中心体PKCβII和pericentrin对前列腺癌生长和血管生成至关重要

材料

对于Western blot分析，针对Gαi-3（C-10）的兔抗体来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（加州圣克鲁斯），抗GAPDH抗体克隆6C5来自Advanced Immunochemical（加州长滩）。对于免疫荧光，α-微管蛋白和γ-微管素Cy3抗体来自Sigma（密苏里州圣路易斯）。用于免疫荧光的Pericentrin抗体来自Abcam（4448，Cambridge，MA）。用于Western blot分析的Pericentrin抗体（M1、4b和UM225）来自Stephen Doxsey博士（马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学）。石蜡包埋前列腺组织来自斯坦福医学院泌尿科（IRB#348）。

肽合成和给药

PKCβII选择性抑制剂（βIIV5-3）源自PKCβⅡV5区域（氨基酸645-650[QEVIRN]）(25). 对于细胞内递送，如前所述，合成肽并结合到膜透性TAT载体肽(26). 以TAT载体肽或生理盐水作为对照。肽已送达体内如前所述，使用Alzet渗透微型泵（Alzet型号2001）(27). 将肽溶解在盐水中，并以恒定速率（0.5μl/hr）给药，相当于2.4或24 mg/天/kg（3mM或30mM TAT）和3.6或36 mg/天/kg（3mM或30mMβIIV5-3-TAT）。由于以下原因，每2周更换一次泵_1/2泵中的肽（约2周）(27). 肽的输送时间长达5周。

异种移植瘤研究

6周大的雄性裸鼠从印第安纳波利斯州哈兰市购买，并安置在斯坦福大学医学中心（加利福尼亚州斯坦福）的动物护理设施中。所有小鼠均置于标准温度、湿度和定时照明条件下，并提供小鼠食物和水随意所有动物实验均按照美国国家研究委员会实验动物资源研究所编制、美国国家科学院出版社出版（1996年修订）并经斯坦福大学动物护理与使用委员会批准的《实验动物护理和使用指南》进行。在无菌PBS中，将500万PC-3肿瘤细胞皮下注射到7–8周龄雄性裸鼠的侧面(图2)或在1:1无血清培养基和Matrigel的混合物中(图3Beckton Dickinson，马萨诸塞州贝德福德）。当肿瘤达到100毫米时开始肽治疗^三大约一周后。肿瘤体积（mm^三)使用公式0.52×（宽度（cm））计算²×（长度（cm））。

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图2

在肿瘤生长的早期，内皮细胞增殖率的增加先于肿瘤细胞。（A） PC-3肿瘤细胞（5×10⁶细胞）注射s.c公司在肿瘤植入后的6周内，每周分离一次左侧和异种移植瘤。氘化水通过i.p公司每次研究前，注射（8%）和饮用水（4%）1周。（B） 使用卡尺测量肿瘤细胞注射后第1周至第6周PC-3异种移植物的肿瘤体积（平均值±SEM）。（C） 采用GC-MS分析分离的肿瘤内皮细胞（开环）和肿瘤细胞（填充环）的增殖率（每周4–7个）。使用FACS分离不同的细胞群（参见补充图1). 增殖率[即每天的部分周转率（k）]是按照前面的描述计算的(28，29). 重复方差分析用于确定曲线之间差异的显著性。双尾学生的t吨测试和方差分析用于确定差异（p<0.005，重复方差分析；#；p<0.05，Student’st吨测试）。（插入）注射肿瘤细胞后，将异种移植瘤生长4天和7天，获取肿瘤内皮细胞和肿瘤细胞，测量其增殖率。在祭祀前4天服用含氘水（n=6–10个时间点）。

