ERCC1-XPF是一种高度保守的核酸内切酶，因其在螺旋扭曲DNA损伤的核苷酸切除修复（NER）中发挥重要作用，特别是在紫外线诱导的损伤中(4,74). NER缺陷会导致着色性干皮病（XP），这是一种罕见的疾病，其特征是光敏性，皮肤癌风险显著增加，严重情况下还会导致神经退化。相比之下，唯一报告的患者ERCC1号机组患有严重的先天性畸形（脑-眼-面骨骼综合征）(33). 有轻微突变的患者XPF公司有轻度XP(46)与净入学率的部分缺陷一致。然而XPF公司严重降低蛋白质水平会导致急剧加速衰老(53). 这一观察结果暗示了哺乳动物ERCC1-XPF与NER不同的额外功能。与此一致，ERCC1和XPF缺陷小鼠的表型比NER缺陷小鼠严重得多。Xpa公司−/−未检测到NER的小鼠在受到致癌物攻击之前，无法与野生型（WT）小鼠区分(12). 相反，错误代码1−/−和Xpf公司−/−小鼠有一系列进展性症状，影响肌肉骨骼、皮肤、肝胆、肾脏和造血系统(48,53,79,84)在性成熟前死于肝衰竭(72).
XPF包含核酸酶的催化域(18)而ERCC1是DNA结合和XPF稳定所必需的(51,80). 核酸内切酶是结构特异性的，将双链DNA 5′切割到与单链DNA的连接处。因此，ERCC1-XPF可以从DNA末端去除3′单链皮瓣(11)并切开NER中气泡的5′侧以切除病变(74). ERCC1-XPF切口产生一个3′OH基团，用于启动DNA合成以取代切除的碱基(74). ERCC1和XPF都没有结构域，表明该蛋白的功能不是作为核酸酶(73). 因此，ERCC1-XPF防止快速老化的新功能可能是对其他DNA修复机制的贡献。
事实上，ERCC1-XPF是通过与NER不同的机制修复DNA序列间交联（ICL）所必需的(47,54)ICL与ERCC1-XPF缺乏引起的显著过早衰老表型有关(53). 然而，ERCC1-XPF、AtErcc1-AtRad1的正交曲线拟南芥(29)，DmERCC1-MEI-9英寸黑腹果蝇(三)和Rad10-Rad1英寸酿酒酵母(22,32)也与双绞线断裂（DSB）修复有关。DNA双链断裂是一种细胞毒性极强的损伤，因为双螺旋的两条链都受到影响。DSB由环境和内源性过程引起，包括电离辐射（IR）、辐射模拟药物、减数分裂重组和V（D）J重组期间内切酶的程序性切割，以及含有单链断裂、ICL或拓扑异构酶I诱导损伤的DNA复制(6,30). 未能修复DSB可能导致染色体畸变积累或细胞死亡(6,30,37). 因此，在DSB识别或修复方面有基因缺陷的人类，或模拟这些人类综合征的模型生物，容易患癌症和部分性过早衰老(21,30).
真核生物中DSB修复有两种主要机制：同源重组（HR）介导的修复和非同源末端连接（NHEJ）(6). HR是一种无错误的机制，在这种机制中，在断端丢失的序列信息可以从姐妹染色单体中恢复。因此，人力资源主要限于S和G2细胞周期的各个阶段，当有姐妹染色单体时。另一方面，NHEJ通过结扎重新连接两个断端。因此，它不仅限于增殖细胞，而且这种修复机制经常用于哺乳动物(36). 由于NHEJ不需要序列同源性，因此可能会连接不合适的末端，导致染色体易位(6,30). 此外，碱基可能在断裂的末端丢失，从而导致缺失。然而，NHEJ似乎基本上没有错误(27,81).
