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EMBO J。2008年10月22日；27(20): 2691–2701.
2008年9月25日在线发布。 数字对象标识：10.1038/emboj.2008.193
预防性维修识别码：PMC2572176型
PMID：18818693

ES细胞中的DNA甲基化需要赖氨酸甲基转移酶G9a，但不需要其催化活性

凯文·B·东,1 伊琳娜·马克萨科娃,1,2 法比奥·莫恩,三 半山区分部经理梁智仁,1 鲁斯·阿帕纳,1 桑德拉李,1 杨浩（音译）,1 露西娅·兰姆,1 迪克西·L·马格尔,1,2 德克·舒贝尔,三 橘真琴,4中，5 新开洋一,4中，5和马修·洛林茨1,一
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补充资料

摘要

组蛋白H3K9甲基化是植物和丝状真菌中DNA甲基化和重复元素沉默所必需的。然而，在哺乳动物细胞中，H3K9组蛋白甲基转移酶（HMTases）Suv39h1和Suv39h2的缺失并不影响内源性逆转录病毒小鼠白血病病毒的DNA甲基化，这表明H3K8甲基化对于逆转录转座子的DNA甲基化是不必要的，或者涉及不同的HMTase。我们证明，缺乏H3K9 HMTase G9a的胚胎干细胞显示，逆转录转座子、主要卫星重复序列和富含CpG的甲基化启动子的DNA甲基化显著降低。令人惊讶的是，脱甲基逆转录转座子在G9a公司−/−细胞，并且H3K9me2仅显示适度降低，H3K9 me3或HP1α结合没有降低，表明H3K8甲基化就其本身而言不是DNA甲基化的相关触发因素。事实上，引入催化活性G9a转基因部分“挽救”了G9a公司−/−细胞。综上所述，这些观察结果表明，H3K9me3和HP1α向反转录转座子的募集独立于ES细胞中的DNA甲基化，G9a促进DNA甲基化独立于其HMTase活性。

关键词：染色质、DNA甲基化、ERV、H3K9甲基化、HP1α

引言

包括长末端重复序列（LTR）和非LTR元件在内的逆转录转座子广泛分布于高等哺乳动物的常染色隔室中(Kuff和Lueders，1988年;Medstrand公司等, 2002)，约占小鼠基因组的37%(小鼠基因组测序协会，2002年). 这些元素的一个子集具有转录能力，给宿主带来了显著的突变负荷(马克萨科娃等, 2006). 为了最大限度地减少逆转录转座的可能性，在复制周期的转录或转录后阶段发挥作用的许多途径已经进化为抑制这些寄生元件的表达。例如，DNA甲基化在哺乳动物细胞中逆转录转座子的转录沉默中具有重要作用(锂等, 1992;约德等, 1997;沃尔什等, 1998)如缺乏DNA甲基转移酶（DNMT）的小鼠胚胎中内源性逆转录病毒（ERV）的胞内A颗粒（IAP）高表达所示，Dnmt1(沃尔什等1998年). DNA甲基化在丝状真菌和植物中重复元素及其遗迹的转录沉默中也具有关键作用(戈永等, 1996;林德罗特等, 2001;周等, 2001)证实了这种表观遗传标记在抑制远缘真核生物转座因子中的重要性。

真核生物中的重复元素也以特定的共价组蛋白修饰为标志(伯恩斯坦等, 2007). 组蛋白H3尾部（H3K9）的赖氨酸9的甲基化对酵母中这些元素的沉默具有重要作用(中山岛等, 2001)、丝状真菌(Tamaru和Selker，2001年)，植物(杰克逊等, 2002)和动物(马滕斯等, 2005). 最近的全基因组研究表明，ERV在小鼠细胞中以H3K9二甲基化（H3K9me2）和/或H3K9-三甲化（H3 K9me3）标记(彼得斯等, 2003;马滕斯等, 2005;米克尔森等, 2007); 然而，负责的特定组蛋白甲基转移酶（HMTase）尚未被鉴定。

有趣的是，H3K9 HMTaseDIM-5接口是CpG甲基化所必需的神经孢子菌属(Tamaru和Selker，2001年)和H3K9 HMTase克雷普托尼特是CpNpG甲基化所必需的拟南芥(杰克逊等, 2002)，表明存在进化上保守的沉默途径，其中H3K9甲基化促进从头开始重复元素的DNA甲基化(Freitag和Selker，2005年;斯坦切娃，2005年). 然而，H3K9甲基化在哺乳动物细胞中逆转录转座子的DNA甲基化中的作用（如果有的话）尚未得到系统的解决。

SET“Suv39”亚家族中的五种HMT(S公司紫外线39，E类泽斯特的恩hancer，T型具有H3K9催化活性的rithorax）结构域蛋白，包括Suv39h1和密切相关的Suv39h2、G9a以及密切相关的GLP/EuHMTase1和SETDB1/Eset，已在哺乳动物细胞中进行了表征。基于其与SETDB1的序列相似性，第六个Suv39家族成员SETDB2/CLLD8也可能对H3K9具有特异性(马布奇等, 2001;库扎里德斯，2007年). 尽管Suv39h1和Suv39h2为双负(Suv39h1/2号−/−)胚胎干细胞H3K9me3和主要卫星重复序列DNA甲基化显著降低，IAP元件H3K9甲基化没有降低(彼得斯等, 2003;马滕斯等, 2005;米克尔森等, 2007)小鼠白血病病毒（MLV）ERV在DNA甲基化方面没有降低(莱纳茨等, 2003)在这些细胞中。综上所述，这些结果表明Suv39h1和Suv39h2在哺乳动物细胞中LTR逆转录转座子的H3K9甲基化或DNA甲基化中没有主要功能。

