 C′-末端结构域（氨基酸557–855）孵育。结合到珠子上的蛋白质被洗脱，并使用抗myc进行免疫印迹分析。(C)UNC-51−UNC-76结合所涉及域的示意图。黑条显示在共免疫沉淀分析中结合另一种的缺失结构。以灰色显示的结构没有结合。除UNC-76（118−340个氨基酸）外，所有缺失结构的结合都通过共免疫沉淀试验进行测试A类和补充图S5，而GST下拉分析证实UNC-76（118−340氨基酸）与UNC-51没有结合（数据未显示）。每个蛋白质中都显示了UNC-76和UNC-51功能域。(D类)UNC-51通过UNC-76与KHC形成复合物。HEK293T细胞提取物包含外源表达的UNC-51（全长）、UNC-76（全长）和KHC（全长），如图所示，通过抗-HA免疫沉淀法进行分析，然后用所示抗体进行免疫印迹。

无组织的电机-货物定位unc-51号机组突变体

为了进一步调查unc-51号机组在运动蛋白1依赖性轴突运输中，我们首先检测了MTs在unc-51号机组突变体。MT-相关蛋白MAP1B的定位在unc-51号机组突变的SGN（补充图S6A）和MT-驱动蛋白共沉淀试验表明，MT-驱动蛋白关联在unc-51号机组突变体（补充图S6B）。此外，由KHC携带的线粒体的定位在很大程度上不受影响，其运输在unc-51号机组突变体（补充图S3C，D；补充电影S1）。虽然这些数据并不排除在以下情况下运动蛋白活性或细胞骨架功能受损的可能性：unc-51号机组突变体，我们研究了马达-货物解耦的额外可能性，并分析了货物和马达复合体在unc-51号机组突变体。

值得注意的是，SV聚集体几乎完全从UNC-76阳性结构域中分离出来unc-51号机组突变体，而野生型仅观察到SV和UNC-76染色的扩散模式(图4A)，与之前的研究一致(Gindhart等人，2003年). 定量分析显示，62.5%的穿孔出现在unc-51号机组突变体为Syt-1单阳性，35%为UNC-76单阳性，只有2.5%为Syt-1/UNC-76双阳性(图4A，图）。接下来，将UNC-76的定位与unc-51号机组突变轴突。56%的puncta为UNC-76/KHC双阳性，7%为UNC-76单阳性，37%为KHC单阳性(图4B，图），表明大部分UNC-76阳性点刺对KHC也呈阳性，表明unc-51号机组活性对于UNC-76与KHC的相互作用是必不可少的。CSP阳性和KHC阳性点状细胞的分析unc-51号机组突变体显示，18%的点子为CSP/KHC双阳性，37%为CSP单阳性，45%为KHC单阳性(图4C，图）。综上所述，这些数据增加了SV与运动复合体分离的可能性unc-51号机组突变体。

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图4。

SV和运动复合体的无组织定位unc-51号机组突变体。(A类)的SGNunc-51号机组突变体(unc-51号机组^三/unc-51号机组²⁵)或用抗UNC-76（红色）和抗Syt-1（绿色）免疫染色的野生型三龄幼虫。红色箭头和箭头指向指示蛋白质的异常定位。这个正确的面板显示放大的图像（箭头，UNC-76；箭头，Syt-1）。中UNC-76和/或Syt-1的阳性点号unc-51号机组对突变SGN进行评分，图中显示了单阳性或双阳性点的百分比。SGN从近侧定位(顶部)朝向远端(底部). (B类)的SGNunc-51号机组用抗UNC-76（红色）和抗KHC（绿色）免疫染色的突变体或野生型幼虫。红色箭头表示所示蛋白质的异常定位。这个正确的面板显示放大图像（星号，KHC/UNC-76双阳性聚集物）。UNC-76和/或KHC的阳性点号unc-51号机组对突变SGN进行评分，并显示单阳性或双阳性点状细胞的百分比（图）。(C)的SGNunc-51号机组用抗CSP（红色）和抗KHC（绿色）免疫染色的突变体或野生型幼虫。红色箭头和箭头指向指示蛋白质的异常定位。右侧面板显示放大的图像（箭头，CSP；箭头，KHC）。（图）CSP和/或KHC的正点数量unc-51号机组对突变SGN进行评分，并显示单阳性或双阳性点状细胞的百分比。(D类)的SGNunc-51号机组用抗CSP抗体（红色）和抗UNC-76抗体（绿色）对突变或野生型幼虫进行免疫染色，并用共焦显微镜进行观察（100倍物镜；以0.7-μm的间隔进行单个光学切片）。SGN从近侧定位(左边)朝向远端(正确的). 使用图像分析程序根据共焦数据计算CSP、UNC-76或这两种信号的阳性区域，并在图表上以示意图表示。棒材，10μm。