酵母中DSB修复有几种明确的易出错机制(28). 单链退火（SSA）和微同源性介导的末端连接（MMEJ）通路通过配对DSB处或附近的同源序列来对齐两个断裂的DNA末端。在这两种机制中，如果同源性没有立即出现在断裂端，则ERCC1-XPF的直系同源物Rad10-Rad1核酸内切酶需要从末端移除非同源序列的3′瓣，允许DNA合成和连接，从而产生缺失。尽管两者相似，SSA和MMEJ似乎有不同的遗传要求。SSA需要Rad52和Rad10-Rad1，而对于短片段的同源性，也涉及Rad59、Msh2和Msh3(28). 相反，MMEJ不依赖于Rad52或Ku86，但需要Rad10-Rad1、Mre11-Rad50-Xrs2(28)，皮瓣核酸内切酶Sae2(40)和错配修复蛋白Msh2和Pms1(10). 很长一段时间以来，哺乳动物细胞中发现了利用短片段序列同源性的DSB修复事件(65). 哺乳动物细胞中存在SSA的证据(34,42)尤其是HR或NHEJ有缺陷时(76). NHEJ突变哺乳动物细胞仍然支持DSB的末端连接(35)利用断裂端的短序列的微同源性(38)，表明MMEJ也发生在哺乳动物细胞中。最近，这种微同源介导的DSB修复的替代末端连接机制被证明支持NHEJ缺陷B细胞中的类开关重组(87). SSA和MMEJ的遗传要求以及这些途径在哺乳动物中的生物学意义尚不清楚。
在本研究中，我们研究了3′瓣核酸内切酶ERCC1-XPF是否参与哺乳动物细胞DSB修复。据报道，ERCC1-XPF缺陷的中国仓鼠卵巢细胞系对IR具有中度超敏反应，尤其是在缺氧条件下(50,86). 相反，人类XP-F成纤维细胞和小鼠错误代码1−/−胚胎干细胞对IR不敏感(50,52). 为了更系统地寻找哺乳动物核酸酶在DSB修复中的作用，我们筛选了错误代码1−/−小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、XPF缺乏的人成纤维细胞和ERCC1缺乏的小鼠对IR的敏感性。我们还使用遗传方法来确定ERCC1-XPF是否与NHEJ蛋白在IR敏感性方面存在上位性。
材料和方法
生成细胞系和小鼠。
错误代码1−/−如前所述，生成并培养小鼠ES细胞(52).错误代码1−/−,DNA-派克反恐精英−/−,库86−/−，以及Csb公司−/−如前所述，初级MEF是从胚胎第12天发育到15个胚胎，这些胚胎来自杂交近交系C57BL/6小鼠，每个空等位基因杂合(13,41,43,84).错误代码1−/− 库86−/−和错误代码1−/− DNA-派克反恐精英−/−双敲除原代MEF是从近交C57BL/6背景下杂交双杂合小鼠的胚胎中产生的。使用NucleoSpin DNA提取系统（Macherey-Nagel，Inc.）从每个胚胎的组织样本中分离出基因组DNA。基因分型错误代码1通过PCR共扩增WT等位基因第7外显子的3′端，将新霉素抗性标记克隆到目标等位基因的外显子7中，并用外显子7neo特异性引物对其进行扩增第页和内含子7（分别为5′-AGCGACCTCTTTATGGAAA、5′-TCGCCTTGACGAGTTCT和5′-ACCAGGCTGAGGGCACT）。在2%琼脂糖凝胶上通过电泳分离WT（0.25-kb）和突变产物（0.4-kb）。基因分型库86如前所述，通过PCR进行等位基因检测(82). 的基因分型DNA-派克反恐精英用正向（5′-GCATCGCCTTCTATCGCCTT）和反向（5′-GCTGAGACATCCTGGACTGAA）引物对空等位基因（0.4 kb）和正向引物5′-GGAATTGGACTGTCG进行PCR，并用与WT等位基因相同的反向引物对正向引物进行PCR。
MEF在杜尔贝科改良Eagle's培养基和火腿F10与10%胎牛血清和抗生素的1:1混合物中培养，并在3%氧气下培养(59). 每个实验复制品都是用一个新的MEF系完成的，该系是在第二代或第三代中从一个独特的胚胎中创建的。在所有实验中，来自WT同窝胚胎的细胞系被用作对照。一个自发转变的错误代码1−/−MEF系稳定转染表达人ERCC1号机组cDNA与增强型黄色荧光蛋白（YFP）融合在框架中(52). 人成纤维细胞永生化hTert来源于一名正常人（C5RO）和一名因基因突变导致严重早衰的患者XPF公司（XFE）(53)在含10%胎牛血清和抗生素的火腿F10中培养，并在3%氧气下培养。
双恒河的(错误代码1+/Δ 库86+/−和错误代码1+/− 库86+/−)对混合遗传背景（50:50 C57BL/6和FVB/n）的小鼠进行繁殖以恢复错误代码1−/Δ 库86−/−老鼠。从2周龄幼崽的耳塞中提取DNA，并通过上述PCR进行基因分型。突变的等位基因错误代码1（Δ）通过添加第四个引物（5′-CTAGGTGGCAGGTCATC）来扩增新Δ等位基因（0.5 kb）中的暗盒。
克隆存活分析。