与Suv39h HMTases、G9a和GLP/Eu-HMTase1相反，它们形成异聚复合物体内，广泛分布于常染色室中，两者的缺失导致ES细胞中H3K9me1和H3K9 me2的急剧下降(橘树等, 2002,2005). 最近的一项分析显示，～300–400个基因在G9a公司−/−单元格(桑帕斯等, 2007)一些研究表明，G9a调节特定基因的表达和/或DNA甲基化状态(费尔德曼等，2006年;池上等, 2007). 然而，旨在确定G9a是否影响散布重复元件的表达和/或DNA甲基化状态的实验尚未报道。

在这里，我们研究了G9a和GLP在潜在活性ERV和非LTR逆转录转座子的DNA甲基化和沉默中的作用。我们发现，这些元素的DNA甲基化以及包括富含CpG启动子在内的非重复序列子集在G9a公司−/−这些细胞中Dnmt3a向反转录转座子的募集减少。然而，H3K9me3富集和HP1α结合没有改变，这表明替代的H3K9 HMTase标记ERV，H3K 9甲基化就其本身而言不足以促进这些元素的DNA甲基化。为了支持这一模型，我们表明引入两个不同的缺乏催化活性的G9a转基因G9a公司−/−细胞部分“拯救”了观察到的DNA甲基化缺陷，表明G9a促进反转录转座子的DNA甲基化度与其催化活性无关。

结果

G9a是逆转录转座子DNA甲基化所必需的

为了确定ERV的DNA甲基化是否需要G9a，从TT2野生型（wt）和G9a公司−/−ES细胞(橘树等, 2002) (补充图S1)使用甲基化敏感的限制性内切酶通过Southern印迹进行分析血红蛋白II和IAP和MLV ERV特异性探针，其中小鼠基因组中分别有～1200和～60个拷贝(图1A和B). 基因组DNA样本分离自Dnmt1型−/−(雷等, 1996),Suv39h1/2型−/−(彼得斯等, 2001)并对其来源的wt亲本ES细胞系进行平行分析。两种ERV的DNA甲基化在G9a公司−/−相对于wt控件的线。在Southern blot分析的分辨率下，甲基化的减少与观察到的Dnmt1型−/−用甲基化不敏感的异裂殖体消化ES系或TT2基因组DNA消息传递程序一、。

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MLV、IAP和LINE1反转录转座子的DNA甲基化在G9a公司−/−细胞。基因组DNA分离自G9a公司−/−,G9a公司−/−Tg、，Dnmt1型−/−,Suv39h1/2号−/−(Suv公司−/−)和wt亲本系TT2、J1和R1分别用消息传递程序I（M）或甲基化敏感限制性内切酶血红蛋白II（H）并使用特定于(一个)IAP、(B类)MLV或(C类)LINE1反转录转座子。这个G9a公司−/−线显示了这些重复元素中每一个的DNA甲基化都显著降低，而在G9a公司−/−Tg线。相比之下Suv39h1/2号−/−该品系在IAP或MLV重复序列中没有DNA甲基化缺陷。(D类,E类)在TT2上对IAP和MLV元素的5′LTR区域进行了亚硫酸氢盐分析，G9a公司−/−,G9a型−/−Tg（15-3），Dnmt1型−/−和Dnmt3a/b公司−/−细胞。对于每个测序的分子（水平条），填充的椭圆代表mCpG的存在。每组测序样本的右侧显示了每个测序分子的平均mCpG数。还显示了mCpG相对于野生型线的平均百分比（在括号中）。

为了更准确地测量这些元素的甲基化状态，使用IAP和MLV元素富含CpG-的5′LTR区域的特异性引物进行了高分辨率亚硫酸氢盐测序分析。每个测序分子的mCpG平均数在G9a公司−/−相对于wt母线的线(图1D和E)，在G9a公司−/−显示这些区域甲基化几乎完全丧失的线。潜在活性II类ERV MusD的LTR和下游区域的DNA甲基化降低(Mager和Freeman，2000年)在小鼠基因组中有～90个全长拷贝，在G9a公司−/−线路(补充图S2). 所有这三个LTR逆转录转座子在Dnmt1型−/−单元格(图1D和E;补充图S2). 与陈等(2003)，早期通过Dnmt3a/b公司−/−单元格(奥卡诺等, 1999)MLV元件的DNA甲基化缺陷比IAP元件严重得多。有趣的是，尽管IAP元素在Dnmt3a/b公司−/−比中的单元格G9a公司−/−细胞，MLV重复的情况正好相反。因此，尽管很明显G9a是小鼠ES细胞中远缘相关ERV的DNA甲基化所必需的，但去甲基化的程度与观察到的不同Dnmt1型−/−或Dnmt3a/b公司−/−细胞。相反，MLV或IAP元件的DNA甲基化在Suv39h1/2号−/−单元格(图1A和B)与之前的报告一致，该报告显示，MLV的DNA甲基化不需要Suv39h1和Suv39h2(莱纳茨等, 2003).

