猿猴免疫缺陷病毒（SIV）在其自然宿主中高效复制但不会引起AIDS样症状的发现引发了人们的极大兴趣。人们认为，对这一现象的更好理解可能会导致开发针对人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染的新型免疫疗法。例如，煤烟白眉猴感染SIV(白眉猴)与HIV-1感染的病理学相比，具有良性的临床病程(23). 对这一发现的可能解释进行了深入调查。
与HIV-1感染患者一样，粘膜CD4严重耗竭+在急性感染期间，在煤烟白眉中观察到T细胞(8)但这种急性耗竭不足以诱发AIDS样病理(15). 观察到的自然感染SIV的灰白眉猴的相对艾滋病抵抗力似乎主要独立于病毒特异性CD8+T细胞反应，即瞬时单克隆抗体（MAb）诱导受感染的灰白眉猴体内细胞毒性CD8 T细胞的耗竭，只导致血浆病毒血症水平的微小变化(2). 此外，与艾滋病毒感染者相比，感染SIV的白眉猴中SIV特异性CD8 T细胞反应的幅度显著降低(7). 然而，受感染的灰白眉猴T细胞中细胞周期控制不受干扰可能与抗病表型有关(17). 一般来说，感染SIV的灰白眉猴表现出较低的免疫激活水平和旁观者T细胞凋亡(6,22,24).
关于黑猩猩感染SIV的情况知之甚少(黑猩猩) (19). 然而，最近的一篇文章提出唾液酸识别免疫球蛋白（Ig）样凝集素（Siglec）分子的表达在控制SIV感染免疫反应中的作用，从而为黑猩猩如何逃避HIV-1感染患者的免疫过度刺激提供了一个有趣的可能解释。该报告发现，与人类T细胞相比，黑猩猩T细胞表达高水平的Siglec超家族成员，这些成员通常参与天然免疫细胞激活的下调(5,28)并被推理为反过来导致适应性免疫反应的下调。该研究提供了一些功能性证据，证明Siglecs，尤其是Siglec-5，可以通过T细胞受体（TCR）/CD3途径控制黑猩猩T细胞激活的程度(16). 在实验环境中，如在上述研究中，在抗CD28抗体的协同刺激下用抗CD3激活T细胞被认为是抗原提呈细胞（APC）刺激抗原特异性T细胞的良好生理相关性(20,21). 由于之前的一系列研究记录了不同抗CD3单克隆抗体之间的刺激机制和程度的差异(27)，我们重新审视了上述研究，以确定Siglec表达谱的差异是否真的能够解释观察到的人类与黑猩猩T细胞对TCR/CD3刺激反应的差异，或者UCHT1最佳诱导黑猩猩T淋巴细胞活化的能力降低是否可能，与所用抗CD3单克隆抗体的表位特异性或同型有关。
我们在此证明，先前报道的人类和黑猩猩T细胞对抗CD3-MAb刺激的T细胞活化差异不太可能是影响抗CD3-MAb结合的蛋白质序列差异的函数，也不太可能是由其他分子如Siglecs控制的，但主要可归因于分析中使用的抗CD3单克隆抗体的同型。我们的研究进一步表明，未来通过TCR/CD3途径激活黑猩猩T细胞的研究必须首先建立CD3介导的T细胞激活的相关实验模型，该模型将与现有的人类T细胞激活模型相比较。
材料和方法
细胞培养。
在获得捐赠者的知情同意后，从正常成年志愿者的肝素化血液中提取人外周血单个核细胞（PBMC）。黑猩猩的血液样本是在埃默里大学（佐治亚州亚特兰大）耶基斯国家灵长类动物研究中心采集的。这些研究是耶基斯/埃默里机构动物护理和使用委员会批准的方案的一部分。通过Ficoll-Hypaque梯度离心获得PBMC。所有细胞在添加2 mM的RPMI 1640培养基中培养我-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10%热灭活胎牛血清，加入30 U/ml重组人白细胞介素-2（加州帕洛阿尔托罗氏科学公司）。
抗体和其他试剂。
所有抗CD3和抗CD28单克隆抗体（来自Pharmingen的克隆UCHT1[IgG1]和HIT3a[IgG2a]；来自加利福尼亚州圣克鲁斯的克隆BB11[IgG1]和SP34[IgG3]）都是商业购买的，但抗CD3单克隆抗体OKT3（IgG2a同型）除外，其来源于OKT3-杂交瘤（ATCC）的细胞培养上清液。使用RapidQuant IgG分析（GUAVA Technologies）测定上清液中的抗体浓度。山羊抗鼠IgG珠取自Miltenyi，Inc（Auburn，CA）。植物血凝素-L（PHA-L）从西格玛（密苏里州圣路易斯）获得。细胞膜标记染料PKH26来自Sigma，PBMC的染色根据制造商的说明进行。重组人白细胞介素-2从R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州）获得。增强型绿色荧光蛋白（GFP）报告病毒HIV-1 NL-ENG1已在其他地方进行了描述(10,11).
