推测MicroRNA对S1结肠癌细胞株转录稳定性和蛋白翻译的调控及其mRNA 3′非翻译区ABCG2表达^{▿ †}

RNA降解分析。

将父母S1和耐药S1MI80细胞在10 cm组织培养皿中培养至亚融合状态，然后将放线菌素D（西格玛，圣路易斯，密苏里州）添加至最终浓度5μg/ml，以阻止从头开始的RNA合成。放线菌素D处理后4、8和16小时，收集细胞，并用如下所述的半定量逆转录-PCR（RT-PCR）定量ABCG2 mRNA。作为对照，还监测c-myc和甘油醛-3-磷酸（GAPDH）mRNA水平。对于转染pcDNA3.1载体的HEK293细胞，在转染48小时后添加放线菌素D，然后在相同的时间点采集细胞。为了标准化目的，评估共转染的绿色荧光蛋白（GFP）（pEGFP-C1；BD Bioscience Clontech）的表达水平。记录的值是与添加放线菌素D之前的量相比，mRNA的剩余百分比。所有实验重复三次。

半定量RT-PCR。

使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）分离总RNA。使用商用cDNA合成试剂盒（马萨诸塞州伦道夫Bioline）逆转录RNA（1μg）。cDNA扩增是使用针对ABCG2公司（5′-CAATGGGATCATAAACCTG-3′[向前]和5′-GAGGCTGATAGAA-3′[向后]）和GAPDH公司（5′ACCCAGTCACATGCACATCATCAC-3′[正向]和5′TCCACCACCTGTGCTGTA-3′[反向]）。引物的设计是这样的，它们的内含子跨度为3到6英寸ABCG2公司和内含子8GAPDH公司GAPDH cDNA的扩增作为内部对照。PCR扩增在55°C的退火温度下进行28个周期（ABCG2）或25个周期（GAPDH），分别产生584-或330-bp产物。当cDNA合成混合物中省略逆转录酶时，未获得PCR产物。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中溶解并用溴化乙锭染色。采集凝胶图像，并使用APP_Collage PPC4.0分析软件程序量化条带强度。

实时PCR。

对于mRNA降解试验，根据制造商的建议，使用LightCycler Fast Start DNA Master Taqman试剂盒（Universal ProbeLibrary；印第安纳波利斯罗氏分子生物化学公司）和LightCyscler 2.0系统，通过实时定量PCR方法重复测量ABCG2 mRNA水平。使用Roche UPL定制设计服务为ABCG2和GAPDH设计引物（用于归一化），并选择合适的荧光探针（分别为ABCG1和GAPDH的探针56和60）。用于分析ABCG2和GAPDH表达的引物序列如下：ABCG2正向，5′-TGGCTTAGACTCAAGCACAGC-3′；ABCG2反面，5′-TCGTCCTGCTTAGACATCC-3′；GAPDH正向，5′-AGCCACATCGCTCAGACC-3′；和GAPDH反向，5′-GCCAATACACACAAATCC-3′。相对ABCG2和GADPH表达水平通过读取MCF-7细胞cDNA五倍四倍连续稀释产生的标准曲线来确定，该曲线绘制了阈值周期与模板的对数输入量。

使用LightCycler Fast Start DNA Master Plus Sybr green I试剂盒（Roche Applied Science），通过定量实时RT-PCR重复分析ABCG2 3′UTR的相对稳定性。使用LightCycler系统在90°C下进行35个周期的定量PCR，持续10 s，引物特定退火温度持续10 s和72°C持续18 s。每个周期结束后，将温度升高至引物各自的采集温度，并在530 nm（Light Cycler荧光通道F1）处测量与双链DNA结合的Sybr绿的荧光。样品荧光超过背景荧光的循环数由LightCycler软件（3.5版）使用二阶导数方法确定。扩增阶段后进行熔融曲线分析，以消除非特异性扩增或引物二聚体形成的可能性。