在10时将早期主要MEF播种在6厘米的培养皿中，一式三份三到104每个盘子，取决于基因毒素的剂量。16小时后，用137Cs来源。7至10天后，将培养物固定并用50%甲醇、7%乙酸和0.1%考马斯蓝染色。用尼康SMZ 2B体视显微镜和10×目镜计数集落（定义为≥10个细胞）。将数据绘制为处理平板上相对于未处理平板生长的菌落数±平均值的标准误差（至少三个独立实验，每个实验都有一个独特的细胞系）。
免疫荧光。
将细胞胰蛋白酶化并接种在25%的玻璃盖玻片上。16小时后，用2 Gy的γ射线照射细胞。将细胞在37°C的新鲜培养基中培养指定的时间，然后用2%多聚甲醛在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中固定15分钟。用0.1%Triton X-100在磷酸盐缓冲液中将细胞渗透，并用多克隆抗γH2AX（1:1000；Upstate Biotechnology）和Alexa 488-共轭山羊抗兔免疫球蛋白（1:500；分子探针），在含有0.15%甘氨酸和0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水中。用60×至100×物镜的Olympus BX51荧光显微镜计数γH2AX病灶。
动物生存。
将6周龄的野生型和突变型动物（每个基因型6只）暴露于来自137Cs来源，并每天监测其健康状况。根据匹兹堡大学IACUC标准，当动物被视为终结时，对其实施安乐死。生存数据记录为Kaplan-Meier曲线。
组织学分析和免疫组织化学。
组织（肝脏、股骨和肠道）是从受γ射线照射的末端收集的错误代码1−/Δ小鼠或照射后2天。年龄匹配未治疗和治疗WT和未治疗错误代码1−/Δ同时处死小鼠作为对照。组织用10%福尔马林固定并包埋在石蜡中。切割五个微米切片，并用苏木精和伊红染色。按照制造商的建议，使用大鼠抗鼠Ki67单克隆抗体（克隆TEC-3；Dako North America，Inc.，Carpindia，CA）进行免疫染色，以观察小肠隐窝内细胞的增殖。
细胞遗传学。
通过稳定转染表达猴病毒40大T抗原的质粒转化MEF，并暴露于2 Gy（WT和错误代码1−/−)或0.4 Gy(库86−/−和错误代码1−/− 库86−/−)在细胞收获前48和36 h，分别向培养基中添加溴脱氧尿苷（10μM）和秋水仙碱（0.1μg/10 ml）。通过胰酶消化法获取细胞，并按前述方法制备中期涂片(15). 测定了每二倍体中期传播的片段数、断裂数、融合数、径向数和标记染色体数。
人口倍增数的计算。
以0.5×10的密度电镀WT和突变MEF6每个6厘米的盘子。细胞在汇合处进行胰蛋白酶消化、计数，并以相同密度重新放置，直到双敲除细胞停止生长。每个传代的细胞总数计算如下：（前一传代细胞数/电镀细胞数）×当前传代细胞数量。总细胞数绘制为对数细胞数。
体外DNA修复试验。
WT和错误代码1−/−MEF生长在6厘米的培养皿上，并使用Nucleofector MEF II试剂盒（马里兰州盖瑟斯堡Amaxa Biosystems）或Lipofectamine 2000试剂盒（加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen），按照制造商的说明进行转染。pEYFP-N1（Clontech Laboratories Inc.，Mountain View，CA）通过在启动子和YFP编码序列之间消化SmaI（钝端）、HindIII（5′互补）或KpnI-SacI（3′非互补端）而线性化。将线性产物凝胶纯化并转染到WT或突变MEF中。48小时后，对细胞进行分类，并通过Dako细胞形成MoFLo高速细胞分选仪（Dako North America，Carpintia，CA）测定表达YFP的细胞分数。修复效率是根据至少三个独立实验得出的线性质粒转染后YFP阳性细胞相对于圆形质粒转染的百分比来计算的。同时，通过碱裂解从MEF中回收转染质粒DNA(31). 酚氯仿提取后，用乙醇沉淀DNA，并用λ核酸外切酶处理，以去除任何线性质粒DNA(16,44). DNA随后在大肠杆菌，并分离出单个质粒。通过SmaI（钝端）、HindIII（5′互补端）或EcoRI（3′非互补端）消化筛选质粒，以区分无错误（对消化敏感）和易错误（耐消化）DSB修复。接下来通过ApaLI和ClaI消化对质粒进行缺失筛选，产生2.9 kb和1.7 kb的两个产物，如果DSB位点发生缺失，后者的大小将减小。对于含有小缺失的质粒，用正向引物5′-TACTCAATGGGCGTGATA和反向引物5’-GAACTCAGGTCAGCTTGC扩增DSB位点两侧的475-bp区域。将扩增的片段在3%琼脂糖凝胶上运行，以估计小缺失的大小；检测下限约为25bp。最后，对每组20到30个质粒（钝器或5′或3′悬挑）进行DSB修复发生的连接点测序，以确定使用微同源性和插入碱基的频率。
结果
ERCC1-XPF缺陷细胞对IR的敏感性。