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图3

PKCβII特异性抑制剂治疗可降低PC-3肿瘤的生长速度。在PC-3细胞注射一周后，将小鼠植入带有生理盐水、对照肽（TAT）或与TAT结合的βIIV5-3的渗透泵，以3.6 mg/kg/天的速度注射2周，然后在接下来的3周内注射36 mg/kg/日。在祭祀前一周内，服用含氘水（4%）。（A） 每周测量肿瘤体积（重复ANOVA，*；p<0.05，n=4-5）。在第6周切除肿瘤并称重。βII V5-3治疗组的最终肿瘤重量降低了40%，但这一差异没有达到统计学意义，两组之间的体重也没有差异。（B） 五周连续βIIV5-3治疗降低了PKCβII向肿瘤和肝脏颗粒部分的移位。分离后用Western blot分析PKCβII的活性水平。GAPDH和Gαi分别用作细胞溶质（C）和颗粒（P）组分的负荷控制。IB；免疫印迹。双尾学生的t吨试验用于确定显著性（n=3个，第页<0.05). （C） βIIV5-3处理体内结果PKC激酶活性降低在体外用抗PKCβII抗体进行免疫沉淀。如前所述，在没有添加PKC活化剂的情况下，使用组蛋白（H3）作为底物进行激酶分析(30). 将薄膜在−80C°下暴露3天。（D） 较高剂量的βIIV5-3（36 mg/kg/天，持续4周）可显著降低PC-3肿瘤生长率。重复方差分析和双尾学生t吨检验用于确定显著性（*；重复方差分析中p＜0.05，§；第页<0.05与.TAT处理和§§；第页<0.005与.TAT处理于t吨试验，n=8–9个，总体肿瘤生长率降低16%vs.60%，图3A与。3D）。（B）和（C）的其他螺栓见补充图3。

细胞增殖的测量

给动物注射4%的氘化水，并用流式细胞术分选肿瘤内皮细胞和肿瘤细胞（参考补充图1用于细胞分离），并按照之前所述准备用于GC-MS分析(28，29).

免疫荧光

使用PKC和生物素连接的鼠抗鼠CD31抗体（分别位于加州圣克鲁斯的Santa Cruz Biotech Inc和加州圣地亚哥的BD Pharmingen），对固定在O.T.C.化合物（加州托伦斯）中的新鲜冷冻切片进行双色免疫荧光。为了检测pericentrin和PKC，切片用兔抗pericentin（ab4448，Abcam，Cambridge，MA）染色，然后用PKC抗体染色。TUNEL染色使用就地细胞死亡检测试剂盒（TMR红色）符合制造商的说明（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）。裂解的caspase-3抗体来自Cell Signaling（Danvers，MA）。使用Photoshop（9.0.1版）测量CD31和TUNEL阳性区域。Hoechst 333242来自Molecular Probes（加利福尼亚州卡尔斯巴德）。免疫荧光实验装置由带有350FX相机的徕卡DMI 6000B显微镜组成（加州圣何塞JH Technologies）。

免疫印迹分析

称重冷冻肿瘤和肝脏，并添加两体积的均质缓冲液[20 mM Tris-HCl，pH 7.5，2 mM EDTA，10 mM EGTA，250 mM蔗糖，1:300蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）和1:300磷酸酶抑制剂混合物（Sigma）]。将组织均匀化，并在4°C下以100000g旋转30分钟进行分馏。上清液对应于细胞溶质部分。颗粒组分对应于包括核膜和质膜在内的其他细胞内细胞器。用1%Triton X-100将颗粒重新悬浮在均质缓冲液中，同时分析洗涤剂可溶部分和不可溶部分。如前所述，在肿瘤和肝脏样品的细胞溶质和颗粒组分中测定PKCα、βI、βII和ε的转运(26). 全细胞裂解物是指未经分馏的总匀浆。对于所有PKC检测，使用10μg全细胞裂解物、细胞溶质和颗粒组分。针对GAPDH（1:10000）和Gαi-3（1:1000）的抗体分别用作细胞溶质和颗粒部分的负荷控制。

免疫沉淀后激酶测定

Chen等人使用PKCβII对肿瘤裂解物进行免疫沉淀(19)在缺乏PKC活化剂的情况下，检测免疫沉淀物的激酶活性(30).