3′RACE分析。

使用Trizol试剂（Invitrogen）从亲本S1和耐药S1MI80细胞中提取总RNA。根据制造商的协议，使用3′快速扩增cDNA末端（3′RACE）cDNA扩增试剂盒（Bioline）进行第一链cDNA合成。3′RACE使用适配器底漆（AP）（表​（表1；1; 参见补充材料中的图S3A），一个寡核苷酸（dT）引物，在其5′端具有定义的（非dT）序列，用于启动第一链cDNA合成。AP的寡核苷酸（dT）部分与mRNA poly（A）尾部杂交以引发RT反应。因此，AP 5′端的确定序列被纳入所有合成的cDNA分子中。然后用Bio-X-ACT长DNA聚合酶（Bioline）对第一链cDNA进行PCR。外部反向底漆（表​（表1；1; 参见补充材料中的图S3A），然后可以与与已知ABCG2序列结合的上游引物结合使用，以从上游引物特异性扩增到mRNA多腺苷酸化位点。底漆ABCG2 ex16（表​（表1；1; 参见补充材料中的图S3A）被用作我们研究中报告的3′RACE反应的上游引物。为了提高第一次PCR的特异性，使用嵌套的N1正向引物、外反向引物和第一次PCR混合物作为DNA模板进行嵌套PCR（PCR 1）。将PCR中的DNA作为混合物亚克隆到pCR2.1载体（Invitrogen）中。然后由NCI实验致癌实验室的DNA测序核心设施对多个克隆进行测序。所有序列与报告的mRNA序列进行比对ABCG2公司（GenBank登录号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_004827”，“term_id”：“1519311581”，“term_text”：“NM_004828”}}纳米_004827). 为了证实具有长3′UTR的克隆的RACE发现，使用嵌套N1正向引物进行嵌套PCR 2(ABCG2公司核苷酸[nt]2401至2429）和anABCG2公司-将特定的嵌套N2反向引物退火到报告的mRNA序列的3′端附近（nt 4240至4263）（表​（表1；1; 参见补充材料中的图S3A）。对于S1细胞，使用hsa-miR519c-特异性抑制剂（Dharmacon）转染后从细胞中获取的总RNA重复3′RACE分析。

生物信息学。

使用miRBase TARGETS对hsa-miR-519c的miRNA靶点进行预测(19)和RNAHybrid(43)软件。使用UTRScan程序分析ABCG2 3′UTR(http://bighost.area.ba.cnr.it/BIG/UTR主页/)搜索功能元素的存在(41).

RNA二级结构分析。

使用mfold程序进行RNA二级结构分析(56)（可在http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/fold网站). 折叠温度固定在37°C。使用miR-519c结合序列（带有或不带有相邻核苷酸±100 bp）进行分析。序列用mfold以本地自动方式折叠。最稳定的热力学结构如补充材料中的图S8所示。

用miRNA抑制剂或模拟物转染细胞。

从Dharmacon购买了一种miRNA抑制剂和模拟物。使用寡效胺（Invitrogen）将高达120 nM的特异性hsa-miR519c抑制剂或总体积为10 ml的模拟物转染细胞。模拟物是包含成熟miRNA序列的双链RNA。当模拟物被转染到细胞中时，其结果类似于添加一个与内源性miRNA功能相似的外源性加工miRNA。抑制剂包含一个与成熟miRNA序列互补的序列，并充当诱饵。内源性miRNA与抑制剂紧密结合并被隔离，因此内源性靶点的结合较少。如下所述，通过干环RT-PCR评估miRNAs的表达。

miRNAs的干环RT-PCR。

如前所述，对成熟的hsa-miR-519c和hsa-miR-520h进行干环RT(6,46). 所有用于miRNA干环RT的试剂均来自Applied Biosystems（加利福尼亚州福斯特市），使用hsa-miR-519c（P/N:4373251）或hsa-miR 520h（P/N:4373258）特异性干环RT引物。组装RT反应混合物，并在25℃下培养10 min，在42℃下培养60 min，在70℃下培养5 min，然后在4℃下保持。PCR产物用以下引物扩增：miR-519c正向，5′-GCGCAAAGTGCTTTTAGGAT-3′；miR-519c反面，5′-GTGCAGTCGAGGT-3′；miR-520h正向，5′-GCGGCAAAGTGCTTCCCTTTAGAGT-3′；miR-520h反向，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向，5′-CTCGCTCGGCAGCACA-3′；和U6反面，5′-AACGCTCACGAATTTGCGT-3′。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行分析。U6小核糖核酸被用作内部对照。

荧光素酶报告分析。

荧光素酶报告基因构建物是使用携带猴病毒40（SV40）启动子荧光素酶表达单元的pGL3-控制载体（Promega，Madison，WI）制备的。5′UTR片段ABCG2公司（nt−1289 to+396）通过PCR从先前描述的启动子结构中扩增(50)，并通过RT-PCR从H460细胞总RNA中产生一个3′UTR（nt+2462-+4430）片段。将其插入萤火虫萤光素酶基因的下游，位于pGL3对照载体中萤光素酶编码序列和poly（a）信号之间的XbaI位点。通过限制性映射和序列分析验证了结构的正确定位。根据全长（FL）3′UTR结构（碱基+2462到+4430），我们构建了一系列3′缺失结构，3′端终止于碱基+4060、+3028和+2761。碱基的编号是相对于GenBank登录号中定义的核苷酸1指定的。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_004827”，“term_id”：“1519311581”，“term_text”：“NM_004828”}}NM_004827号另一个结构体（3′UTR FLΔ3820/3841）是通过从FL结构体中删除假定的hsa-miR519c结合位点而制备的。在荧光素酶基因下游克隆了一个与假定的hsa-miR519c结合位点相对应的短序列，得到了3′UTR（nt3820-3841）结构。作为对照，以类似的方式制备带有从nt3820到3841的加扰序列的向量（见图。​图4A；4A级; 也可参见补充材料中的图S9）。