作为确定ERCC1-XPF是否参与DSB修复的第一个筛选，通过克隆生存试验测试了任一蛋白亚基突变的细胞对IR的敏感性。端粒酶永生化XPF缺陷的人成纤维细胞对IR的敏感性明显高于WT成纤维细胞或HeLa细胞（图。)尽管这些细胞并不完全缺乏XPF(53). 同样，错误代码1−/−初级MEF，其中XPF蛋白也无法检测到(53)与同类WT MEF相比，它们对IR的敏感性提高了2.5倍（图。). 通过稳定转染错误代码1−/−细胞与人类ERCC1号机组cDNA。相反，错误代码1−/−相对于同类WT细胞系，小鼠ES细胞对IR不敏感（图。)，如前所述(52). 这些数据揭示了ERCC1-XPF缺陷不同类型细胞对基因毒性应激的敏感性差异，并表明这种内切酶是保护分化哺乳动物细胞免受IR影响所必需的。
在细胞暴露于增加剂量的IR后进行克隆存活分析。误差条表示三个或更多独立实验平均值的标准误差。（A） WT永生化人成纤维细胞（C5RO）、HeLa细胞和来源于XPF缺乏患者（XFE）的永生化成纤维细胞。（B） 两个独立的早期传代初级WT和错误代码1−/−MEF线路和转换错误代码1−/−MEF用人稳定校正ERCC1号机组cDNA。（C） WT和错误代码1−/−小鼠ES细胞。
因为IR除了引起DSB外还引起多种类型的DNA损伤（例如单链断裂和氧化碱损伤[23]),错误代码1−/−还对细胞进行了氧化剂百草枯敏感性筛选（参见补充材料中的图S1）。错误代码1−/−ES细胞对百草枯和H过敏2O（运行）2(53)，而错误代码1−/−主要MEF并非如此。细胞类型特异性的敏感性模式与IR相反，表明ERCC1-XPF缺陷MEF对IR的超敏反应不是由于未能修复氧化碱损伤所致。
ERCC1-XPF缺陷细胞中IR诱导DSB的定量。
为了进一步探讨ERCC1-XPF缺陷细胞的IR敏感性的原因，我们测量了磷酸化组蛋白变体H2AX，一种DSB标记物(63)在IR暴露后的多个时间点，WT和ERCC1-XPF缺陷细胞中。γH2AX焦点提供了低剂量照射下DSB诱导和修复的定量测量(66). 将细胞暴露于2 Gy的IR下，通过免疫荧光检测γH2AX病灶（参见补充材料中的图S2）。在照射后0、4、12、24和48小时对Foci进行计数。细胞被分类为无病灶、一个或两个病灶或两个以上病灶（图。). 2-Gy剂量在100%WT和XPF公司突变成纤维细胞。照射后12小时，75%的WT细胞不再有γH2AX病灶（图。)然而，>60%的XPF缺陷细胞仍有多个病灶，这表明DSB持续积聚或持续存在（图。). 通过以下方法获得了类似的结果错误代码1−/−主要MEF（图。). 在人类和小鼠突变成纤维细胞中，γH2AX病灶细胞的比例在照射后24和48小时下降，与DSB的修复一致，尽管与WT对照组相比明显延迟。WT和错误代码1−/−照射后任何时间点的ES细胞（图。)这些数据支持ERCC1-XPF核酸酶在促进哺乳动物成纤维细胞DSB修复中的作用。
暴露于IR的WT和ERCC1-XPF缺陷细胞中γH2AX病灶的定量。直方图显示照射后0、4、12、24和48小时无病灶（蓝色）、一个或两个病灶（绿色）或两个以上病灶（红色）的细胞分数。面板：A，永生WT人成纤维细胞（C5RO）；B、 永生化XPF缺陷型人成纤维细胞（XFE）；C、 WT主要MEF；D中，错误代码1−/−初级MEF；E、 WT ES细胞；F、，错误代码1−/−ES细胞。
ERCC1缺陷小鼠对IR的敏感性。
为了确定ERCC1-XPF是否有助于防止体内IR，6周龄错误代码1−/ΔERCC1-XPF亚型小鼠(14,84)和WT室友(n个=6）接受单剂量6 Gy全身照射。在这个年龄，错误代码1−/Δ小鼠健康，除生长迟缓外无明显异常表型（未发表数据）。6-Gy剂量的辐射不会严重影响WT小鼠的存活率（图。和参考41)但造成了100%的死亡错误代码1−/Δ小鼠照射后11天。尽管由于遗传背景差异很难进行比较错误代码1−/Δ小鼠与DNA-派克反恐精英−/−老鼠(41)但比库86−/−老鼠(56)它们都缺乏NHEJ所需的蛋白质。因此，ERCC1-XPF在保护哺乳动物免受辐射诱导的体内DNA损伤方面做出了重大贡献。
ERCC1缺陷小鼠对IR的敏感性（A）六周龄错误代码1−/Δ小鼠和WT室友(n个=6/组）暴露于6 Gy的IR，并在暴露后几天内记录存活率。（B至G）7至8周龄婴儿的组织切片和错误代码1−/Δ小鼠±暴露于6Gy的IR。（B）未经治疗的小鼠的小肠。（C） 暴露于IR的小鼠小肠显示绒毛丢失错误代码1−/Δ老鼠。（D） 未经治疗小鼠的BM。（E） 暴露于IR的小鼠BM显示脂肪替代错误代码1−/Δ老鼠。（F） 未经治疗的小鼠的肝脏。（G） 暴露于IR的小鼠肝脏显示小叶中心坏死错误代码1−/Δ老鼠。（H） 肝细胞核显示γH2AX病灶错误代码1−/Δ小鼠IR后11天。