免疫组织化学

将载玻片中的组织切片脱蜡，并用二甲苯进行处理，使用稀释的酒精系列进行水合，然后浸入3%H中₂哦₂在蒸馏水中浸泡15分钟，以淬灭内源过氧化物酶活性。然后将切片在压力锅中在含有1mM EDTA的蒸馏水中微波加热30分钟。为了避免非特异性染色，每个切片在室温下与4%牛血清白蛋白（Qbiogene，Irvine，CA）在PBS中与0.1%吐温20（PBST）孵育30分钟。然后在室温下将切片与兔抗中心蛋白多克隆抗体（4b，稀释度：1:250）在含有4%色氨酸酪蛋白（Amresco、Solon、OH）的TBST[50mM Tris（pH7.5）、150mM NaCl和0.5%吐温20]中孵育1小时。在室温下应用HRP结合的兔免疫球蛋白二级抗体（DAKO，Carpindia，CA）20分钟。按照制造商的说明，通过催化报告沉积酪胺信号扩增（CSA II试剂盒，DAKO，Carpintia，CA）扩增信号。每个部分与荧光结合的酪胺孵育15分钟并避光。然后在室温下用HRP结合的抗荧光素抗体孵育切片15分钟。每个步骤之后，用TBST连续三次冲洗5分钟。使用的色原是3,3′-二氨基联苯胺（DAKO，Carpindia，CA）。切片用梅耶苏木精复染。

肿瘤内皮细胞增殖率高于肿瘤细胞

为了检测生长中肿瘤细胞和内皮细胞的增殖动力学，我们使用了一种直接测量这些细胞增殖率的新方法，体内(图2A、B、C). 皮下注射PC-3癌细胞（5×10⁶在注射肿瘤细胞后的6周内，每周分离出雄性裸鼠的侧腹区域中的实体肿瘤(图2A、B). 在每个时间点，在饮用水中注入氘化水1周后进行牺牲，并通过荧光激活细胞分选（FACS）分离肿瘤内皮细胞和肿瘤细胞。如前所述，通过测量这些细胞DNA中氘的量来计算每种细胞类型的增殖率(28，29).

有趣的是，在前4周内，肿瘤内皮细胞（TEC）增殖率的上升先于肿瘤细胞（TC）增殖率上升(图2C); 这两种细胞的增殖率在大约4周内以振荡模式持续变化。这些数据支持预测的肿瘤生长和血管生成之间的协调，TEC增殖和血管生成增加以满足生长中的肿瘤的代谢需求(4，34). 第4周后，肿瘤内皮细胞和肿瘤细胞增殖率似乎达到稳定状态，表明血管生成率与生长肿瘤的代谢需求相匹配(4，34). 我们进一步检查了肿瘤后注射第0-7天期间的细胞增殖动力学（n=6-10只动物，插入）。在第0-4天和第4-7天，肿瘤内皮细胞的增殖率是肿瘤细胞的几倍(图2C，insert），表明在肿瘤生长的早期，肿瘤血管生成活跃，而在此期间只有适度的肿瘤细胞增殖。这证实了血管生成在肿瘤生长的早期特别活跃，并提示了抗血管生成的治疗窗口。

PKCβII特异性抑制剂有效降低PC-3肿瘤生长率

因为我们发现PKCβII主要定位于内皮细胞，我们接下来确定其在肿瘤生长和血管生成中的作用，体内.我们用生理盐水、控制肽（TAT）植入渗透泵_47–57载体肽(35，36))或与TAT偶联的βIIV5-3（PKCβII选择性抑制剂肽）_47–57释放PKCβII抑制剂(25)进入细胞。具体而言，在注射PC-3细胞一周后，用带有生理盐水/TAT或βIIV5-3的渗透泵以3.6 mg/kg/天的速度植入小鼠2周，然后在接下来的3周内植入36 mg/kg/日。治疗两周后，βIIV5-3治疗动物的肿瘤大小有减小的趋势(图3A). 当βIIV5-3浓度在接下来的3周内从3.6 mg/kg/天增加到36 mg/kg/日时[耐受性良好的剂量(37)]βIIV5-3治疗组的肿瘤体积随着时间的推移明显缩小(图3A，重复方差分析，*；p<0.05，n=4-5个）。上一个体内研究表明，在所有组织中都观察到通过系统肽传递抑制PKC移位(26). 同样，我们发现βIIV5-3治疗降低了颗粒组分中PKCβII的水平（相对于肿瘤和其他组织中的细胞溶质组分）例如在肝脏中（βIIV5-3治疗使PKCβII易位降低了25-35%；图3B右，p<0.05，n=3个）。我们之前已经证明PKC易位的减少足以抑制其病理活动[例如., (38，39)]. 我们进一步证实了PKCβII抑制剂的选择性；持续治疗βIIV5-3不会影响肿瘤中密切相关的PKCμI和肝脏中PKCε的易位(补充图3). 使用激酶分析在体外在没有添加PKC活化剂的情况下，我们发现βIIV5-3治疗导致从含有等量蛋白质的总肿瘤裂解物中免疫沉淀的PKCβII的催化活性降低约85%(图3C)，证实治疗肿瘤中PKCβII持续受到抑制。