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图4。

ABCG2荧光素酶报告分析。（A） 显示用于研究ABCG2 mRNA的3′UTR的荧光素酶报告子结构的示意图。亲本载体pGL3-control包含萤火虫荧光素酶的编码区，其表达由SV40启动子（Promega）驱动。核苷酸“1”是指ABCG2转录本中的第一个核苷酸，如序列NM_004827所定义。生成了以下结构：3′UTR FL（2462/4430）；三个截断的3′UTR结构（基于FL 3′UTR-结构，从3′UTR3′端进行渐进删除，其3′端标记在FL结构的顶部，即nt 2761、3028和4060）；3′UTR（3820/3841），仅包含hsa-miR-519c的22-nt假定miRNA结合位点；3′UTR FL（Δ3820-3841），包含缺乏hsa-miR-519c结合位点的FL 3′UTR；3′UTR（scramb 3820/3841），包含相同的22nt miRNA结合位点，但顺序随机；和5′UTR构建物（−1289/+396），通过插入荧光素酶编码序列下游ABCG2 5′UTRs的片段（−128至+396）制备（用作对照，以证明3′UTR对报告分析的荧光素瘤酶活性的特定影响）。图表未按比例绘制。补充材料中的图S9中提供了更详细的报告者结构图。（B） 如图所示，各种报告结构的荧光素酶报告活动。平均报告活动±SD（萤火虫/雷尼利亚荧光素酶单位）。pGL3-control表示没有ABCG2 3′UTR的矢量主干。（C） 与miRNA抑制剂（左）或模拟物（右）共同转染的细胞中FL ABCG2 3′UTR FL（2462/4430）构建物的荧光素酶报告活性。根据B组所述，获得了平均报告活动±SD。学生进行了统计分析t吨测试。

按照制造商的方案，使用Fugene 6转染试剂（Roche）将萤火虫荧光素酶构建物（200 ng）转染到12孔板中的S1细胞中。为了监测转染效率，用50 ng phRG-Basic质粒（Promega）共同转染细胞，编码雷尼利亚荧光素酶。转染48小时后，使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）测量荧光。所有转染均重复进行，通过将萤火虫荧光素酶活性标准化为雷尼利亚每个样本的荧光素酶活性。每个构建体在三个独立的转染中进行测试。为了测试miRNA抑制剂或模拟物对报告构建物的影响，使用DharmacFECT Duo转染试剂（Dharmacon）进行转染。结果表示为三个独立实验的平均值±标准偏差（SD）。数据集由未配对的学生进行比较t吨测试，显著差异被认为是P（P）值<0.05。

通过3′RACE分析鉴定人ABCG2 mRNA的3′端。

进行3′RACE反应以检测ABCG2 mRNA的3′端并确定poly（A）位点的位置(17). 使用AP与从亲本S1和耐药S1MI80细胞分离的模板mRNA杂交，进行第一链cDNA合成。然后对第一链cDNA进行PCR（第一PCR），使用与AP中唯一序列互补的外反向引物，结合ABCG2特异性正向引物ABCG2 ex16，在终止密码子上游的ABCG2外显子16处与nt 2338至2360互补（参见补充材料中的图S3A）。该PCR为抗性S1MI80亚系（第一个PCR）产生了多个小产物（200至400 bp）（参见补充材料中的图S3B）。然而，无法从亲本S1细胞中获得PCR产物，可能是因为该细胞系中ABCG2的表达水平极低。未经RT预处理的样品未发生显著反应（数据未显示）。为了提高第一次PCR的特异性，使用ABCG2特异的巢式N1正向引物（在ABCG2的第16外显子nt 2401至2429的补充，仍在终止密码子上游）和外反向引物（数据未显示）进行巢式PCR 1。嵌套PCR 1产生了更清晰的PCR条带，但基本上与第一个PCR中的模式相同。由于从我们的3′RACE分析中获得的ABGC2 3′UTR的长度（S1MI80细胞约200至400 bp长）比GenBank和UTR数据库中报告的长度短得多，因此我们评估了其他敏感的亲本细胞系（SW620、MCF7、SF295和H460），以确定这是否是一种细胞类型特异性观察。令我们惊讶的是，3′RACE分析也为其他亲本细胞系产生了长产物（～2 kb）和多个小产物（200至400 bp）（参见补充材料中的图S3B）（可能是因为该细胞系中ABCG2表达水平低，所以没有从SW620亲本细胞获得PCR产物）。