为了详细了解SV和UNC-76在正常运输中的关系，我们分析了野生型SGN中CSP和UNC-66双重染色的高分辨率图像，并与unc-51号机组突变SGN(图4D). CSP和UNC-76在野生型SGN中均表现出广泛分布。在CSP或UNC-76的总阳性面积中，18%为CSP/UNC-76双阳性，11%为UNC-76单阳性，71%为野生型CSP单阳性。在unc-51号机组突变体中，CSP/UNC-76双阳性区显著小于野生型（4%），UNC-76单阳性区大于野生型（23%），而CSP单阳性区与野生型（73%）相似(图4D，图），这与Syt-1/UNC-76双染色结果一致(图4A). 数据表明，约20%的SV由含有UNC-76的野生型电机携带unc-51号机组调节这部分SV与含有UNC-76的运动复合物的偶联。

这些数据以及之前的发现unc-76号机组突变体具有SV聚集缺陷(Gindhart等人，2003年)，导致我们假设UNC-76调节SV和KHC电机的耦合。免疫组织化学分析显示unc-76号机组突变体（补充图S7），与unc-51号机组突变体。因此，数据表明，UNC-76和UNC-51可能通过调节运动-货物耦合在轴突运输中发挥协同作用。

UNC-76 Ser的磷酸化¹⁴³对轴突运输至关重要

为了提供关于UNC-51和UNC-76如何协同控制运动-货物装配的分子见解，我们研究了UNC-51激酶是否磷酸化UNC-76，因为转基因拯救实验证明了UNC-61激酶活性在体内轴突运输中的重要性(图1D). 使用[γ]进行体外激酶测定-³²P] -包含ATP、UNC-76³²P以UNC-51激酶依赖性方式(图5A). 在HEK293T细胞的异源表达系统中，UNC-76在野生型UNC-51的存在下表现出迁移性改变，这被磷酸酶处理所消除(图5B). 相反，激酶缺陷型UNC-51/K38A未能产生UNC-76的迁移率变化(图5C).

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图5。

UNC-76 Ser的磷酸化¹⁴³通过UNC-51是轴突运输所必需的。(A类)通过UNC-51激酶体外磷酸化UNC-76。对HEK293T细胞中表达的HA标记的UNC-51或UNC-51/K38A进行免疫沉淀，并与His-UNC-76在Mg存在下孵育²⁺和[γ-³²P] -ATP。通过放射自显影分析磷蛋白。黑色箭头表示UNC-51自动磷酸化。红色箭头表示UNC-76磷酸化。(B类)在HEK293T细胞中，Myc-tagged UNC-76和HA-taged UNC-51共表达。将细胞裂解物与（+）或（-）碱性磷酸酶（CIAP）孵育一段指定的时间，并使用抗myc进行免疫印迹分析。红色括号表示UNC-76的机动性变化。黑色括号表示非移位UNC-76。(C)Myc标记的野生型和Ser/Thr→Ala突变体UNC-76在具有UNC-51或UNC-51/K38A的HEK293T细胞中表达。使用抗myc通过免疫印迹分析细胞裂解物。红色括号表示UNC-76的机动性变化。(D类)野生型和unc-51号机组用抗磷酸-UNC-76抗体对突变幼虫进行免疫印迹分析。抗actin和抗UNC-76被用作负荷控制。(E类)神经轴突转运缺陷的基因修复unc-76号机组突变体unc-76号机组转基因。CSP阳性聚集（箭头）和KHC聚集（箭头unc-76号机组变种人被拯救unc-76号机组^重量(顶部)或unc-76号机组^S143D系列(中间的)，但不是由unc-76号机组^S143D系列转基因(底部). 转基因表达是由埃拉夫.unc-76号机组^{东风（1）107}半合子男性被用作unc-76号机组-null突变体。每个基因型的三龄幼虫都用抗KHC（绿色）、抗UNC-76（红色）和抗CSP（蓝色）染色。注意在VNC和SGN中UNC-76转基因的等效表达水平。（**）统计显著性(对<0.01，学生t吨测试）。（n.s.）不重要(对= 0.18). 棒材：红色，50μm；白色，20μm。