使用EasyCyte流式细胞仪（GUAVA，Hayward，CA）进行流式细胞术分析。在黄色荧光通道中记录到PKH26荧光。使用CellQuestPro软件（加州圣何塞Becton&Dickinson）进行数据分析。
计算突变和侧链重组。
基因序列如下：人类CD3ɛ（NCBI GeneID916；登录号CAA27516），黑猩猩CD3Ɠ；OKT3 Fab-human CD3ɛ复合物（蛋白质数据库标识符[PDB-ID]1SY6）和UCHT1 Fab-human-CD3 \603；复合物（PDB-ID-1XIW）。为了预测这两种复合物由于G47S残基突变引起的结构变化，我们模拟了柔性蛋白质骨架上的侧链构象变化。我们使用ROSETTA++对骨架位移和与骨架相关的侧链转子异构体进行优化。ROSETTA++是一个用于预测和设计蛋白质结构、蛋白质折叠机制和蛋白质相互作用的软件套件(25). 评分函数包括范德华和溶剂化相互作用、氢键、残渣对统计和旋转体概率。所有侧链原子都得到了充分的表示，同时对主链位移和侧链构象进行了优化。已知抗体-抗原复合物的抗体结合子序列的比对被纳入对接，以丰富可能的互补性决定区域环方向。
结果和讨论
抗CD3单克隆抗体激活黑猩猩T细胞。
包括黑猩猩在内的非洲SIV自然宿主SIV感染与人类HIV-1感染之间在体内病理结果的深刻差异被认为是我们理解HIV-1病毒感染期间超免疫激活如何可能成为治疗靶点以改善疾病的关键之一结果。
在体内，T细胞的激活是由TCR/CD3复合物的抗原特异性刺激诱导的，随后是共刺激分子的激活，最重要的是CD28。CD28连接后细胞内途径的激活通常由APC上表达的B7.1（CD80）和B7.2（CD86）分子提供。在实验环境中，T细胞与抗CD3和抗CD28抗体的共刺激通常被认为是APC刺激抗原特异性T细胞的良好生理相关性(20,21). 在最近的一份出版物中，Nguyen等人(16)据报道，抗CD3单克隆抗体UCHT1是针对人CD3提出来的，并且先前证明可以识别与CD3δ或CD3γ链复合的CD3ɛ链(1,9)，在与抗CD28单克隆抗体共刺激的情况下，大多未能激活黑猩猩T细胞。黑猩猩CD3链与人CD3链的同源性为94.2%，与人CD3链一样被UCHT1识别，这可以通过流式细胞术分析证明。UCHT1不能激活黑猩猩T细胞是因为黑猩猩T淋巴细胞表达了一定数量的Siglecs（Siglec-3、-5、-7和-9的表达），而不是人类T细胞。有趣的是，该研究发现，Siglec-5被其对应的单克隆抗体连接到黑猩猩T细胞上，导致了Siglec-5的抗体介导的内化，从而允许部分UCHT1介导的T细胞激活。然而，这些研究忽视了CD3结扎本质的潜在作用，这可能会影响实验结果。这可能是相关的，因为（i）以前的出版物表明，各种抗CD3单克隆抗体能够激活甚至具有不同结果的人类T细胞(27)（ii）黑猩猩CD3ɛ链有Gly/Ser47交换，据报道Gly47参与人类CD3ɥ的UCHT1结合(1,9). 因此，我们研究了黑猩猩T细胞对UCHT1激活的顽抗性是否仅次于Siglec谱的功能，或者可以用这些研究中使用的抗CD3单克隆抗体的特定克隆来解释。
为此，我们首先用抗CD3单克隆抗体UCHT1或OKT3刺激五只黑猩猩的PBMC，无论是否存在共刺激抗CD28单克隆抗体（克隆CD28.2）。对照组包括用相同抗体组合的两名健康人捐赠者的PBMC体外刺激，并行进行。然后，通过使用流式细胞术分析确定正向散射（[FSC]细胞大小）与侧向散射（[SSC]细胞粒度）剖面，将T细胞群的激活作为细胞大小和粒度的增加进行测量，这通常与T细胞激活有关。使用膜染色PKH26测定T细胞群的增殖。这些实验的结果如图所示。.