值得注意的是，在含有多个模板的PCR中，引物结合位点之间的序列长度不同（即来自不同长度的3′UTR的第一链cDNA），较短的模板通常优先扩增(4). 这可能导致通过3′RACE分析测定3′UTR长度时出现偏差，因为它低估了长3′UTR-PCR产物。为了克服这个问题并排除ABCG2 3′UTR中的选择性剪接，我们使用来自亲本和抗性细胞系对的总RNA以及与ABCG2 3′UTR cDNA中不同区域互补的引物进行了RT-PCR实验（图。​（图2A；2安培; 表​表1）。1). 六个独立重叠的PCR片段（A至F），覆盖了报告的ABCG2 3′UTR序列({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_004827”，“term_id”：“1519311581”，“term_text”：“NM_004828”}}NM_004827号)被放大（图。​（图2A）。2安培). 针对所有检测的RT样本，获得了所有六个PCR片段，其大小符合预测值，消除了ABCG2 3′UTR处选择性剪接的可能性。当cDNA合成混合物中省略逆转录酶时，未获得PCR产物。使用来自S1细胞的一系列输入基因组DNA构建校准曲线（参见补充材料中的图S4）。在用GAPDH归一化后，通过读取校准曲线来估计不同3′UTR片段与最上游区域A相比的相对丰度。对于亲本S1细胞，发现6个3′UTR区域的相对丰度相似（图。​（图2B）。2B型). 然而，对于耐药S1MI80细胞，从A区到F区，下游更多的3′UTR区域的相对丰度越来越低，这表明耐药细胞中截断的3′UTR的比例越来越大（图。​（图2B2B型).

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图2。

RT-PCR分析研究亲本S1和耐药S1MI80细胞中ABCG2 3′UTR不同片段的相对丰度。（A） 用RT-PCR分析ABCG2 3′UTR内六个不同重叠片段的大致位置示意图。每个片段约500 bp长。（B） 用GAPDH归一化后，绘制了不同3′UTR片段相对丰度与A区数量的关系。开条，亲代S1细胞；封闭条，抗S1MI80细胞。所示数据代表三个独立实验的平均值±SD。由于hsa-miR-519c的结合位点位于ABCG2 3′UTR内的nt 3820至3841，因此只有可由hsa-miR 519c调节的长ABCG2转录物才能产生片段F的PCR产物（nt 3775至4388）。然而，长和短ABCG2转录物都为片段A（nt 2462至3030）产生PCR产物。通过比较片段A和F的PCR产物，我们估计亲本S1细胞中约77%的ABCG2转录物可以被hsa-miR-519c调节。（C） 六种不同3′UTR片段的相对mRNA稳定性。在放线菌素D（5μg/ml）处理后的不同时间间隔分离总RNA，并通过RT-PCR分析A组6个3′UTR区域的mRNA水平。代表性实验的数据绘制为每个3′UTR片段的mRNA剩余百分比，与添加放线菌素D之前的量相比，使用GAPDH标准化后的量。

接下来，使用放线菌素D处理后不同时间间隔从S1和S1MI80细胞中分离的总RNA，通过RT-PCR评估六个不同3′UTR区域的相对mRNA稳定性（图。​（图2C；2摄氏度; 参见补充材料中的图S5）。虽然在亲本S1细胞中发现所有六个区域的降解速度相似，但在抗性S1MI80细胞中，上游区域（即A到C）比下游区域（即D到F）更稳定（图。​（图2C；2摄氏度; 参见补充材料中的图S5）。使用SYBR绿色检测（Roche Applied Sciences）用定量实时PCR重复此3′UTR PCR分析，并获得了可比较的结果（参见补充材料中的图S6）。结合3′RACE结果，这表明耐药S1MI80细胞中存在较短的3′UTR转录物，并且它们比亲本S1细胞中较长的转录物更稳定。

不同长度ABCG2 3′UTR序列分析。

首先使用亲本H460细胞的3′RACE产物，然后使用亲本S1细胞和S1MI80细胞的产物，我们将3′RACE-PCR混合物作为一个整体（第一个PCR）克隆到TOPO载体中，并对得到的克隆进行DNA测序。图​图3A3A级说明了在GenBank中报道的ABCG2 mRNA转录物的3′UTR内的一些推定功能元件的相对位置（登录号：。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_004827”，“term_id”：“1519311581”，“term_text”：“NM_004828”}}NM_004827号)[包括多聚（A）信号、假定的富含AU的元素（ARE）和几个假定的miRNAs结合位点（见下文）]。从我们的测序结果中，发现了五个不同长度的ABCG2 3′UTR转录本。与3′RACE分析一致，虽然在亲代细胞中有一个长的（～2 kb；在nt 4419处结束）和四个短得多的（100至400 bp；在nt 2471、2525、2644和3013处结束）3′UTR转录物，但在耐药细胞中只发现了四个短的转录物。3′UTR处核苷酸的编号与ABCG2转录本中按顺序指定的第一个核苷酸有关{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_004827”，“term_id”：“1519311581”，“term_text”：“NM_004828”}}NM_004827号，在整个报告中使用。Clustal X 2.0多序列比对软件的序列比对(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/clustalw2)表示五个3′UTR序列非常相似，除了3′端的长度不同（参见补充材料中的图S7）。在我们的研究中，还报道了ABCG2（GenBank登录号：。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“BC092408”，“term_id”：“62201506”，“term_text”：“BC 092408“}}BC092408号; UTR数据库条目UTR:3HSA117529）。该观察结果表明，不同长度是3′UTR的多聚腺苷化的结果，而不是选择性剪接。