接下来，我们开始确认肿瘤生长抑制作用体内通过在第1周至第5周以36 mg/kg/天的较高剂量给药βIIV5-3(即。，当我们观察到最活跃的血管生成时，请参见图2C). 与较低剂量的βIIV5-3相比，这种治疗使总体肿瘤生长率降低了60%，这是根据肿瘤体积随时间的变化计算的(图3D; p<0.05，n=8–9个与。 图3A).

βIIV5-3降低肿瘤内皮细胞和肿瘤细胞的增殖率

接下来，我们通过直接测量βIIV5-3是否影响肿瘤内皮细胞的细胞分裂体内使用氘化水的细胞增殖率图2与对照小鼠相比，在第3周用βIIV5-3（3.6 mg/kg/天）持续治疗两周后，肿瘤内皮细胞（TEC）增殖率降低了40%(图4A，第页=0.008，n=8-9个）。然而，βIIV5-3持续治疗五周后（第6周），增殖率没有差异（3.6 mg/kg/天，随后36 mg/kg/日）。这些数据表明，βIIV5-3的抗血管生成作用在肿瘤生长的早期阶段更为显著，即使在较低剂量下也是如此。为了证实βIIV5-3的抗血管生成作用，在第3周和第6周的肿瘤切片上用内皮细胞标记物抗CD31抗体染色(图4B). 在第3周，与对照组相比，βIIV5-3治疗的样本中CD31阳性肿瘤血管的数量显著减少（28±11与.6±3%，图4B)，但在第6周没有（不显著，数据未显示），使用Photoshop程序进行量化（加利福尼亚州圣何塞9.0.1版）。

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图4

肽治疗后肿瘤内皮细胞（TEC）和肿瘤细胞（TC）增殖率分析。（A） 在第3周（中点）和第6周治疗结束时，分别用3.6 mg/kg/天的βIIV5-3治疗2周和36 mg/kg/日治疗剩余3周的小鼠，然后在分离后测定肿瘤内皮细胞的增殖率。在祭祀前的7天内，服用了含氘的水。双尾学生的t吨测试用于确定显著性(图4A，第页第3周时=0.008，n=8-9）。（B） ●●●●。第3周和第6周的肿瘤切片用CD31-FITC抗体染色，免疫染色强度用Photoshop定量。双尾学生的t吨测试用于确定显著性(图4B，第3周数据，*；第页<0.05). 比例尺：10μm。（C） 在第3周（中点）和第6周治疗结束时，分别处死以3.6 mg/kg/天剂量治疗2周和36 mg/kg/日剂量治疗剩余3周的小鼠，以分离和测定肿瘤细胞的增殖率。双尾学生的t吨试验用于确定显著性（图4C，第页=0.0007，第3周，n=8-9）。（D） 对第3周和第6周的肿瘤切片进行TUNEL与德克萨斯红结合染色（图4D，第6周数据，p=0.06，n=4）。TUNEL染色通过3周肿瘤样本（插入物）的裂解半胱天冬酶3染色（FITC-共轭）证实。比例尺：10μm。