用抗CD3单克隆抗体激活黑猩猩PBMC。用0.3μg/ml的抗CD3单克隆抗体（OKT3，同型IgG2a；UCHT1，同型gG1），1μg/ml抗CD28单克隆抗体，或相同浓度的抗CD3/CD28单抗组合刺激来自两名人类供体和五只黑猩猩的PBMC。出于控制目的，一些细胞未受刺激。（A） 然后使用流式细胞仪分析FSC/SSC模式（细胞大小/细胞粒度）的增加来测定T细胞的活化。静止细胞位于R1，而活化细胞位于R2。根据FSC/SSC模式的变化以及基于PKH26染色的活化细胞增殖频率，绘制了人类供体（分别为B和D）和黑猩猩（分别为C和E）的细胞活化水平。每个符号表示不同的捐赠者。
正如预期的那样，大多数（>90%）人类T细胞在单独使用抗CD3单克隆抗体或联合使用抗CD3/CD28单克隆抗体刺激后体积增大（图。). 在活化的人类T细胞群中，>90%的人对活化和增殖有反应（图。). 与抗CD28单克隆抗体共刺激和交联并没有引起对人类T细胞观察到的效果的可检测增强（数据未显示）。如前所述，黑猩猩T细胞对克隆UCHT1抗CD3单克隆抗体的刺激反应不佳（图。). UCHT1未能诱导黑猩猩T细胞的最佳刺激并不取决于抗CD3单克隆抗体的剂量或动力学（数据未显示）。添加抗CD28单克隆抗体以提供与抗CD3单克隆抗体的协同刺激，未能挽救细胞激活。然而，单独或联合使用克隆OKT3抗CD3单克隆抗体或OKT3/CD28.2单克隆抗体刺激黑猩猩T细胞激活，尽管在这种OKT3-浓度（0.3μg/ml）下激活的效率略低于观察到的人类T细胞（图。).
抗CD3单克隆抗体刺激后黑猩猩T细胞对HIV-1/SIVcpz感染的敏感性。
接下来，我们研究了通过使用增强型GFP HIV-1报告病毒感染来自两名人类供体和三只黑猩猩的活化T细胞，可实现的细胞激活水平是否与可实现的感染水平相对应(10,11). 正如预期的那样，这两种刺激条件允许容易检测到人类T细胞感染报告病毒，捐赠者之间可达到的感染水平不同。相反，尽管UCHT1刺激与其无法提供最佳激活相一致，但不允许黑猩猩PBMC与报告病毒发生相关感染，而将黑猩猩T细胞与OKT3单克隆抗体孵育后，黑猩猩PBMCs的感染水平可变但易于检测。对抗CD3单克隆抗体的滴定表明，UCHT1未能促进HIV-1感染不是所用单克隆抗体浓度的函数（图。). PHA-L刺激使这两种细胞类型都容易感染，但同样，人类T细胞比黑猩猩T细胞更容易感染。黑猩猩T细胞敏感性的降低可以用T细胞激活水平的略微降低来解释。然而，我们也考虑了先前报道的CD8的非细胞溶性抗HIV-1活性的可能性+T细胞在这两个物种中可以发育到不同的程度，并可以解释人类和黑猩猩T细胞在OKT3刺激后HIV-1复制中的差异(14,29,30). 为了验证这一观点，我们比较了HIV-1HxB2毒株在未分级和CD8中复制的能力+OKT3刺激后，三名人类捐赠者和三只黑猩猩的T细胞缺失PBMC。有趣的是，去除CD8+黑猩猩PBMC培养物中的T细胞补偿了HIV-1复制水平的大部分差异。使用HIV-1 TYBE菌株的实验产生了类似的结果（数据未显示）(18,31). 因此，在人类和黑猩猩来源的未分化PBMC培养物中观察到的HIV-1复制差异不仅是刺激水平的函数，还受到CD8所产生的比例较高的非细胞溶解效应的极大影响+黑猩猩T细胞。
抗CD3单克隆抗体体外刺激后人类和黑猩猩T细胞对HIV-1感染的敏感性。用不同浓度的抗CD3单克隆抗体UCHT1（A）、抗CD3单克隆抗体OKT3（B）和PHA-L（C）刺激来自两名人类供体和三只黑猩猩的PBMCS，并在感染表达GFP的HIV-1报告病毒2天后进行刺激。第4天，HIV-1感染水平以GFP阳性细胞的百分比测定。（D） 未分馏（Unfract）和CD8+用OKT3刺激来自三名人类供体和三只黑猩猩的T细胞缺失的PBMC，并感染HIV-1 HxB2。在感染后第7天采集培养上清，并进行HIV-1 Gag p24酶联免疫吸附试验。直方图表示三个供体的平均p24浓度±标准偏差。嗯，人类；cpz，黑猩猩。
OKT3/CD28.2刺激的人和黑猩猩PBMC也易感染HIV-1 SG3（X4病毒）和SIVcpz GAB2（X4毒），但与当前文献一致，刺激并没有使黑猩猩PBMCs易感染R5型HIV-1（YU2）（数据未显示）(4,19).