LINE1（L1）元件的DNA甲基化，非LTR逆转录转座子占小鼠基因组的～20%(小鼠基因组测序协会，2002年)也取决于ES细胞中Dnmt1和Dnmt3a和/或Dnmt3 b的存在(梁等, 2002). 为了确定G9a是否在这类穿插重复序列的DNA甲基化中起作用，使用跨越L1元件L1Md-A2亚家族启动子区的探针进行了Southern blot分析。L1元件的DNA甲基化的显著降低在G9a公司−/−细胞，尽管这种缺陷没有在DNMT突变株中检测到的严重(图1C). 综上所述，这些观察结果表明G9a影响ES细胞中LTR和非LTR逆转录转座子的DNA甲基化。

为了确定在ES细胞中串联重复序列的DNA甲基化是否也需要G9a，使用甲基化敏感限制酶HpyCH4IV进行了Southern blot分析，该分析使用了主要卫星重复序列的特异探针（每个细胞约70万拷贝）(补充图S3). 与之前的报告一致，该报告显示Suv39h1和Suv39h2是主要卫星重复序列甲基化所必需的(莱纳茨等, 2003)，检测到主要卫星重复序列的DNA甲基化显著降低Suv39h1/2号−/−细胞。出乎意料的是，这类重复序列的DNA甲基化也在G9a公司−/−这表明G9a也是着丝粒周围异染色质DNA甲基化所必需的。

引入G9a转基因挽救G9a中观察到的DNA甲基化缺陷−/−细胞

Dnmt3a、Dnmt2a2（胚胎干细胞中Dnmt4a的主要亚型）的再导入；陈等(2002))或Dnmt3b1到Dnmt3a/b公司−/−ES细胞恢复MLV和IAP元件的DNA甲基化(陈等, 2003)，表明从头开始DNMT能够在这些细胞中重建DNA甲基化模式。为了确定G9a的再次引入是否能够逆转DNA甲基化缺陷G9a公司−/−这些元素的甲基化状态也在G9a公司−/−稳定表达wt G9a转基因的株系(G9a公司−/−Tg（千克）) (橘树等, 2002)与内源性蛋白质水平相似(补充图S1). 引人注目的是，MLV、IAP、L1的DNA甲基化状态(图1)和麝香(补充图S2)反转录转座子和主要卫星重复序列(补充图S3)在中G9a公司−/−Tg（千克）与原始wt母系（TT2）相似，而不是G9a公司−/−直接导出它们的线。这些观察结果表明G9a公司−/−ES细胞不是一个不可逆的过程，G9a的重新引入足以在G9a缺乏的ES细胞中重建DNA甲基化。

GLP是逆转录转座子DNA甲基化所必需的

由于G9a与HMTase GLP形成复合物，并且两者都是沉积H3K9me2标记所必需的(橘树等, 2005)，我们接下来确定了反转录转座子的DNA甲基化是否也需要GLP。从wt TT2和GLP公司−/−ES细胞(橘树等, 2005)如上所述，使用IAP、MLV特异性探针通过Southern blotting进行分析(补充图S4)和L1元素（未显示数据）。细胞中所有三种元素都存在明显的DNA甲基化缺陷GLP公司−/−行，IAP元素显示出最显著的下降。此外，将wt-GLP转基因引入GLP公司−/−行（生成GLP公司−/−Tg（千克）线（请参见补充图S1;橘树等, 2005)挽救了IAP DNA甲基化缺陷并部分挽救了MLV甲基化缺陷，揭示了DNA甲基化也可以在HMTase的重新引入后重建。与这些结果一致，多营养型MLV元件的亚硫酸氢盐测序分析显示，在5′LTR中GLP公司−/−线与wt对照，以及甲基化缺陷的部分修复GLP公司−/−Tg（千克）线路(补充图S4). 因此，G9a和GLP在ES细胞中逆转录转座子的DNA甲基化中都有作用。

G9a中非重复基因组区域的DNA甲基化降低−/−细胞

为了确定这种DNA甲基化缺陷是否延伸到基因组中的非重复元件，我们进行了MeDIP(韦伯等, 2005)从TT2中提取的基因组DNA，G9a公司−/−和G9a型−/−Tg ES细胞并分析了11个单拷贝基因组区域的甲基化状态，包括9个先前在ES细胞中被甲基化的富含CpG的启动子(莫恩等, 2008) (图2A). 值得注意的是，TT2序列中所有高度甲基化的区域显示G9a公司−/−包括种系特异基因Mage-a2杂志之前显示为异常表达G9a公司−/−单元格(橘树等, 2002). 至于重复元素，DNA甲基化在G9a公司−/−Tg线。通过对Dazl和Tuba3启动子区的亚硫酸氢盐测序证实了DNA甲基化缺陷，这两个启动子区都显示G9a公司−/−线路(图2B). Dazl启动子的去甲基化程度与Dnmt1型−/−和Dnmt3a/b公司−/−ES细胞。相反，Tuba3启动子的去甲基化程度G9a公司−/−细胞与Dnmt3a/b型−/−行。因此，虽然富含CpG启动子区域的DNA甲基化也依赖于G9a，但G9a影响DNA甲基化状态的程度取决于基因组背景。