确定死亡原因错误代码1−/Δ小鼠、胃肠道、骨髓（BM）和来自WT和错误代码1−/Δ对照射后11天的小鼠进行检查。这些组织与未经治疗的组织没有区别错误代码1−/Δ和WT室友（图。). 然而，根据IR，错误代码1−/Δ与WT小鼠相比，小鼠的肠绒毛明显更少（图。). 增殖标记Ki67的免疫染色(69)发现阳性细胞明显减少错误代码1−/Δ与照射后11天的WT小鼠相比，但在IR后2天或未暴露动物中的隐窝没有进行比较（参见补充材料中的图S3）。照射后，WT小鼠的股骨BM显示所有造血谱系的高细胞性，与反应性增生一致（图。). 相比之下错误代码1−/Δ小鼠明显为亚细胞性，残留细胞显示异常增生，包括核间桥接、多核和巨母细胞样改变，最显著影响红细胞生成。颗粒细胞向未成熟细胞类型转变。在…的肝脏里错误代码1−/Δ但不是WT小鼠，这种剂量的IR诱导的小叶中心坏死（图。). 肝切片γH2AX免疫染色显示肝细胞核灶错误代码1−/Δ老鼠，但不是WT的同窝伙伴（图。)，表示持续的DSB。总的来说，这些数据表明错误代码1−/Δ小鼠易受IR-诱导的基因毒性应激，损伤后再生能力下降。
ERCC1缺乏导致胚胎死亡库86−/−背景。
最近的证据表明，ERCC1-XPF促进哺乳动物细胞中直接重复序列之间的SSA(2)和中的正交曲线Rad10-Rad1一样酿酒酵母(28). 在酵母中，Rad10-Rad1还参与MMEJ，这是一种Ku依赖的DSB修复机制(45). 这一途径最近在哺乳动物身上得到证实(87). 为了测试ERCC1-XPF的这种功能在哺乳动物中是否保守，我们尝试繁殖ERCC1和Ku86双重缺陷的小鼠。令人惊讶的是，没有人活着错误代码1−/Δ 库86−/−小鼠恢复正常（见补充材料中的表S1；220个后代中的0个，预期14个；P（P）< 0.001). 对出生后24小时内死亡的幼鼠进行基因分型也未能鉴定出双突变小鼠。这是意料之外的，因为库86−/−和错误代码1−/Δ尽管小鼠的寿命缩短（分别为88周和30周[82,84; 未发表的结果]）。在哺乳动物中，Ku86和ERCC1的联合丢失导致死亡，类似于在芽殖酵母中删除Ku和Rad1的效果(45). 这支持了ERCC1-XPF有助于DSB修复途径的结论，该途径与NHEJ和其他Ku依赖机制不同，是Ku独立的。
错误代码1−/− 库86−/−MEF过早老化。
生成错误代码1−/− 库86−/−MEF，双杂合错误代码1+/− 库86+/−小鼠杂交。错误代码1−/− 库86−/−胚胎（胚胎第13至16天）以孟德尔频率恢复（见补充材料中的表S2），表明ERCC1和Ku86的缺乏会导致胚胎发育后期死亡。MEF来源于错误代码1−/− 库86−/−与来自同窝婴儿的单一突变细胞系相比，胚胎在培养中生长极为缓慢（图。; 参见补充材料中的图S4）。即使MEF在3%O培养时2，缓解氧化应激导致的过早衰老(59),错误代码1−/− 库86−/−MEF在第5段之后没有扩散。这表示同时删除错误代码1和库86导致原代细胞早衰，并且在氧化环境中的细胞增殖需要Ku依赖性或ERCC1依赖性DNA修复。
ERCC1和NHEJ蛋白被删除的细胞的生长和IR敏感性。（A） 每个WT通道的单元数，错误代码1−/−,库86−/−，以及错误代码1−/− 库86−/−在3%氧气下培养的原代MEFs。（B） 转化WT的克隆存活，错误代码1−/−,DNA-派克反恐精英−/−,库86−/−,错误代码1−/− 库86−/−，以及错误代码1−/− DNA-派克反恐精英−/−暴露于IR后的MEFS。
错误代码1−/− 库86−/−MEF对IR过敏。
确定是否错误代码1与上位库86或DNA-派克反恐精英关于DSB维修，错误代码1−/− 库86−/−和错误代码1−/− DNA-派克反恐精英−/−对细胞进行IR敏感性筛选错误代码1−/− 库86−/−MEF快速衰老，通过稳定转染表达猴病毒40大T抗原的质粒，每个基因型的一个原代细胞系被转化(83). 转化错误代码1−/−,库86−/−，以及DNA-派克反恐精英−/−单突变MEF对IR过敏（图。)，如图所示。和之前报告的一样(8,41,43). 意外地，错误代码1−/− DNA-派克反恐精英−/−MEF对IR的敏感性似乎与DNA-派克反恐精英−/−细胞。然而，错误代码1−/− 库86−/−MEF对IR的敏感性显著高于其他两种错误代码1−/−或库86−/−细胞，符合体内两种突变的加性效应。这些结果进一步证明ERCC1-XPF参与了DSB修复机制，为Ku依赖性DSB修复提供了关键支持，酵母同源物Rad10-Rad1也是如此。
基因组不稳定性错误代码1−/−IR后的MEF。
为了进一步研究ERCC1-XPF缺陷细胞对IR的超敏反应是否是由DSB引起的，在暴露于低剂量IR后对细胞进行染色体异常检查错误代码1−/−MEFs用2Gy治疗库86−/−和错误代码1−/− 库86−/−由于MEF对IR极度过敏，因此使用0.4 Gy治疗MEF（图。和参考43). 姐妹染色单体交换（SCE），通过DSB的HR发生(75)，显著增加错误代码1−/−与WT电池相关的MEF（表). 这些数据表明同源重组不受ERCC1-XPF核酸酶损失的影响。相反，照射后SCE的频率没有增加错误代码1−/− 库86−/−单元格相对于库86−/−细胞。这可能反映了在Ku和ERCC1-XPF同时存在的情况下，缺乏3′OH基团的辐射诱导断裂处理效率低下，这是HR所必需的。染色体畸变在错误代码1−/−与WT电池相比，经IR处理的MEF（表和图。). 这些异常包括间隙、碎片、断裂、融合和放射状，所有这些都是未修复或修复错误的DSB的特征。间隙、断裂、融合和径向也显著增加错误代码1−/− 库86−/−MEF相对于库86−/−单元格（表和图。)，进一步证明ERCC1-XPF参与了DSB修复机制，作为Ku86依赖性修复的备份。