总之，这些发现表明，黑猩猩T细胞的体外激活（通过TCR/CD3途径介导）并不是由Siglecs等分子控制的(16)但可能是抗体亲和力或抗体同型的函数（对于OKT3，IgG2a；对于UCHT1，IgG1）。
抗CD3单克隆抗体同型决定了刺激黑猩猩T细胞的能力。
我们的初步结果表明，有两种可能性可以解释UCHT1无法最佳激活黑猩猩T细胞：（i）黑猩猩CD3ɛ链中的Gly-47/Ser-47变化优先影响UCHT1的亲和力，导致UCHT1未能触发诱导T细胞活化所需的CD3ɛ/CD3γ或CD3ɥ/CD3δ异二聚体的构象变化；（ii）抗CD3单克隆抗体的刺激具有同型依赖性，表明两个物种之间的Fc受体谱存在差异。
UCHT1和OKT3均识别CD3ɛ链中的免疫显性表位，该表位与CD3δ或CD3γ异二聚体的形成有关。这两种抗体的相互作用点是基于晶体结构来描述的(1,9). 图展示了人类和黑猩猩CD3ɛ序列的氨基酸比对。相对于之前发表的人类CD3ɛ与UCHT1或OKT3的结晶实验中使用的氨基酸序列，黑猩猩CD3ɥ在47位有Gly/Ser变化，据报道Gly47参与UCHT1和OKT_3的结合(1,9). 因此，这种氨基酸变化可能导致MAb亲和力下降，导致MAb尽管结合，但无法诱导构象变化。为了研究这种可能性，我们利用之前发表的人类CD3的晶体结构和Fab片段作为模板，模拟了黑猩猩CD3链与相应Fab片段的相互作用(1,9).
UCHT1/CD3ɛ链复合体或OKT3/CD3 \603；链复合体中的物种特定差异。（A） 人类（hum）和黑猩猩（cpz）CD3链的氨基酸序列比对。部分序列代表了先前发表的晶体结构中显示的序列，该序列有助于人类CD3与抗CD3单克隆抗体OKT3和UCHT1的相互作用。箭头表示黑猩猩CD3ɛ中Gly/Ser-47的变化（残留物以粗体显示）。在底部序列中，带有UCHT1的CD3接触残留物以粗体打印，而带有OKT3的CD3触点残留物则以下划线显示。为了预测这两种复合物因G47S残基突变而引起的结构变化，我们利用ROSETTA++对柔性蛋白质骨架上的侧链构象变化进行了建模，以优化骨架位移和依赖骨架的侧链旋转异构体构象。（B） OKT3/CD3复合物中G47S交换引起的预测构象变化。（C） UCHT1/CD3复合物中G47S交换引起的预测构象变化。
在OKT3-CD3相互作用的原始晶体结构（PDB ID 1SY6）中，CD3ɛG47通过以下标准与Fab残基S54和R55接触：如果至少有一个非氢原子对彼此相距4º，则两个侧链接触，这基本上代表了施主和受体之间的氢结合截止。在具有单个突变G47S的复合物的重新包装模型中，两个接触都丢失了（图。).