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启动子区域的DNA甲基化在G9a公司−/−细胞。(一个)MeDIP，然后对9个富含CpG的启动子区域和两个印迹控制基因座（ICR）进行定量PCR，之前显示在ES细胞中甲基化(莫恩等, 2008)在wt上进行，G9a公司−/−和G9a公司−/−输电线。IAP和MusD扩增子作为阳性对照。一个活性看家基因（Gapdh）和一个CpG-power基因间区（Interg）被作为阴性对照。显示DNA甲基化变化的条形图G9a公司−/−和G9a型−/−显示Tg ES细胞相对于wt ES细胞（设置为1）。折叠变化归一化为非甲基化控制基因（Hprt）。括号中的数字表示MeDIP相对于Hprt的富集。误差条表示至少三个独立实验的标准偏差。在G9a公司−/−TT2亲本系中甲基化水平较高的所有基因的wt系或挽救系。(B类)野生型中种系特异性Dazl和Tuba3基因的DNA甲基化状态，G9a公司−/−,Dnmt1型−/−和Dnmt3a/b公司−/−细胞经亚硫酸氢盐测序证实。显示了每个测序分子的平均mCpG数，以及相对于野生型系的平均mCpG%（括号内）。这两个启动子都显示G9a公司−/−行。

DNMT在G9a中的表达没有显著改变−/−细胞

观察到的DNA甲基化缺陷促使我们研究Dnmt1、Dnmt3a、DNMT 3b或类DNMT（Dnmt3G）在G9a公司−/−ES细胞。定量RT-PCR分析未发现这些系中任何DNMT家族成员的mRNA水平存在显著差异(图3A). 类似地，定量蛋白质印迹分析显示，Dnmt1或Dnmt3a2的表达水平相差<2倍，Dnmt3b的表达水平高出约2倍G9a公司−/−线比wt母线(图3B). 这些数据表明，在G9a公司−/−细胞不太可能是DNMT表达减少的结果。

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DNMT在中的表达G9a公司−/−细胞。(一个)从TT2 wt和G9a公司−/−通过实时定量RT-PCR测定细胞和Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt 3b和Dnmt3G的表达水平，并归一化为β-actin（RT-逆转录酶）。值表示三个独立实验中相对于野生型系的平均表达水平（±标准差）。(B类)使用定量双色荧光成像对从TT2和G9a公司−/−细胞，使用针对Dnmt1、Dnmt3a、DNMT3b和TFII-I的抗体作为内部对照。从DNMT缺陷细胞中分离的提取物用作抗体特异性的对照。标准化为TFII-I的相对蛋白质表达水平显示在每个印迹下方。

G9a减少了Dnmt3a的招募−/−胚胎干细胞

引入Dnmt3a、Dnmt2a2或Dnmt3 b1足以恢复高度去甲基化的反转录转座子的DNA甲基化Dnmt3a/b公司−/−ES细胞(陈等, 2003)，表明从头开始DNMT活性是维持逆转录转座子处于高度甲基化状态所必需的。确定DNMT招募此类人员是否受到干扰G9a公司−/−使用Dnmt1-、Dnmt3a/Dnmt2a-或Dnmt3 b特异性抗体和未修饰组蛋白H3作为内部对照进行染色质免疫沉淀（ChIP）。对于Dnmt1和Dnmt3b，使用两种不同抗体进行的ChIP实验没有得出结论性结果（数据未显示）。相反，在MLV、IAP和MusD反转录转座子的LTR区域中检测到Dnmt3a的富集显著减少G9a公司−/−线路(图4A). 因此，在G9a公司−/−细胞可至少部分归因于招募效率的降低从头开始DNMT活性。

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G9a公司−/−ES细胞在向ERV招募Dnmt3a和从头开始导入的逆转录病毒的甲基化。(一个)从TT2和G9a公司−/−使用针对Dnmt3a或未修饰组蛋白H3的非特异性IgG或抗血清进行细胞系和ChIP。使用针对MLV、IAP和MusD ERV LTR区域的特异引物进行实时PCR，数值表示为相对于所示典型实验中输入的输入沉淀百分比（±s.d.）。Dnmt3a在G9a公司−/−线相对于wt控制是显而易见的。(B类)TT2重量，G9a公司−/−，J1重量和Dnmt3a/b公司−/−(3a/b条−/−)用逆转录病毒载体MFG–GFP感染株系，并在没有选择的情况下传代。在感染后第18天分离基因组DNA，并通过亚硫酸氢盐基因组测序进行分析。