为了鉴定UNC-76中的特定磷酸化残基，我们在五个Ser/Thr残基中引入了一系列Ala突变，这五个残基在进化上在秀丽线虫,果蝇，和大鼠UNC-76(Bloom和Horvitz 1997年;Kuroda等人，1999年;Gindhart等人，2003年). 当与UNC-51激酶一起在HEK293T细胞中表达时，只有UNC-76/S143A突变未能产生迁移率变化(图5C)，表示Ser¹⁴³是磷酸化的位点。对HEK293T细胞中UNC-51磷酸化的UNC-76蛋白的质谱分析也证实了¹⁴³作为磷酸化位点（补充图S8）。序号¹⁴³使用针对磷酸化-Ser的抗体在体内进一步验证磷酸化¹⁴³-含有UNC-76肽。在野生型幼虫的提取物中检测到磷-UNC-76，但在unc-51号机组突变体(图5D). 提供体内证据证明UNC-76 Ser¹⁴³磷酸化是正常轴突运输所必需的，我们将野生型UNC-76、拟磷酸UNC-76/S143D或磷酸缺陷UNC-76/S143A转基因引入unc-76号机组突变体背景，并测试每个转基因是否可以挽救轴突运输缺陷。UNC-76/wt和UNC-76/S143D挽救了SGN中的SV和KHC聚集表型，但UNC-76/S143A未能挽救缺陷(图5E). 根据这些结果，被营救幼虫的NMJ突触（A2段，肌肉6/7）中发现的总SV数量显著大于未营救幼虫（补充图S9）。在获救的幼虫体内(unc-76号机组^−/−;埃拉夫>unc76号文件^重量和unc-76号机组^−/−;埃拉夫>unc-76号机组^标准偏差)与未去核幼虫相比，NMJ中突触突触突触体的数量、突触体面积的大小和CSP染色的总量增加(unc-76号机组^−/−;埃拉夫>unc-76号机组^{沙特阿拉伯})表明UNC-76/wt或UNC-76/S143D转基因挽救了SV转运缺陷。总之，这些数据证明了UNC-51介导的UNC-76 Ser磷酸化的关键作用¹⁴³控制轴突运输。

磷酸化介导电机-货物组件

此前，关于磷酸化在调节细胞器运动中的作用的体外研究尚不清楚，也存在争议。一系列激酶，包括PKA、PKC和PKG，对运动蛋白依赖性轴突运输没有影响(Bloom等人，1993年)而PKA磷酸化驱动蛋白被认为可以抑制快速轴突运输和驱动蛋白与膜细胞器的结合(Sato-Yoshitake等人，1992年;Okada等人，1995年). 糖原合成酶激酶3β（GSK3β）磷酸化KLC，通过向鱿鱼轴突灌注活性GSK3(Morfini等人，2002年). 最近有报道称，CaMKII在体外干扰KIF17-Mint1结合中的抑制作用(Guillaud等人2008). 然而，直到最近，磷酸化在轴突运输中的生理作用才在体内得到解决(Horiuchi等人，2007年)JNK介导的磷酸化抑制了驱动蛋白-1–JIP1适配器的相互作用。

我们的研究揭示了UNC-76磷酸化在轴突运输过程中的关键作用，这很可能是在运动-货物界面引发的。有几条证据支持这一观点。第一，unc-51号机组与驱动蛋白-1适配器的遗传相互作用unc-76号机组体内轴突运输。第二，生化实验表明，UNC-76和Syt-1的结合是通过UNC-51依赖的UNC-76磷酸化介导的。第三，FRET分析证实了细胞中UNC-76和Syt-1之间的直接联系，这通过抑制UNC-51激酶活性而减弱。最后，SV传输缺陷unc-76型在体内，突变体可通过磷酸仿酶UNC-76而非磷酸缺陷UNC-76被挽救。