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图3。

（A） 报道的ABCG2 mRNA 3′UTR的GenBank序列（NM_004827）中的假定功能元件。终止密码子（TAA）、规范（AAUAAA）和非规范（AUUAAA）多（A）信号、三个假定ARE（UAAUUAUA、AUUAUUAAUA和GAGAAUUAAUU）的位置，标记了ABCG2的3′UTR内推测的hsa-miR-519c和miR-520h结合位点。（B） miRBase TARGETS第4版预测的四组假定miRNA靶点（阴影区域）示意图(19)，在ABCG2的3′UTR范围内。关于这些推测的miRNAs及其在ABCG2 3′UTR上的结合位点序列的详细信息总结在表中​表2。2.最上游的簇可以被13种不同的人类miRNAs（hsa-miR-518c、hsa-miR-519d、hsa-micR-302a、hsa-milR-302d和hsa-miR-520a-h）结合，第二个位点可以被hsa-miR142-5p结合，第三个位点可以由hsa-miR.100结合，最下游的位点可以被hsa-miR-512c结合。RNA杂交自由能（ΔG公司)还显示了hsa-miR-519c的计算和理论miRNA-mRNA双链配对。此外，还标记了hsa-miR-519c序列中的“种子”区域，该区域决定了假定miRNA的特异性，以及可能破坏miRNA-mRNA相互作用的假定结合位点中G-U摆动的位置。在hsa-miR-519c序列5′端第4位发现的G-U摆动可能对miRNA靶点识别有害，但已经证明这种G-U碱基配对通常在种子区可以耐受(9).

仔细观察补充材料中图S7所示的序列，发现在五个备选聚（A）端之前有两个聚（A。显然，位于nt 2626的poly（A）信号（AUUAAA；一个非经典信号），位于终止密码子TAA（nt 2459）下游，产生较短的3′UTR，而另一个位于nt 4405的poly。​（图3A；3A级; 参见补充材料中的图S7）。此外，除了3′UTR较短的转录本（终止于nt 2471、2525和2644）外，ABGC2的所有其他转录本都有一个或多个假定ARE或其变体的副本（UAAUUUAUA、AUUAUUAAUA和GAGAAUUAAUU，分别发现于nt 2710、2857和4412）。AREs的作用是降解靶mRNA，因此有无AREs存在不同长度的ABCG2 3′UTR可能会区分其mRNA稳定性。

ABCG2 3′UTR包含四个推测的miRNA结合位点簇。

为了寻找可能参与ABCG2 mRNA稳定性的miRNA结合位点，使用miRBase TARGETS数据库进行了电子分析(网址：http://microrna.sanger.ac.uk) (19)和RNAHybrid(43)在ABCG2 3′UTR上寻找推测的miRNA结合位点。RNAHybrid程序使用自由能（ΔG公司)计算miRNA与相关mRNA内潜在位点之间有利结合相互作用的算法。这些分析确定了四个假定的miRNA结合位点（nt 2491至2512、2823至2841、3052至3073和3820至3841）（图。​（图3B）3B公司)和几种潜在的miRNA（总结见表​表2）。2). 在ABCG2 3′UTR上的四个假定的miRNA结合位点中，hsa-miR-519c特异性的结合序列位于较长的3′UTR的远端3′端，并且是抗性细胞中较短的3′UTR中唯一缺失的一个（位置3820）。请注意，这个位点只在人类身上发现。

我们询问hsa-miR-519c是否参与ABCG2抑制。miRNA阻遏的一个重要决定因素是miRNA-mRNA双链在“种子”序列中的稳定性，即miRNA 5′端的nt2到8(5,10,20,23). 所谓的“7-mer-m8位点”种子匹配（包含与miRNA核苷酸8匹配的种子匹配）(20)预测为hsa-miR-519c（图。​（图3B），3B公司)具有良好的杂交自由能（−14.4 kcal/mol）。

长期以来，靶点可及性被认为是有效反义寡核苷酸和siRNA-介导沉默的重要因素(31). 因此，我们还分析了预测的miRNA结合位点序列的稳定性，以确定我们是否可以找到可能影响可及性的RNA结构特征，并增强靶点预测的特异性(55). 因此，这些稳定或不稳定元件的存在可能有助于支持对假定的miRNA靶点的计算机筛选。使用mFold(56)根据自由能预测（ΔG公司)（见上文）和二级RNA结构。预测hsa-miR-519c结合位点序列的二级结构有一个不稳定的发夹环（补充材料中的图S8显示了mFold单独或在±100-bp相邻核苷酸的背景下为假定的hsa-miR-519c连接位点创建的二级RNA折叠结构），从而加强我们对miRNA靶向的电子预测。