独立评估G9a缺失是否不仅损害已甲基化位点上DNA甲基化的维持，而且影响从头开始以前未甲基化DNA上的DNA甲基化，TT2 wt，G9a公司−/−，J1重量和Dnmt3a/b公司−/−用基于MLV的逆转录病毒载体MFG–GFP感染ES细胞，并在感染后第18天分析前病毒LTR的DNA甲基化状态(图4B). 不出所料，感染了Dnmt3a/b公司−/−在这个时间点，细胞几乎没有DNA甲基化。引人注目，感染G9a公司−/−细胞的DNA甲基化水平也明显低于其来源的亲本系（>2.5倍）。虽然没有在Dnmt3a/b公司−/−-缺乏细胞系，这一观察表明G9a是有效的从头开始ES细胞中的甲基化。

逆转录转座子的转录沉默不需要G9a

因为Dnmt1之前被证明是沉默胚胎中IAP元素所必需的(沃尔什等, 1998)，我们接下来确定了G9a公司−/−细胞与这些潜在活性内源性元素的异常表达有关。在wt中，MLV和LINE1元件的表达未超过背景水平，G9a公司−/−,Dnmt1型−/− 或Dnmt3a/b−/−northern印迹法测线(图5A和数据未显示）。相反，每个亚型的IAP元素（I、IΔ1和II）(Kuff和Lueders，1988年) (图5B)和MusD元素(补充图S5)在Dnmt1型−/−线比G9a公司−/−线，相对于它们派生的父线。虽然不像在Dnmt1型−/−线，IAP的异常表达也在Dnmt3a/b公司−/−RT-PCR测线(图5C). 由于G9a和DNMT缺失是在不同遗传背景的ES细胞中产生的，因此不可能将ERV表达的差异完全归因于缺失的基因。然而，结合DNA甲基化数据，这些结果表明，残留DNA甲基化水平足以使TT2中潜在的活性逆转录因子保持沉默状态G9a公司−/−或者一种替代的抑制途径对这些元素产生独立于DNA甲基化的影响。

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ERV在G9a公司−/−细胞。从TT2 wt中分离出RNA，G9a公司−/−,G9a公司−/−Tg，J1重量，Dnmt3a/b公司−/−和Dnmt1型−/−并通过northern印迹分析。从含有活性MLV逆转录病毒载体的细胞系中分离出的RNA用作阳性对照。每个印迹显示18和28s RNA负载控制。(一个)使用对MLV LTR区域特异性的探针，在任何测试的品系中都没有检测到MLV的表达。(B类)IAP元件的三个亚型（I、IΔ1和II）在Dnmt1型−/−行，但不是G9a公司−/−使用针对IAP-LTR区域的特异性探针。(C类)定量RT-PCR（+/−RT），使用针对波尔全长IAP元件区域在亲本或G9a公司−/−行，但在Dnmt1型−/−和Dnmt3a/b公司−/−线。

IAP和MusD ERV显示G9a中H3K9二甲基化减少−/−细胞，而H3K9三甲基化和HP1α绑定不受影响

一些研究小组报告，ERV和其他重复序列在小鼠ES细胞中以H3K9me2和/或H3K9 me3标记(彼得斯等, 2003;马滕斯等, 2005;米克尔森等, 2007). 因为G9a是常染色质中H3K9me2的主要来源(橘树等, 2002)，我们接下来希望确定ERV在G9a型−/−细胞。此外，由于H3K9甲基化为转录抑制蛋白HP1家族创造了一个结合位点(拉赫纳等, 2001;斯莫尔伍德等, 2007)，我们还希望确定在缺乏G9a的情况下HP1α的招募是否受到干扰。

使用TT2和TT2分离的染色质进行ChIP实验G9a公司−/−H3K9me2、H3K9 me3a、HP1α和未修饰H3的特异性细胞和抗血清显示，H3K9-me2在G9a公司−/−在H3占用率没有显著变化的情况下，IAP和MusD元件的LTR区域的线路(图6A和B). 与之前的报告一致，该报告表明H3K9me2在中心体周围隔室中减少G9a公司−/−ES细胞(大米等, 2003)，在主要的卫星重复序列中也观察到H3K9me2的约2倍减少，这表明G9a活性并不局限于常染色区，这可能解释了为什么主要的卫星重排显示DNA甲基化缺陷G9a公司−/−细胞。当我们同时调查与每个重复的多个拷贝相关的组蛋白的修饰状态时，我们无法区分在大约一半的重复中H3K9me2的完全缺失，还是在所有重复中该标记均匀减少约2倍。然而，这些观察结果表明，大量IAP和MusD反转录转座子是G9a的直接靶点。

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ERV显示H3K9二甲基化在G9a公司−/−细胞，但H3K9三甲基化或HP1α结合没有减少。TT2重量和G9a公司−/−使用对H3K9me2、H3K9 me3、HP1α、未修饰H3和非特异性IgG（IgG）具有特异性的ChIP作为对照分析ES细胞。使用IAP或MusD反转录转座子或主要卫星重复序列的特异引物进行定量实时PCR。(一个)平均富集值表示为输入沉淀的百分比（±s.d.），相对于所示的代表性实验中的输入。(B类)从三个独立实验中绘制H3K9me2和H3的平均相对富集度（±s.d.）表明，H3K9 me2在G9a公司−/−相对于父行的行(*P（P）<0.05，由学生t吨-测试），但这些元件的H3占用率没有差异。(C类)相对于R1 wt母线，Suv39h1/2号−/−(运动型多用途汽车−/−)ES细胞仅在主要的卫星重复序列中显示H3K9me3的急剧下降。