基于这些发现，我们提出了一个模型，其中适配器磷酸化是维持轴突内运动-货物联系并导致SV高效运输的关键调节步骤(图7). 通过UNC-51激酶磷酸化后，UNC-76与SV膜蛋白（如Syt-1）的亲和力增加。UNC-51激酶活性的减弱将降低UNC-76对SV膜蛋白的亲和力，并导致SV货物与运动复合物分离。在我们的模型中，通过UNC-76的去磷酸化也可以降低汽车与货物的亲和力，尽管这种调节因素尚未确定。UNC-51活性的减弱或磷酸酶活性的激活可以解释SV货物从驱动蛋白马达上脱落的机制。需要进行更多的工作来确定UNC-51激酶活性是如何在空间和时间上受到控制以调节轴突运输的。值得注意的是，在野生型三龄幼虫的NMJ中未检测到UNC-51和UNC-76（补充图S11），这表明轴突末端运动-货物分离的空间控制。

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图7。

UNC-51激酶介导的运动-货物装配示意图模型。我们的结果表明，UNC-51蛋白激酶通过驱动蛋白-1依赖性途径在轴突运输中发挥作用。当UNC-51激酶磷酸化时，作为KHC适配器和驱动蛋白-1潜在激活剂的UNC-76与SV膜蛋白（如Syt-1）的亲和力增加。UNC-51可能磷酸化对轴突运输至关重要的额外底物（虚线箭头）。UNC-51激酶活性的丧失或减弱将导致UNC-76与SV膜蛋白的亲和力降低，SV货物与运动复合物的分离，NMJ的情况可能就是这样。激动素-3（imac/UNC-104）也在很大程度上负责SV的转运，并且对于将SV从神经元胞体运送到轴突和突触非常重要（红色箭头）。

该机制可以解释SV子集的传输。在野生型SGN中，只有～20%的SV与UNC-76共定位(图4D)，这表明一个额外的马达/适配器系统，如驱动蛋白-3，负责在幼虫期携带其余SV，如前所述。事实上，SV的一个亚群成功地到达了unc-51号机组突变体NMJ，尽管这些突触泡的大小和数量较小（补充图S2）。同样可能，UNC-51/UNC-76/驱动蛋白-1活性对于将SV加载到细胞体的运动复合体上是不必要的，因为在这些突变体中，SV聚集体存在于轴突内，并且远离细胞体。因此，UNC-51/UNC-76/运动蛋白-1复合体对于维持轴突内的运动-货物联系而不是负责最初的货物装载似乎很重要。或者，母体存放unc-51号机组或科赫（Khc）如前所述，可能有助于SV部分运输至轴突，UNC-51/UNC-76/运动蛋白-1复合体在初始货物装载中的潜在作用可能在我们的分析中被掩盖unc-51号机组突变体。

虽然我们的研究清楚地表明，UNC-51激酶对UNC-76的磷酸化对SV转运至关重要，但磷酸化UNC-76转基因未能挽救SV转运缺陷unc-51号机组突变体（数据未显示）。这意味着UNC-76的磷酸化不足以进行SV转运，并表明UNC-51磷酸化的额外靶点对于适当的SV转运是必要的。KHC和KLC都是磷酸蛋白(霍伦贝克1993;Morfini等人，2002年)、和unc-51号机组在基因上与Klc公司因此，需要测试其他转运成分，包括KHC和KLC，作为UNC-51激酶的候选底物，以了解unc-51号机组-介导轴突运输机制。

目前尚不清楚unc-51号机组导致驱动蛋白运动复合物聚集。生物物理研究表明，与驱动蛋白尾部结构域结合的货物需要展开驱动蛋白分子并激活其在MT上的运动功能(Coy等人，1999年;Friedman和Vale 1999年;哈克尼和斯托克2000)这表明，电机-货物组件的故障可能会导致驱动蛋白电机的失速和聚集。关于驱动蛋白运动的激活，最近的一份报告讨论了UNC-76/FEZ1在驱动蛋白动作展开从而激活中的新作用(Blasius等人，2007年). 在这个模型中，两个支架/适配器蛋白JIP1和UNC-76/FEZ1诱导了驱动蛋白-1的逐步构象变化，导致其作为体外马达的完全激活。与此模型一致unc-76号机组导致SVs和KHC在体内的无组织定位（补充图S7）。结合我们的发现，磷酸化类UNC-76能够挽救unc-76号机组突变体中，UNC-76/FEZ1可能不仅作为运动-货物连接物，还以磷酸化依赖的方式作为驱动蛋白-1激活物发挥作用。因此，这种依赖于磷酸化的适配器调节可能解决了控制驱动蛋白-1活性的另一种机制，这对轴突运输至关重要。