验证S1细胞ABCG2 mRNA 3′UTR中假定的hsa-miR-519c靶点。

先前的研究表明，miRNA结合位点足以使报告基因结构中的miRNA依赖性基因沉默(10,53). 我们将不同长度的ABCG2 3′UTR直接插入荧光素酶开放阅读框下游，在组成活性SV40启动子的控制下（图。​（图4A；4A级; 所有报告结构的全部细节可以在补充材料的图S9中找到）。在本试验中，荧光素酶活性水平与荧光素素酶mRNA的翻译效率和/或稳定性相关。FL ABCG2 3′UTR（nt 2462至4430）与不插入任何3′UTR的pGL3对照组相比，荧光素酶活性显著降低了90%（图。​（图4B）。4B类). 通过在荧光素酶开放阅读框下游插入ABCG2（nt−1289 to+396）的5′UTR构建物对报告酶活性的最小抑制（减少<20%）也证明了3′UTR对荧光素素酶活性的特异性抑制。从ABCG2 3′UTR的3′端进行缺失的Reporter结构导致荧光素酶活性受到越来越少的抑制，这表明3′UTR3′端存在抑制因子（图。​（图4B）。4B类). 重要的是，FL ABCG2 3′UTR构建物删除了假定的hsa-miR-519c结合位点（Δ3820-3841），将荧光素酶活性恢复到pGL3对照水平的40%左右。此外，仅hsa-miR-519c结合位点也可以将荧光素酶活性抑制到约20%的pGL3对照水平。然而，假定的hsa-miR-519c结合位点的扰乱序列对荧光素酶活性没有任何影响。

为了证实hsa-miR-519c是抑制ABCG2 3′UTR荧光素酶报告子结构活性的特异性miRNA，我们进行了实验，在S1细胞中，通过使用合成的mi RNA，改变了hsa-miR 519c的内源性池里迪安hsa-miR-519c抑制剂或模拟物（Dharmacon，Lafayette，CO）。我们研究中使用的特异性hsa-miR-519c抑制剂是一种化学修饰的反义寡核苷酸，与成熟的miRNA完全互补，与内源性miRNA紧密结合，导致其隔离(8). 特定的hsa-miR-519c抑制剂在最高剂量120 nM时将FL 3′UTR报告子结构中的荧光素酶活性恢复了约四倍（图。​（图4C）。4摄氏度). 另一方面，hsa-miR-519c模拟物是一种含有成熟miRNA序列的双链RNA。当添加到细胞中时，模拟物的功能与内源性miRNA相同。当特定的hsa-miR-519c模拟物与含有ABCG2的FL3′UTR序列的报告质粒在S1细胞中共同转染时，与单独的报告结构相比，荧光素酶活性进一步呈剂量依赖性降低（图。​（图4C）。4摄氏度). 作为对照，miRNA模拟物和抑制剂的通用阴性对照基于秀丽隐杆线虫miRNA序列（cel-miR-67[Dharmacon]；该miRNA已被证实与人类、小鼠和大鼠的miRNA具有最小的序列一致性）对荧光素酶活性没有任何影响（图。​（图4C）。4摄氏度). 此外，hsa-miR-519c模拟物和抑制剂均未对hsa-miR519c位点缺失的FL ABCG2 3′UTR报告子结构产生影响（参见补充材料中的图S10）。这些结果表明，hsa-miR-519c与人ABCG2 3′UTR中鉴定的靶结合位点特异性相互作用，从而抑制ABCG2 mRNA和蛋白质的表达。

由于推测的hsa-miR-519c位点已在S1细胞中验证为ABCG2 3′UTR，我们使用转染了特定hsa-miR519c抑制剂的S1细胞重复了3′RACE分析。我们使用特异性hsa-miR-519c抑制剂来增加S1细胞中ABCG2 3′UTR的水平（参见补充材料中的图S11A），随后通过巢式PCR 1和巢式PCR 2证实了S1细胞的长序列及其在S1MI80细胞中的缺失（参见补充材料中的图S11B）。