IR后转化MEF的染色体畸变。WT和错误代码1−/−细胞暴露于2 Gy IR，亚融合培养库86−/−和错误代码1−/− 库86−/−细胞暴露于0.4Gy，48小时后分析细胞。（A） 暴露于IR的WT MEF的典型中期扩散。（B）错误代码1−/−显示IR诱导间隙（G）、碎片（Fr）和放射状物（R）的细胞。（C）库86−/−细胞显示IR诱导的片段。（D）错误代码1−/− 库86−/−显示IR诱导片段、间隙、融合（Fu）、放射状和标记染色体（M）的细胞。
表1。
| 基因型 | 剂量（Gy） | 检查的细胞数量 | SCE公司一 | 差距一 | 断裂和碎片一 | 融合和辐射一 |
|---|
| 重量 | 2 | 25 | 25 | 0.3 | 0.8 | 0 |
| 错误代码1−/− | 2 | 24 | 42b条 | 2.6b条 | 2.6b条 | 0.5b条 |
| 库86−/− | 0.4 | 36 | 25 | 1.2 | 1.2 | 0 |
| 错误代码1−/−库86−/− | 0.4 | 34 | 18 | 2.8c（c） | 2.8c（c） | 0.5c（c） |
ERCC1-XPF有助于移除非互补的3′悬挑。
为了确定ERCC1-XPF是否参与类似于Rad10-Rad1的DSB修复终接机制，我们使用了体外DNA终接分析(67). 表达YFP的质粒（pYFP-N1）通过限制性内切酶消化线性化，限制性内切酶产生钝的、互补的5′末端或非互补的3′末端。将这些线性质粒转染到WT中，错误代码1−/−,库86−/−，以及错误代码1−/− 库86−/−细胞和修复事件以YFP表达细胞的百分比进行评分（参见补充材料中的图S5）。在启动子和YFP cDNA之间建立DSB降低了YFP的恢复+细胞数量增加了三倍。对于钝头或单股悬垂端的DSB，修复频率没有差异。此外，WT中修复事件的频率没有差异，错误代码1−/−，或库86−/−转染任何修复底物的细胞。观察到的唯一显著差异是YFP的恢复降低+ 错误代码1−/− 库86−/−用含有单链悬垂的线性质粒转染后的细胞。这表明，在缺乏ERCC1-XPF和Ku86的情况下，无法直接结扎的DSB修复效率低下。
修复的pYFP-N1质粒DNA从WT和错误代码1−/−YFP公司+细胞转染后48h。质粒DNA用转染前用于线性化的相同酶消化，以对无错误修复事件进行评分。在WT和错误代码1−/−单元格（表)正如预期的那样，对于具有非互补单链悬垂的DNA，所有修复事件都容易出错。根据琼脂糖凝胶电泳测定的缺失大小，易出错事件分为三类：<100 bp、100-500 bp和>500 bp。WT和WT之间因修复钝端或5′互补悬垂导致的缺失大小没有差异错误代码1−/−细胞。然而，修复了3′非补体悬垂的底物中的大量缺失显著增加错误代码1−/−细胞相对于WT细胞。这表明，在缺乏ERCC1-XPF的情况下，3′端不能直接结扎的DSB修复受损，导致切除增加和较大的缺失。这与ERCC1-XPF作为3′瓣核酸内切酶的底物特异性一致(11,74).
表2。
| DNA末端和基因型 | n个 | %无错误 | %容易出错 | %删除<100-bp | %删除101至500-bp | %删除>500-bp |
|---|
| 迟钝的 | | | | | | |
| 重量 | 81 | 50 | 50 | 88 | 10 | 2 |
| 错误代码1−/− | 78 | 58 | 42 | 90 | 10 | 0 |
| 5′悬挑，互补 | | | | | | |
| 重量 | 65 | 43 | 57 | 60 | 40 | 0 |
| 错误代码1−/− | 66 | 42 | 58 | 60 | 35 | 5 |
| 3′悬挑，非补充 | | | | | | |
| 重量 | 94 | 0 | 100 | 63 | 31 | 6 |
| 错误代码1−/− | 82 | 0 | 100 | 65 | 14一 | 21一 |
对缺失质粒的子集进行测序，以确定DSB修复发生的频率，该修复机制利用断裂端之间的序列同源性（见补充材料中的表S3至S5）。在70%到90%的易出错的DSB修复事件中，无论末端是钝的还是有悬垂的，在断裂端都发现了短长度的微同源性（1到5个核苷酸）（表). 在WT和错误代码1−/−细胞。然而错误代码1−/−细胞导致与WT相关的碱基插入。这一观察结果与ERCC1-XPF被要求移除3′非同源皮瓣以创建可用于启动DNA合成的末端一致(74).