虽然unc-51号机组和unc-76号机组这些途径可以协同激活驱动蛋白-1的活性unc-51号机组导致完全失去科赫（Khc）活动。在unc-51号机组突变体，线粒体转运部分减弱，但大多数线粒体仍在转运，这表明线粒体转运的主要马达KHC的整体活性(Stowers等人，2002年)，已保存。我们的免疫组织化学证据支持这一观点，这表明KHC的一个亚群以聚集体的形式存在，而其余的KHC则分布在轴突中。这表明KHC活性的一部分可能不受unc-51号机组突变体，并且KHC的UNC-76独立人群功能活跃，参与其他货物的运输。虽然UNC-51通过UNC-76与KHC形成复合物，但KHC分布在unc-51号机组突变体强烈表明UNC-51和KHC之间存在功能性相互作用，UNC-51对驱动蛋白-1活性的调节可能是通过UNC-76或其他因子如KLC介导的，并且UNC-51对于KHC马达的影响可能是间接的。在这方面，这表明unc-76型和unc-51号机组显示出明显的遗传相互作用，而科赫（Khc）和unc-51号机组不要表现出明显的遗传相互作用。

质粒构建

从DGRC中获得全长UNC-51（LD18893）、UNC-76（LD08195）和KHC（SD02406）cDNA(果蝇属京都遗传资源中心）。为了获得全长Syt-1 cDNA，对从野生型三龄幼虫脑中纯化的mRNA进行RT-PCR。这些基因的编码区被插入pRK5-HA/myc的SalI/NotI位点以在哺乳动物细胞中表达，pGEX4T-2用于GST融合蛋白在哺乳动物细胞的表达大肠杆菌，pET-28c（+）用于6xHis标签蛋白表达大肠杆菌，或进入pUAST的EcoRI/NotI位点，用于在果蝇属通过PCR扩增UNC-51和UNC-76的缺失构建体。通过定点突变将单一氨基酸点突变引入UNC-51和UNC-76。Syt-1和UNC-76分别与Cerulean和Venus、绿色荧光蛋白（GFP）的蓝色（CFP）和黄色（YFP）变体在融合位点融合，并插入pRK5的SalI/NotI位点。

幼虫组织染色

幼虫组织的制备和染色按照Kurusu等人（2002年）使用的主要抗体为兔抗Syt-1（1:1000；特洛伊·利特尔顿赠送）、豚鼠抗UNC-76（1:100）、豚鼠抗UNC-51（1:100，小鼠抗CSP（1:10；发育研究杂交瘤库[DSHB]）、小鼠抗FasII（1:10，DSHB）、FITC-结合HRP（1:100；杰克逊免疫研究）、兔抗KHC（1:200；细胞骨架公司）、，和小鼠抗Futsch（MAP1B-like；22C10）（1:5；DSHB）。所用的二级抗体为Alexa 543结合山羊抗兔、Alexa 488结合山羊抗家兔、Alexa-543结合羊抗豚鼠和Alexa 633结合山羊抗鼠（1:500；分子探针）。为了量化CSP、Syt-1、KHC或UNC-76的聚集物数量，通过应用阈值（比例因子4）从每个图像文件中减去背景水平，并使用ImageJ软件（NIH）对粒子数进行评分。现场分析unc-51号机组mRNA表达按照Hauptmann和Gerster（2000），使用全长果蝇unc-51cDNA。