hsa-miR-519c通过翻译抑制和mRNA降解调节ABCG2的表达。

miRNAs的调节可能是由于翻译抑制和/或mRNA降解。为了评估hsa-miR-519c是否通过这些机制中的任何一种在下调ABCG2表达中发挥作用，需要一个ABCG2表达式载体（pcDNA3-ABCG2）及其两个衍生物，其中一个具有三个hsa-miR519c结合位点序列（pcDNA2-ABCG2-3×miRNA结合位点）的串联重复序列另一个串联重复三个hsa-miR-519c位点（pcDNA3-ABCG2-3×xscramble结合位点）的干扰序列，在载体中ABCG2编码序列的终止密码子后立即融合，转染到HEK293细胞中，并测量ABCG2的表达水平。作为内部对照，还评估了共转染GFP（pEGFP-C1；BD Bioscience Clontech，Mountain View，CA）的水平，并用于使ABCG2 mRNA水平正常化。在mRNA（−24%）和蛋白质（甚至更低，−49%）水平下，经3x×miRNA结合位点载体转染的细胞中ABCG2的表达低于未插入任何3′UTR的原始ABCG2表达载体转染细胞（参见补充材料中的图S12A）。加扰结合位点载体给出了与普通ABCG2表达载体相似的ABCG2表达。将hsa-miR-519c抑制剂与pcDNA3-ABCG2-3×miR519c结合位点载体共转染，以验证hsa-miR-519c是否特异性抑制ABCG2的表达。通过特定的hsa-miR-519c抑制剂而非通用阴性对照miRNA抑制剂，ABCG2 mRNA和蛋白表达水平恢复到用普通pcDNA3-ABCG2载体转染的细胞中的水平（参见补充材料中的图S12A）。

hsa-miR-519c抑制剂对ABCG2 mRNA和蛋白表达的差异作用是可重复的，这使我们假设在hsa-miR519c抑制ABCG2的过程中，蛋白翻译阻断可能比mRNA降解发挥更重要的作用。miRNA-mRNA配对的程度被认为会影响阻遏机制，完美配对会导致mRNA断裂，但不完美配对会造成蛋白质翻译阻滞(23). 我们如上所述制备了ABCG2表达载体，但紧接着在终止密码子之后，我们放置了与miR519c序列（pcDNA3-ABCG2-3×miRNA互补序列）完全互补的22-nt序列的三个拷贝的串联重复序列或三个加扰序列副本的串联重复（pcDNA3-ABCG2-3×加扰互补序列）。然后用这些新载体转染HEK293细胞，检测ABCG2的表达。与之前的载体一样，发现用3×miRNA互补序列载体转染的细胞中ABCG2的表达低于用普通ABCG2表达载体转染细胞中的表达，但在mRNA（−61%）和蛋白质（−70%）水平上都相似（参见补充材料中的图S12B），表明在影响这两个水平的同时，hsa-miR-519c对蛋白质翻译的影响在野生型3′UTR中占主导地位。3×加扰互补序列载体与原ABCG2表达载体表达的ABCG2相似。有趣的是，当载体仅包含hsa-miR-519c结合位点或互补序列的单个拷贝时，也获得了类似的观察结果（图。5A和B).

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图5：。

hsa-miR-519c结合位点通过mRNA降解和蛋白翻译阻断促进ABCG2表达的调节。（A） 用ABCG2表达载体（pcDNA3-ABCG2）或其两种衍生物中的一种转染HEK293细胞，一种带有hsa-miR-519c结合序列的拷贝（pcDNA2-ABCG2-1×miRNA结合位点），另一种带有hsa-miR-5129c位点的打乱序列（pcDNA1-ABCG2-可填充结合位点）在载体中ABCG2编码序列的终止密码子后立即融合，并在转染48 h后评估ABCG2 mRNA和蛋白的表达。一种特定的hsa-miR-519c或阴性对照miRNA抑制剂也被共同转染到细胞中，以观察其是否可以增加ABCG2的表达水平。ABCG2表达水平用GFP（pEGFP-C1；DB Bioscience Clontech）进行标准化，并绘制在条形图中，与用pcDNA3-ABCG2载体转染的细胞的水平相关。所示数据代表三个独立实验的平均值±SD。（B） hsa-miR-519c和3′UTR序列之间的完美Watson-Crick配对主要促进ABCG2抑制中的mRNA降解。用与A组相似的ABCG2表达载体转染HEK293细胞。然而，在两个衍生载体中，不是hsa-miR-519c结合位点，而是与hsa-miR519c连接位点互补的22-nt序列的一个拷贝（pcDNA3-ABCG2-1×miRNA互补序列）或其扰码序列（pcDNA3-ABCG2-可压缩互补序列）在ABCG2编码序列的下游立即融合。发现用1×miRNA互补序列载体转染的细胞中ABCG2的表达低于用普通ABCG2表达载体转染而在终止密码子后没有任何东西的细胞，但在mRNA（−65%）和蛋白质（−70%）水平上的表达相似。该加扰互补序列向量给出了与原始ABCG2表达向量相似的ABCG2表达式。hsa-miR-519c也被发现负责阻遏，因为hsa-miR519c抑制剂，而非干扰控制miRNA抑制剂，可以恢复转染pcDNA3-ABCG2-1×miRNA互补序列的细胞中ABCG2的表达。ABCG2的表达水平用GFP标准化，并与转染pcDNA3-ABCG2载体的细胞中获得的水平相关。