值得注意的是，在IAP或MusD逆转录转座子中未检测到H3K9me3或HP1α结合减少G9a公司−/−线路(图6A)，表明替代H3K9 HMTase负责在这些元素处沉积H3K9me3标记。虽然HMTases Suv39h1和Suv39h2是主要卫星重复的H3K9me3所必需的(彼得斯等, 2003)，它们在IAP或MusD反转录转座子的H3K9me3标记沉积中没有主要作用，因为在Suv39h1/2号−/−ES细胞(图6C). 相反，G9a的启动子区调节Mage-a2杂志H3K9me2基因在wt中显著富集，但没有G9a公司−/−单元格(橘树等, 2002;补充图S6)，表明两个品系中H3K9me3的富集水平都很低。综上所述，这些结果表明，除G9a、Suv39h1或Suv39h2外，对H3K9具有特异性的HMTase负责ERV的H3K9-三甲基化，并且该标记的沉积独立于这些元素的DNA甲基化状态。

与…对比G9a公司−/−细胞，Dnmt1型−/−当归一化为未修饰组蛋白H3时，细胞在IAP和MusD元件的LTR区域中的H3K9me2没有减少(图7)，表明G9a沉积此标记不需要Dnmt1。令人惊讶的是，跨IAP和MusD元件的LTR区的HP1α结合和H3K9me3也分别只显示出适度或没有减少，尽管这些元件在Dnmt1型−/−细胞。对这一观察最简单的解释是，每个类别中只有少量的前病毒实际上转录于Dnmt1型−/−细胞，进而耗尽H3K9me3和HP1α。或者，严重低甲基化的IAP和MusD元件可能具有转录活性，尽管存在这些抑制性标记。在这两种情况下，这些观察清楚地表明，H3K9me3和HP1α在这些元素上的结合并不依赖于密集的DNA甲基化的存在。

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MusD、IAP和主要卫星重复序列的H3K9甲基化和HP1α结合Dnmt1型−/−细胞。对J1 wt和Dnmt1型−/−使用针对H3K9me2、H3K9 me3、HP1α和未修饰H3的抗体的ES细胞。非特异性IgG用作对照。使用IAP、MusD或主要卫星重复序列的特异性引物对反向交联材料进行实时PCR，共进行三次，富集（±s.d.）表示为输入材料免疫沉淀的平均百分比，归一化为未修饰H3。IAP元素显示H3K9me3和HP1α结合在Dnmt1型−/−但H3K9me2富集没有变化。在MusD或主要卫星重复序列中未检测到任何这些特征的显著差异。

引入催化活性G9a转基因部分修复了G9a中观察到的DNA甲基化缺陷−/−细胞

ERV DNA甲基化降低的观察G9a公司−/−细胞，尽管存在高水平的残留H3K9甲基化，但考虑到K9甲基化在控制植物和丝状真菌DNA甲基化中的已知功能，这是令人惊讶的(杰克逊等, 2002;Freitag和Selker，2005年). 为了直接解决哺乳动物细胞中重复元素的DNA甲基化是否依赖于G9a的催化活性，我们利用了前面描述的观察结果，即在G9a公司−/−通过引入wt G9a转基因（参见图1).

构造编码两个G9a突变体(G9a公司−/−Tg（C1168A）和G9a公司−/−Tg（Y1120V；Y1207F）），其中每一个都在SET结构域中含有氨基酸取代，将催化活性降低到重量G9a的1%以下，但不影响编码蛋白与GLP形成复合物的能力（参见Tachibana等，本期），稳定引入G9a公司−/−行。对稳定表达每个转基因的细胞系进行的Western blot分析表明，外源性wt和突变蛋白是在预期的分子量下产生的(图8A). 此外，定量western blot分析显示GLP在wt中的表达水平相似，G9a−/− 和G9a−/−Tg系，证实G9a的表达不会显著影响其结合伙伴GLP的稳定性(橘树等, 2005) (图8B). 正如预期的那样，用IAP特异探针进行的Southern blot分析显示G9a公司−/−母系，并在G9a公司−/−Tg（wt）线(图8C). 引人注目的是，IAP元件的DNA甲基化在表达任一催化突变体的细胞中也增加了，尽管没有达到wt转基因的水平(图8C-E). MusD的DNA甲基化水平(补充图S7)和L1重复序列（数据未显示）在G9a公司−/−相对于母级的Tg（C1168A）线G9a公司−/−行。