时间推移视频显微镜

野生型或unc-51号机组携带两种UAS的变异游荡三龄幼虫-丝裂原｜GFP和运动神经元驱动器OK6公司-Gal4或携带两个UAS的-系统-1｜eGFP和OK6公司-在施耐德培养基中快速解剖Gal4（<2min），暴露的神经安装在盖玻片上。使用蔡司LSM 510，使用100×物镜进行时间推移成像（对于mito GFP为1 fps，对于Syt-1 eGFP为5 fps【帧间200毫秒间隔】）。为了增加信号，两个艾里单位打开了针孔。在电影中，SGN的方向为左前右后。Syt-1｜eGFP电影实时播放两次，而mito｜GFP电影则实时播放五次。针对每一帧单独跟踪MitoGFP-阳性或Syt-1бeGFP-正包，并使用Image Pro Plus软件（Media Cybernetics，Inc.）计算其平均传输速度（每个包的移动距离/[1秒或200毫秒×帧数]）。

抗体生成

为了产生抗UNC-51抗体，在大肠杆菌用谷胱甘肽-Sepharose 4B珠纯化，并注入豚鼠（MBL）。将产生的抗血清吸附到GST上，然后使用含有GST-UNC-51（氨基酸557-855）的色谱柱进行亲和纯化。为了产生磷酸特异性UNC-76抗体，一种含有磷酸化-Ser的UNC-76肽¹⁴³合成了（TETFGG[pS]LEDLVN），进行了HPLC纯化，并与KLH偶联。将两只免疫小鸡产下的蛋合并，并通过Aves实验室纯化整个IgY组分。该抗体检测到表观分子质量大于UNC-76预期MW的条带，这可能是由于体内UNC-76的修饰，通过翻译后修饰如磷酸化。

协同免疫沉淀

异源表达系统中的协同免疫沉淀分析如Tomoda等人（2004年）简而言之，使用Lipofectamin2000（Invitrogen）将pRK5构建物转染HEK293T细胞。转染后22小时，收集细胞并在TNE中溶解₁₅₀含1%Triton X-100的缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM-PMSF，蛋白酶抑制剂混合物）在冰上放置40分钟。在14000下通过离心法清除裂解液克在4°C下保持10分钟，将所得上清液与兔抗HA（Abcam）混合，然后添加蛋白A-琼脂糖珠（Amersham）。用SDS-PAGE分析免疫沉淀物，然后用抗myc（9E10；1:250）进行免疫印迹。

实验

GST融合构建体（GST-UNC-76[全长]或GST-KHC[氨基酸675–975]）(Gindhart等人，2003年)被引入大肠杆菌菌株BL21（Stratagene）和蛋白表达由3%诱导剂（Molecula，Inc.）诱导，该诱导剂是异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的类似物。在谷胱甘肽Sepharose 4B珠上纯化表达蛋白。通过体外转录/翻译（Promega）产生C′末端UNC-51（氨基酸557-855）并应用于GST柱。UNC-76和Syt-1在HEK293T细胞中表达并应用于柱。结合蛋白用SDS-PAGE分析，然后进行免疫印迹。

质谱法

将HA-UNC-76和myc-UNC-51共转染到HEK293T细胞中。用抗HA纯化表达的UNC-76，通过SDS-PAGE进行解析，并通过Sypro-Ruby染色（分子探针）进行可视化。从凝胶中去除磷酸化（超转移）UNC-76，用二硫苏糖醇还原，用碘乙酰胺烷基化，并用胰蛋白酶消化（改良测序等级；Promega）。用LC/MS分析提取的肽^三对于磷酸化残基，请遵循Gruhler等人（2005）简而言之，使用NanoLC-2D HPLC系统（Eksigent Technologies）和300μm ID×5 mm捕集柱（PepMap C）对样品进行HPLC分离₁₈，Dionex）和一个75μm ID×10-cm分析柱，内部填充3μm C₁₈二氧化硅（Pursuit，Varian）。洗脱后的肽直接喷入LTQ-FT质谱仪（ThermoElectron）。使用仪器的高分辨率FT-ICR部分进行全质量扫描。在线性离子阱部分中，通过MS/MS分析每个完整扫描中超过预设阈值的多达五个离子。质谱自动分析磷酸大量流失的碎片离子^三使用制造商提供的程序（extract_msn.exe）从原始数据文件中提取串联质谱，并在SwissProt数据库中搜索UNC-76序列，其中附加Sequest（ThermoElectron），假设胰蛋白酶特异性、半胱氨酸完全烷基化、蛋氨酸可能氧化、，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的可能磷酸化。微软^三使用msxml2other.exe提取光谱(网址：http://sashimi.sourceforge.net)并使用Sequest和MS使用的相同参数集进行搜索²，除了考虑丝氨酸和苏氨酸脱水而不是磷酸化。