表3。
WT或WT修复后钝性、互补性和非互补性DNA末端的序列分析错误代码1−/−细胞
| DNA末端和基因型 | n个 | %添加核苷酸 | %微同源性介导 |
|---|
| 迟钝的 | | | |
| 重量 | 18 | 0 | 89 |
| 错误代码1−/− | 21 | 0 | 81 |
| 5′悬挑，互补 | | | |
| 重量 | 18 | 6 | 72 |
| 错误代码1−/− | 17 | 6 | 71 |
| 3′悬挑，非补充 | | | |
| 重量 | 30 | 37 | 80 |
| 错误代码1−/− | 31 | 10一 | 71 |
讨论
哺乳动物ERCC1-XPF参与DSB修复。
ERCC1-XPF是一种结构特异性核酸内切酶，在与单链DNA（3′）、缺口气泡结构和3′单链悬垂的连接处切割双链DNA(11). 这种活性对于去除NER中受损的DNA至关重要(74)以及用于创建可用于启动DNA合成的3′端，以取代切除的碱基。除了NER中的气泡基底外，ERCC1-XPF还切割干环结构(11)，交联Y结构(39)，和体外R环(78)并去除非同源序列的3′单链悬垂，否则会阻止HR(1,52,68). 还提出ERCC1-XPF切割D环(52)，富含G的端粒悬挑(88)和DNA ICL修复的中间产物(54). 这种皮瓣核酸内切酶活性可以促进DSB修复，特别是具有3′单链非补体悬垂或没有DNA合成和/或结扎所需的3′羟基的末端。事实上，ERCC1-XPF的直方图酿酒酵母（Rad10-Rad1）(22,32,58),拟南芥（AtErcc1-AtRad1p）(17,29)、和黑腹果蝇（DmERCC1-MEI-9）(24,61)确实有助于DSB修复并赋予对IR的抗性。在此，我们提供了体外、遗传和体内证据，证明这种功能在小鼠和人类细胞中是保守的。
ERCC1-XPF在DSB修复中的作用。
ERCC1-XPF缺陷细胞对交联剂极为敏感，并在交联损伤时积累DSB(54). 我们假设在ICL修复中，在DSB因复制停滞而形成后，需要ERCC1-XPF在DSB修复前切割交联损伤。在这里，我们为ERCC1-XPF在DSB修复中的独特作用提供了证据。ERCC1-XPF缺陷的小鼠和人类细胞对IR过敏（图。)类似于HR介导或NHEJ DSB修复中缺陷的细胞(77). 小鼠成纤维细胞（而非ES细胞）对IR敏感（图。). 这种细胞类型特异性敏感性模式与DNA-派克反恐精英NHEJ中有缺陷的突变系(25)但与之相反雷达54−/−HR中的细胞有缺陷(19). 这表明ERCC1-XPF可能参与DSB修复的终接机制，这种终接机制在分化细胞中比在ES细胞中更为常见。为了进一步支持这一点，SCE在辐照后显著升高错误代码1−/−MEF（表)，表明在没有ERCC1-XPF的情况下，HR介导的DSB修复是可能的。SCE的增加可能反映了HR在端接机制受损时优先修复DSB(85). 然而，ERCC1-XPF显然不是NHEJ核心机制的一部分，因为没有证据表明存在严重的联合免疫缺陷，这是NHEJ缺陷的一个病理学特征(87)，英寸错误代码1−/−或Xpf公司−/−老鼠(70,79)或XPF缺乏症患者(53). 此外，错误代码1−/−MEF对IR的敏感性低于DNA-派克反恐精英−/−或库86−/−无NHEJ的MEF（图。).
除了DSB外，IR还引起多种损伤(23). 因此，为了证实ERCC1-XPF缺陷细胞的红外敏感性至少部分是由于DSB修复缺陷所致，我们定量了γH2AX焦点，它是DSB的标记物(63)在IR后的细胞中。γH2AX病灶在辐照ERCC1-XPF缺陷的成纤维细胞中持续存在（图。)以及在经照射的ERCC1缺陷小鼠的肝细胞中（图。)与同类WT对照组相比，这与体外和体内缺乏ERCC1-XPF时受损的DSB修复一致。此外，辐照错误代码1−/−与WT细胞相比，MEF增加了间隙、断裂、碎片和径向结构（表). 这些染色体异常是DSB的结果(49)从而证明DSB修复中的缺陷错误代码1−/−细胞。有趣的是，在错误代码1−/−和WT ES细胞在暴露于IR后的任何时间点，与它们对IR缺乏敏感性相关。越来越多的证据表明同源重组对ES细胞的基因组稳定性至关重要(6,26,62)进一步表明HR发生在ERCC1缺陷细胞中。
ERCC1-XPF在DSB修复中的生物学意义。
单剂量的6 Gy IR对ERCC1亚型小鼠普遍是致命的（图。)，而2 Gy是亚致死的（数据未显示）。这种敏感性水平与DNA-PK的小鼠相似反恐精英删除了NHEJ的重要组成部分(41)尽管ERCC1-XPF在亚纯型菌株中的表达仅减少85%(84). 这确立了ERCC1-XPF在哺乳动物辐射防护中的重要作用。正如预期的那样，IR会导致ERCC1缺陷小鼠的肠绒毛丢失和骨髓细胞减少（图。). 此外，ERCC1缺陷小鼠出现肝小叶中心坏死，这是由IR后细胞碎片阻塞小静脉引起的(20). 肝脏病理学限制了患者的生命错误代码1−/−老鼠(72)，解释了错误代码1−/ΔDSB修复缺陷的小鼠在应激后造血干细胞功能和再生能力受损(55,64). 我们观察到错误代码1−/−老鼠(60)以及IR后的肠道（参见补充材料中的图S3）。因此错误代码1−/Δ小鼠出现IR可能不仅是由于未修复的DNA损伤导致细胞死亡/衰老增加，而且还导致受损组织再生能力降低。
虽然ERCC1低形态小鼠对IR的敏感性与DNA-派克反恐精英−/−老鼠比库86−/−老鼠(9,56).DNA-派克反恐精英−/−除了严重联合免疫缺陷外，小鼠没有自发表型(25,41)，而库86−/−除了免疫缺陷外，小鼠还表现出生长迟缓和进展性症状(82).错误代码1−/−小鼠的表型比任何一种都严重DNA-派克反恐精英−/−或库86−/−小鼠，包括生长迟缓、肝功能障碍、肾功能不全、表皮萎缩、造血受损、少肌症、后凸和神经退行性变(48,53,60,84)，使其不太可能表现为错误代码1−/−小鼠可完全归因于DSB修复缺陷。更有可能的是，这里记录的多个DNA修复途径中的联合缺陷，包括全球基因组和转录偶联NER、ICL修复和DSB修复，导致严重的错误代码1−/−小鼠，XFE早衰(53)以及最近确认的ERCC1患者(33).