βIIV5-3治疗也降低了第3周的肿瘤细胞（TC）增殖率(图4C，第页<0.001），并在第6周表现出抑制趋势(第页=0.065,图4C). 此外，与TAT或生理盐水对照组相比，第6周βIIV5-3治疗的肿瘤中TUNEL阳性细胞增加的趋势更强(图4D，​,22±1与0.8±2%，p=0.06），与第3周相比（不显著）。我们发现TUNEL阳性细胞与裂解caspase 3染色重叠(图4D，插入），进一步证实凋亡增加。这表明，在肿瘤早期，βIIV5-3治疗降低了肿瘤内皮细胞和肿瘤细胞的细胞增殖，而不是诱导细胞凋亡。

βIIV5-3治疗诱导PKCβII和中心蛋白在PC-3肿瘤中的共定位

接下来，我们着手确定βIIV5-3抑制肿瘤生长的分子基础。Newton及其合作者进行的无偏双杂交筛选表明，一种中心体蛋白pericentrin与PKCβII结合，该蛋白参与控制胞质分裂、微管组织和纺锤体形成(19).

研究表明，随着Gleason分级的增加，人类前列腺癌中的Pericentrin水平升高(23，40). 此外，pericentrin过度表达与中心体缺陷相关，中心体缺损导致染色体不稳定、微管错配、细胞核变大以及人类前列腺和其他类型癌症细胞的细胞增殖增加(23，40——43). 因此，我们假设PKCβII与中心蛋白相互作用的调节可能在我们观察到的表型中发挥作用。Pericentrin染色在正常细胞中显示为一两个点(19，23，40和中补充图2). 然而，PC-3肿瘤异种移植物的染色显示具有细长丝状结构的中心蛋白染色异常模式(图5A，左侧面板）。36 mg/kg/天的βIIV5-3治疗4周后，显著减少了异常丝状中心蛋白染色，降低了总染色强度，并导致抗中心蛋白抗体的斑点染色模式恢复(图5A，右侧面板）。通过对总肿瘤裂解物中的心室周蛋白（~220kDa）及其裂解形式（~150kDa）的蛋白质印迹分析证实了这一点(图5B). 与TAT对照组相比，βIIV5-3治疗组的中心蛋白裂解量减少了约90%(图5B，下箭头）。我们还发现，在TAT治疗的肿瘤中，延长性和丝状中心蛋白与PKCβII没有共同定位（星号，图5C，​,2,2，​,3,三，​,4),4)而在βIIV5-3治疗的肿瘤中，点状中心蛋白与PKCβII共定位（箭头所示，图5C，​,6,6, 7, 8). 通过测定中心蛋白和PKCβII之间的相互作用证实了这一点体内联合免疫沉淀分析，然后免疫沉淀的Western blot分析。使用抗PKCβII抗体从总肿瘤裂解物中免疫沉淀PKCβⅡ，并用抗中心蛋白抗体检测(图5D，上部面板，通道2和3）。我们在免疫沉淀物中检测到中心蛋白（~220kDa）及其裂解形式（~150kDa(44，45). 尽管βIIV5-3治疗组的中心蛋白总水平低于TAT治疗组(图5B)与TAT治疗的肿瘤中的免疫沉淀物相比，与PKCβII相关的中心蛋白增加了10倍(图5D，上部面板，通道2和3）。未经βIIV5-3处理的PEC原代培养物裂解液中的免疫沉淀物也用于显示正常人类细胞中PKCβII和中心蛋白的相互作用。PKCβII与中心蛋白的相互作用强于未经治疗的PC-3肿瘤（Lane 5）。