MT–驱动蛋白共沉淀测定

MT−驱动蛋白共沉淀分析基本上按照Saxton等人（1988年）简而言之，三龄幼虫在冰镇MT组装缓冲液（pH 6.9，0.1 M管道，0.9 M甘油，5 mM EGTA，0.5 mM EDTA，2.5 mM MgSO）中均质₄)添加一次蛋白酶抑制剂鸡尾酒。匀浆在15000下离心克20分钟，然后在30000克30分钟，去除不溶性物质。通过向上清液中添加0.3 mM GTP和20μM紫杉醇诱导MT聚合，并在室温下培养20分钟。MT悬浮液再与2.5 mM AMP-PNP和2.5 mM MgSO孵育10分钟₄然后在23000℃下，通过蔗糖缓冲液（20%蔗糖，10μM紫杉醇，0.3 mM GTP在组装缓冲液中）沉淀MT克50分钟，洗涤一次，并使用抗KHC（1:1000，兔多克隆；Cytoskeley，Inc.）、小鼠抗β-微管蛋白（E7）（1:100；DSHB）和抗Syt-1（1:5000，兔多克隆；Noreen Reist的礼物）进行免疫印迹分析(Mackler等人，2002年).

体外激酶测定

野生型或激酶缺失型UNC-51/K38A瞬时转染到HEK293T细胞。所得细胞裂解物用抗HA进行免疫纯化，并在镁的存在下用于体外激酶分析²⁺, [γ-³²P] -如上所述的ATP和His-UNC-76(Tomoda等人，1999年). 样品在10%SDS-PAGE上分离并进行放射自显影。免疫沉淀样品用抗HA作为负荷对照进行检测。用考马斯亮蓝染色法对His-tagged UNC-76进行染色，以确认载荷相等。

相对长度单位

幼虫在PBS中解剖并固定在PLP固定液中1.5 h，然后在5%和10%蔗糖中室温连续孵育30 min，20%蔗糖室温孵育1 h，30%蔗糖4℃过夜。所有蔗糖溶液均置于0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中。将固定幼虫用PBS冲洗数次，用150 mM甘氨酸在PBS中处理5分钟，用5%正常山羊血清在PBSS（PBS+0.1%皂苷）中封闭，并在4°C下与抗体在封闭缓冲液中孵育过夜。在PBS中各清洗4次5分钟后，将幼虫与二级抗体（生物素结合的抗兔或抗豚鼠IgG抗体，1:1000；Vector Laboratories）孵育2小时。然后将其固定在PBS中的0.5%戊二醛中5分钟，洗涤五次，并在反应溶液中培养（0.05%二氨基联苯胺，0.01%H₂O（运行）₂在pH 7.6的Tris-HCl缓冲液中）。使用标准技术对样本进行EM处理，如铃木和广泽（1994）.

我们感谢Troy Littleton、Hugo Bellen、Bill Saxton、Christoph Schuster、Larry Goldstein、Helmut Krämer、Noreen Reist、Bloomington Stock Center和Hybridoma Bank提供试剂；Mary Young和Roger Moore进行质谱分析；Akinao鼻子咨询；Ryan Lim、Satoki Umezawa和Yasushi Maruyama提供技术援助；安格斯·奈恩（Angus Nairn）、比尔·萨克斯顿（Bill Saxton）、吉安·加里加（Gian Garriga。T.T.感谢玛丽·贝思·哈顿的持续支持。这项工作由贝克曼创业基金向T.T。；MEXT、JSPS和筑波高级研究联盟（TARA）向K.F.T.提供的科研资助。；美国国家科学基金会授予J.G.G.#0342761。；JSPS向E.S.提供的科研拨款（C）。；NIH P41-RR01192至T.B.K.和V.J.L。；HHMI R.J.本科生研究奖学金。；H.M.生物化学和分子生物学由H.T.完成，R.F.时间推移成像由H.T.EM完成，E.S.FRET由T.B.K.完成，V.J.L.R.J.和J.G.G.贡献了重要试剂并参与了讨论。T.T.和K.F.T.设计了实验并撰写了手稿。