在UCHT1-CD3相互作用的原始晶体结构（PDB ID 1XIW）中，G47残基与三个酪氨酸Fab残基（Y54、Y101和Y102）接触（图。，左）。在单氨基酸改变为G47S的复合物的重新包装模型中，与Y54失去接触（图。，右侧）。然而，黑猩猩CD3ɛ链和UCHT1片段之间预测的大多数相互作用不受Gly/Ser-47交换的影响。因此，虽然抗CD3单克隆抗体OKT3和UCHT1的结合可能受到黑猩猩CD3第47位Gly/Ser变化的影响，但亲和力的总体降低可能相对较低，因此不太可能解释UCHT1未能最佳触发黑猩猩T细胞激活。
因此，我们最终研究了抗体同型的差异是UCHT1（IgG1）或OKT3（IgG2a）激活黑猩猩T细胞能力差异的原因。为此，我们用五种抗CD3抗体（1μg/ml）刺激了三名人类捐赠者和八只黑猩猩的PBMC，这五种抗体代表同型IgG1（MAbs UCHT1和B-B11）、IgG2a（OKT3和HIT3a）和IgG3（SP34）。在实验中，将抗体添加到PBMC中并保存在培养基中。在向PBMC中添加抗CD3单克隆抗体一小时后，取每种培养物中的一等分PBMC，并测定单克隆抗体结合水平。所有抗体均能识别两种细胞上CD3的表达，且效率相似（数据未显示）。然后将T细胞激活确定为FSC/SSC剖面的变化。图中显示了一个代表性流式细胞术实验的结果，该实验描述了一只黑猩猩的T细胞对各种抗CD3单克隆抗体激活的反应。八只黑猩猩的细胞对抗体介导的T细胞激活的反应总结如图所示。结果表明，虽然IgG1同型抗CD3单克隆抗体刺激人类T细胞，但它们不能在黑猩猩T细胞中提供T细胞激活。IgG2a同种型的抗CD3单克隆抗体以物种独立的方式提供T细胞活化，这强烈表明先前报道的黑猩猩T细胞未能对抗CD3单克隆抗体介导的刺激做出最佳反应主要是所使用的抗CD3单克隆抗体同种型的功能。
抗CD3单克隆抗体介导的黑猩猩体外T细胞激活依赖于单克隆抗体同型。用24孔板刺激来自三名人类供体（数据未显示）和八只黑猩猩的PBMC，板上有一组不同类型的抗CD3单克隆抗体（单克隆抗体浓度，1.0μg/ml；细胞密度，1×106细胞/ml）。（A） 随着FSC/SSC模式的增加，通过流式细胞术分析定量T细胞活化。（B） 八只受试动物对所示抗CD3单克隆抗体刺激的T细胞激活水平总结。
这些发现并不完全令人惊讶，因为之前的一系列报告已经证明，Fc受体谱可能是小鼠源性抗CD3单克隆抗体刺激潜力的关键决定因素，尽管单克隆抗体识别相同的表位区域，甚至具有相同的表表位识别，并且只有不同的Fc结构域(三,12,13). 虽然对黑猩猩Fc受体的表达谱知之甚少，但人类和黑猩猩Fc受体的蛋白质序列存在一些差异。这两个物种的低亲和力Fc-gamma-R2A和-R2B序列（分别为NP_001009077和XP_001153863）在之前描述的参与IgG结合的部分中是相同的。然而，黑猩猩高亲和力Fc-gamma-R1（CD64）在B/C环中有一个L114P替换，在F/G环结构域附近有一个R159H替换，这些区域据报道与IgG结合有关(26). 这些氨基酸交换可能足以解释与IgG1单克隆抗体的亲和力差异，并可以解释观察到的IgG1-抗CD3单克隆抗体无法最佳刺激黑猩猩T细胞。
虽然我们可以清楚地证明，使用IgG2a抗CD3单克隆抗体通过CD3途径刺激黑猩猩T细胞是可能的，但黑猩猩T淋巴细胞最佳激活的体外培养条件仍有待确定（图。和). 在这方面，应该注意的是，与人类相比，非人类灵长类动物的血液样本大多（如果不总是）是在束缚和麻醉后获得的，这可能会促进内源性类固醇的释放，而已知内源性类黄酮会影响免疫功能的研究。无论如何，Siglecs是否真的在限制黑猩猩T细胞活化方面发挥了作用，从而导致SIV的发病机制需要重新评估(16).
总之，我们的数据提供了关于黑猩猩和人类T细胞最佳激活要求差异的见解，这可能会影响黑猩猩自然SIV感染和HIV-1感染之间临床结果的差异。然而，在分子水平上研究这些差异的关键是建立一个相关的体外黑猩猩T细胞刺激模型。我们的结果表明，这种模型目前尚不可用。