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稳定表达无催化活性的G9a转基因足以挽救在G9a公司−/−ES细胞。这个G9a公司−/−用编码wt G9a转基因的构建物稳定转染2-3号系G9a型−/−Tg（wt），或突变G9a转基因G9a公司−/−Tg（C1168A）和G9a公司−/−Tg（Y1120V；Y1207F）。每一个后一种转基因在SET结构域中都含有氨基酸替换，从而将编码蛋白的催化活性降低到重量蛋白的1%以下。(一个)对表达每种转基因的细胞系进行的Western blot分析表明，突变蛋白以预期的分子量表达。使用TFII-I特异性抗体作为负荷控制。(B类)通过归一化相同印迹上内源性TFII-I的信号，对这些品系中GLP表达进行定量western印迹分析。(C类)从wt（TT2）中分离的基因组DNA，G9a公司−/−(2-3),G9a公司−/−Tg（重量），G9a公司−/−Tg（C1168A），G9a公司−/−Tg（Y1120V；Y1207F）和Dnmt1型−/−ES细胞用幽门螺杆菌II（H），并使用IAP特定探针进行Southern印迹。消息传递程序I（M）用作对照。(D类)使用IAP 5′LTR特异性引物对亚硫酸氢盐进行分析，证实催化活性G9a的表达部分挽救了DNA甲基化缺陷。(E类)对于（D）和（D）中所示的亚硫酸氢盐数据，显示了每个测序分子的mCpG平均数的条形图图1D. (F类)对wt（TT2）进行ChIP，G9a公司−/−(2-3),G9a公司−/−Tg（wt）和G9a公司−/−使用抗H3K9me2、Dnmt3a或未修饰H3抗血清的Tg（C1168A）系。非特异性IgG作为对照。使用IAP特异性引物对反向交联材料进行实时PCR，共进行三次，富集度（±s.d.）表示为输入材料免疫沉淀的平均百分比，归一化为未修饰H3。

重要的是，H3K9me2在G9a公司−/−Tg（C1168A）线仍明显低于TT2和G9a型−/−Tg（wt）线(图8F). 此外，DNA甲基化缺陷的修复G9a公司−/−Tg（C1168A）系伴随着Dnmt3a在IAP LTR中的招募，尽管其水平低于wt母系或G9a公司−/−用wt G9a转基因挽救的生产线(图8F). 综上所述，这些结果表明，G9a不依赖于其催化活性而促进从头开始通过增强Dnmt3a的募集来实现DNA甲基化。

讨论

我们证明G9a是小鼠ES细胞中典型LTR和非LTR逆转录转座子以及大量富含CpG启动子的DNA甲基化所必需的。然而，与植物和丝状真菌中的H3K9 HMTase不同(杰克逊等, 2002;Freitag和Selker，2005年)，G9a促进重复元素的DNA甲基化，与其催化活性无关。鉴于H3K9甲基化，G9a如何影响DNA甲基化就其本身而言似乎不是主要的诱因吗？虽然G9a的缺失可能通过间接机制影响DNA甲基化，但鉴于H3K9me2在所分析的每个基因组区域都降低，我们支持G9a–GLP发挥作用的可能性顺式促进DNA甲基化。事实上，最近有两个研究小组报告称，在体细胞中，G9a在包含PCNA的复合体中直接与Dnmt1相互作用(埃斯特维等, 2006;谢里夫等, 2007)，表明Dnmt1和G9a在复制叉处协调H3K9甲基化和维持DNA甲基化。

我们对一些重复和单拷贝基因组序列的DNA甲基化状态的调查表明G9a公司−/−ES细胞通常没有Dnmt1型−/−ES细胞。尽管如前所述，我们通过联合免疫沉淀检测到G9a和GLP之间的相互作用(橘树等, 2005)，我们无法检测到G9a和ES细胞中任何DNMT之间的相互作用（MCL和SL，未发表的数据）。另一方面，我们确实发现Dnmt3a在LTR逆转录转座子启动子区域的募集在G9a公司−/−相对于wt控件的线。

因此，尽管我们无法确认G9a是否影响ES细胞中的Dnmt1活性，但我们认为G9a至少部分通过促进从头开始DNMT活动顺式为了支持该模型，我们发现引入的基于MLV的逆转录病毒载体（在整合时未甲基化）并不有效从头开始甲基化的G9a公司−/−细胞，并显示出类似于中观察到的沉默缺陷Dnmt3a/b公司−/−感染相同病毒的ES细胞（KBD和MCL，正在准备中）。据报道，Dnmt1的维持甲基化在ES细胞中是一个低效的过程(梁等, 2002)，连续从头开始甲基化可能是保持DNA甲基化同型性所必需的。或者，一种尚未鉴定的DNA脱甲基酶的活性脱甲基可能需要进行从头开始通过Dnmt3a和/或Dnmtt3b甲基化来维持表观遗传标记的稳定水平。

有趣的是，尽管潜在活性的IAP和MusD反转录转座子显示出DNA甲基化在G9a公司−/−细胞中，这些散布的重复元素保持转录不活跃。作为G9a公司−/−细胞的残留DNA甲基化水平略高于Dnmt1型−/−ES细胞中这些元素异常表达，只有当DNA甲基化密度降至临界阈值以下时，才有可能表达潜在的活性ERV。与此模型一致，不同于Dnmt1-null小鼠，后者显示高水平的IAP表达(沃尔什等, 1998)，携带低形态Dnmt1等位基因的复合杂合小鼠表现出全基因组低甲基化，但没有检测到IAP表达(霍华德等2008年).