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图5

βIIV5-3治疗降低了PC-3肿瘤中的中心蛋白水平，并诱导PKCβII和中心蛋白共同定位。（A） 在36 mg/kg/天的TAT或βIIV5-3治疗4周后，使用肿瘤切片测定中心蛋白的水平。对切片进行心周蛋白（Abcam，兔多克隆Ab4448；随后是与Cy3偶联的山羊抗兔，粉红色）和细胞核（Hoechst，蓝色）染色。（B） 220和150kDa条带的水平对应于中心蛋白（箭头(22，44，45))在36 mg/kg/天的TAT或βIIV5-3治疗4周后，使用总肿瘤裂解物进行测定。（C） 对治疗4周的肿瘤进行免疫荧光染色，结果显示PKCβII和正常的圆心蛋白在βIIV5-3治疗的肿瘤中共同定位。所示为细胞核染色（面板B1和5）、PKCβII（面板B2和6，绿色）、中心蛋白（面板B3和7，红色）和合并图（面板B4和8）。箭头表示中心蛋白和PKCβII共定位（黄色），而星号表示丝状中心蛋白与PKCβⅡ不共定位。（D） 免疫沉淀法（IP）进一步证实了PKCβII与中心蛋白的相互作用。使用4b、M1和UM225周蛋白抗体的混合物对来自洗涤剂溶解的总肿瘤裂解物和使用抗PKCβII抗体的PEC培养物的免疫沉淀物进行免疫印迹（IB）(19)检测pericentrin（图5C，顶面板，通道2和3，箭头）。220kDa和150kDa带都对应于中心蛋白(22，44，45)存在于免疫沉淀物中，表明它们与PKCβII相互作用体内βIIV5-3治疗组与PKCβII的相互作用更强（与顶面板、第2通道和第3通道相比）。在阴性对照组（1号线，用IgG孵育并用珠免疫沉淀）中，出现的中心蛋白（顶面，1号线）或PKCβII（下面，1区）的数量不显著。将肿瘤的全肿瘤裂解物作为阳性对照物（第4条线），以显示中心蛋白和PKCβII条带（上下面板，第4条线上）。此外，未经βIIV5-3处理的PEC原代培养物裂解液中的免疫沉淀物用作另一个对照，以显示PKCβII和中心蛋白的相互作用（Lane 5）。

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图6

Pericentrin异常存在于肿瘤内皮细胞和人类肿瘤内皮细胞中。（A） 用TAT或βIIV5-3（36 mg/kg/天）治疗4周的小鼠的肿瘤切片进行细胞核（Hoechst）、CD31（绿色）和中心蛋白（红色）染色。比例尺：10μm。（B） 通过免疫荧光测定在PC-3条件培养基中生长的肿瘤内皮细胞（TEC）中是否存在异常的心室周和中心体缺陷。小鼠肿瘤内皮细胞在DMEM或PC-3条件培养基（培养2天的PC-3细胞培养基）中生长，并用最终浓度为1μM的TAT或βIIV5-3处理（每天添加3次，持续2天）。显示了在含有TAT的DMEM（顶部）、含有TAT（中部）和βIIV5-3（底部）的PC-3条件培养基中生长的TEC的代表性图像（3个实验的代表性）。分别对肿瘤内皮细胞进行周中心蛋白（绿色）和γ-微管蛋白（红色）染色。还显示了合并的数字（包括用Hoechst染色的细胞核）。比例尺：10μm。（C） 抗α-微管蛋白染色提示肿瘤内皮细胞中微管结构异常。与in（B）处理相同的肿瘤内皮细胞分别染色，以检测周中心蛋白（绿色）和α-微管蛋白（红色）。还显示了合并的图形（包括用Hoechst染色的细胞核）。比例尺：10μm。（D） 人前列腺癌内皮细胞中的中心蛋白水平较高。使用Gleason 3、4和5级癌症患者前列腺石蜡包埋切片测定周中心蛋白水平，并对周中心蛋白进行染色，并用苏木精进行复染。如图所示为代表性图片（n=8；左侧：良性前列腺增生旁内皮细胞上的pericentrin染色，中间：Gleason分级为3+4的肿瘤腺体旁肿瘤内皮细胞上pericentren染色，右侧：中间图的放大图）。比例尺：10μm。

这项研究得到了国家癌症研究所授予J Kim的PHS赠款CA09151的部分支持。

DMR是KAI Pharmaceuticals，Inc.的创始人，该公司计划将PKC监管机构引入该诊所。然而，本研究中描述的任何工作都不是基于公司或由公司支持的。