在转染了各种载体（具有hsa-miR-519c结合位点或互补序列的单个拷贝）的HEK293细胞中，也测量了ABCG2 mRNA的稳定性。在转染后48小时加入放线菌素D以阻断转录，在不同时间间隔分离总RNA，并使用RT-PCR分析ABCG2 mRNA水平。作为一项内部控制，对共转染GFP的水平进行测量以进行归一化。如图所示。​图6，6，ABCG2编码序列下游具有hsa-miR-519c互补序列的载体表达的ABCG2 mRNA是最不稳定的（半衰期[t吨_1/2]，～6 h），然后是带有野生型hsa-miR-519c结合位点的载体(t吨_1/2，>16小时）。相反，在放线菌素D处理后24小时内，无任何3′UTR的ABCG2相当稳定。使用通用探针库基因检测，通过实时PCR重复检测，获得了类似的结果。这些结果强调了ABCG2 3′UTR（nt 3820至3841）中hsa-miR-519c结合位点的体内失稳作用，但仅部分通过促进mRNA降解。有趣的是，hsa-miR-519c与hsa-miR-519c互补序列的完美配对导致ABCG2 mRNA的最大降解。

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图6。

hsa-miR-519c结合位点通过促进mRNA降解降低ABCG2的表达。（顶部）ABCG2表达载体（pcDNA3-ABCG2）及其两种衍生物，一种具有hsa-miR-519c结合序列的拷贝（pcDNA3-ABCG2-1×miRNA结合位点），另一种具有与hsa-miR-519c互补的序列（pcDNA3-ABCG2-1×miRNA互补序列）在载体中ABCG2编码序列的终止密码子后立即融合，转染到HEK293细胞中，并监测ABCG2 mRNA的稳定性。在转染后48小时加入放线菌素D以阻断转录，在不同时间间隔分离总RNA，并使用RT-PCR分析ABCG2 mRNA水平。作为内部对照，评估GFP mRNA水平（来自pEGFP-C1[BD Bioscience Clontech]的共转染），并用于使ABCG2 mRNA水平正常化。该图显示了三个独立且可重复的实验的平均结果。ABCG2编码序列下游带有hsa-miR-519c互补序列的载体表达的ABCG2 mRNA最不稳定(t吨_1/2，～6 h），然后是带有hsa-miR-519c结合位点的载体(t吨_1/2，>16小时）。相反，在放线菌素D处理后24小时内，没有任何3′UTR的ABCG2 mRNA相当稳定。（底部）代表性凝胶图像，显示顶部面板中总结的RT-PCR分析。

hsa-miR-519c调节内源性ABCG2 mRNA和蛋白表达。

最后，我们评估了hsa-miR-519c在下调内源性ABCG2表达中是否具有功能作用。选择A549细胞进行我们的研究是因为通过Western blot分析可以在这些细胞中检测到内源性ABCG2蛋白的表达，并且与我们研究中使用的其他亲本细胞系类似，A549细胞具有长和短ABCG2 3′UTR，如3′RACE分析所示（数据未显示）。用不同浓度的hsa-miR-519c抑制剂（一种与成熟miRNA具有互补序列的单链修饰RNA）转染A549细胞，导致ABCG2在mRNA和蛋白质水平上的剂量依赖性诱导。使用120 nM miR519c抑制剂，ABCG2 mRNA和蛋白分别上调了两倍和六倍，而GAPDH中没有发现变化（图。​（图7，7，顶部面板）。阴性对照miRNA抑制剂没有改变ABCG2、GAPDH或hsa-miR-519c水平。尽管miRNA抑制剂主要通过隔离内源性miRNA发挥作用，但较高剂量的miRNA抑制剂也会降低内源性miRNAs的水平（图。​（图7，7，顶部面板）。事实上，反义寡核苷酸已被证明可以降低同源miRNAs的细胞浓度(8,29).

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图7。

hsa-miR-519c调节A549细胞内源性ABCG2的表达。将0到120 nM的特异性hsa-miR-519c抑制剂、hsa-miR-519c模拟物或相应的阴性对照物（基于cel-miR-67序列[Dharmacon]；该miRNA已被证实与人类、小鼠和大鼠的miRNA具有最小序列同源性）转染A549细胞48小时。采集总RNA和全细胞裂解物，用于随后的RT-PCR和ABCG2表达的Western blot分析。ABCG2的表达用GAPDH标准化，并与模拟处理细胞的表达相对应。hsa-miR-519c的转录物也通过干环RT-PCR测定。该图显示了三个独立且可重复的实验的代表性结果。通用miRNA阴性对照抑制剂或模拟物不影响ABCG2、hsa-miR-519c或GAPDH的表达。

在这些研究的同时，A549细胞被转染特定的hsa-miR-519c模拟物，这是一种模拟内源性hsa-miR519c的合成RNA双链。120 nM的特定hsa-miR-519c模拟物分别抑制ABCG2 mRNA和蛋白水平约70%和90%，但GAPDH未受影响（图。​（图7，7，底部面板）。阴性对照miRNA模拟物也没有改变ABCG2、GAPDH或hsa-miR-519c水平。

这项研究得到了NIH、国家癌症研究所、癌症研究中心的内部研究项目的支持。