或者，由于H3K9me3在IAP和MusD元素上的富集和HP1α结合在G9a公司−/−或Dnmt1型−/−细胞中，一种替代的抑制途径可能使绝大多数ERV保持沉默状态，与DNA甲基化无关。我们的观察清楚地表明，除G9a、GLP、Suv39h1或Suv39h2外，对H3K9具有特异性的HMTase标记ES细胞中的LTR逆转录转座子，留下SETDB1，它显示了对H3K 9的二甲基和三甲基HMTase活性在体外和体内(王等, 2003)或密切相关的SETDB2，作为HMTases的Suv39家族中该活动的其余候选。

鉴于有大量文献证明逆转录转座对基因组完整性的有害影响，DNA甲基化诱导的沉默途径的存在可能有助于在DNA甲基化水平相对较低的胚胎发育阶段将前病毒表达降至最低，例如受精后或在发育中的生殖系中。有趣的是，Piwi蛋白Mili的缺失导致L1和IAP ERV的去表达以及L1元件DNA甲基化的丢失(阿拉文等, 2007)揭示了由生殖系中转座元件产生的Piwi-interacting RNA（piRNAs）需要保持这些元件处于静默状态。这种piRNAs可能在将H3K9 HMTase活性靶向同源重复元件方面具有功能从头开始这些元素的DNA甲基化。

我们表明，G9a不仅是ES细胞中重复元件的DNA甲基化所必需的，而且也是ES细胞中大量基因的富含CpG启动子区域的DNA甲基化所必需的。这些结果与Tachibana及其同事报告的结果一致（参见Tachibane的随附论文等)，并表明除了H3K9me2标记的沉积外，G9a–GLP复合物可能对ES细胞中的DNA甲基化同源性产生全基因组影响。由于GLP在原始生殖细胞中表达下调，与这些细胞中全基因组DNA去甲基化一致(塞基等, 2005,2007)G9a–GLP异源复合物可能在DNA甲基化的程序性变化中起作用，这种程序性变化不仅发生在受精后，也发生在发育中的生殖系中。

材料和方法

细胞系

J1重量（129S4/SvJae），Dnmt1型信用证（Dnmt1−/−) (雷等, 1996)、Dnmt3a和Dnmt2b双负(Dnmt3a/b公司−/−) (奥卡诺等, 1999)，TT2重量（c57BL/6xCBA），G9a公司−/−（克隆2-3和22-10），G9a公司−/−Tg（千克）（克隆15-3）(橘树等, 2002),GLP公司−/−,GLP公司−/−Tg（千克）(橘树等, 2005),G9a型−/−Tg（重量），G9a公司−/−Tg（C1168A）（克隆G4），G9a公司−/−Tg（Y1120V；Y1207F）（克隆G7）、R1 wt（129X1/SvJ×129S1）和Suv39h1和Suv39h2双阴性(Suv39h1/2号−/−) (彼得斯等, 2001)ES细胞在添加15%FBS（HyClone）、20 mM HEPES、0.1 mM非必需氨基酸、0.1 mM-2-巯基乙醇、100 U/ml青霉素、0.05 mM链霉素、白血病抑制因子和2 mM谷氨酰胺的DMEM中每48–72小时传代一次。

亚硫酸氢盐测序和MeDIP分析

如前所述，使用EZ DNA甲基化金试剂盒（Zymo Research）对基因组DNA进行亚硫酸钠转化(阿帕纳等, 2007). MeDIP的实施如前所述(韦伯等, 2007). 详细协议见补充数据.

Northern和Southern印迹分析

采用标准方法进行Southern印迹分析、限制性消化、膜转移和DNA探针的制备。详细协议见补充数据.

前病毒mRNA水平的量化

根据制造商的方案，使用Tri试剂（Sigma）分离RNA。在存在或不存在逆转录酶的情况下，使用RevertAid H Minus试剂盒（发酵剂）对经DNA处理的RNA进行第一链cDNA合成。使用MLV-、IAP-和MusD-特异引物或β-肌动蛋白特异引物作为内部对照进行定量RT-PCR（所有引物序列列于补充表1)，在Opticon 2热循环仪（Bio-Rad）上用EvaGreen染料（Biotium）进行。相对表达水平通过归一化为β-肌动蛋白基因。

抗体和ChIP实验

组蛋白的ChIP(阿帕纳等, 2007)和非组蛋白(奥金等, 2007)按照说明进行。有关详细信息，请参阅补充数据.

蛋白质印迹分析

按照说明进行核提取(橘树等, 2002). 使用奥德赛红外成像系统（LI-COR Biosciences）进行蛋白质印迹分析，如补充数据.

补充材料

补充数据

单击此处查看。（130万，pdf）

致谢

我们感谢En Li博士Dnmt1型−/−和Dnmt3a/b型−/−细胞系，Thomas Jenuwein博士Suv39h1/2号−/−ES细胞系和Stephen Smale博士检测HP1特异性抗体以及UBC流式细胞术和核酸蛋白服务设施。我们感谢Mark Groudine、James Ellis、Carolyn Brown和Jacob Hodgson对文章的评论。这项研究得到了CIHR向MCL提供的77805笔赠款、向DLM提供的10825笔赠款以及日本文部科学省向MT和YS提供的援助赠款的支持。MCL是迈克尔·史密斯健康研究基金会的学者。DS实验室的研究得到了诺华研究基金会和欧盟的支持（LSHG-CT-2004-503433和LSHG-CT 2006-037415）。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团