ERCC1-XPF参与DSB的易出错、Ku-independent端连接。
ERCC1-XPF核酸内切酶促进DSB修复，并在体内对IR起保护作用。然而，哺乳动物细胞中DSB修复的两个主要机制HR和NHEJ在ERCC1-XPF缺陷细胞中是完整的。因此，以下问题仍然存在：这种核酸酶如何促进DSB修复？在酵母中，ERCC1-XPF的直系同源物Rad10-Rad1是两种容易出错的DSB修复机制所必需的：SSA(22,32,57)和MMEJ(45). Rad10-Rad1需要从断裂的3′端移除非同源序列，以允许DNA合成和/或连接。酵母中的MMEJ独立于HR蛋白Rad52和NHEJ蛋白Ku86，对IR的保护至关重要(45). 在雷达52;yku70型菌株，DSB修复容易出错，导致大量缺失并利用末端之间的短同源性(5). 最近，在哺乳动物中发现了一种不同于NHEJ的末端连接机制(87). 这种机制支持在没有NHEJ的情况下进行类开关重组，容易出错，并利用微同源性连接断端，类似于酵母中的MMEJ。线性化质粒和I-Sce-I诱导的基因组DSB在NHEJ缺陷细胞中修复，最显著的是Ku86，导致缺失和插入，并利用微同源性(27,35,71). 然而，当NHEJ存在时，该途径在哺乳动物中的生物学意义仍不确定。
我们的数据提供了一些证据，支持ERCC1-XPF有助于哺乳动物细胞末端连接的替代机制的结论。第一，错误代码1−/− 库86−/−相对于单个突变细胞，MEFs对IR过敏（图。)，类似于酵母(45). 此外，错误代码1−/− 库86−/−与仅NHEJ中有缺陷的细胞相比，细胞在低剂量IR下积累了更多的染色体畸变(库86−/−细胞；表). 此外，错误代码1−/− 库86−/−原代MEF增殖不良，即使在3%氧气条件下培养，也只能存活到第5代（图。). 这些数据与ERCC1-XPF参与DSB修复机制的结论一致，该修复机制与Ku86无关，对抵抗IR和氧化应激非常重要，类似于Rad10-Rad1在酵母中的作用。
支持ERCC1-XPF在MMEJ中作用的第二条证据来自体外终接试验。钝形5′或3′悬挑的连接在错误代码1−/−或库86−/−电池与WT电池进行比较（参见补充材料中的图S5）。然而，端部与悬挑的连接在错误代码1−/− 库86−/−细胞，表明在这些双突变细胞中失去了两种不同的末端连接机制。错误代码1−/−细胞在不能直接结扎的连接端有缺陷，即末端有3′非互补悬垂，但没有钝端或末端有5′互补悬垂。在缺乏ERCC1-XPF的情况下，非同源3′悬链的连接导致非常大的缺失（表)，类似于酵母突变体(45). 此外，在错误代码1−/−细胞，核苷酸在关节处的插入显著减少（表)与该核酸酶在创造可启动DNA合成的3′端方面的保守作用一致(58). 此外，在末端连接中，微同源性的使用有减少的趋势错误代码1−/−与WT电池相关的电池（表). Rad1的缺失在很大程度上降低了酵母中的MMEJ，但并没有消除MMEJ。这表明酵母中存在多余的3′瓣核酸内切酶(45)因此也可能在哺乳动物中。最近，研究表明端粒融合可能通过Ku依赖性末端连接机制发生(7). 因此，ERCC1-XPF参与这种替代性末端连接机制也得到了以下事实的支持：ERCC1-XP修剪未受保护的端粒悬挑，通过末端连接实现端粒融合(88).
总之，这些数据证明了ERCC1-XPF核酸酶在Ku86依赖的DSB修复机制中的新功能。此外，我们的数据，结合最近的一份报告，确立了ERCC1-XPF在SSA中的作用(2)，表明哺乳动物DSB修复中的Rad10-Rad1活性是保守的。数据还表明，即使在NHEJ和HR修复可能发生时，DSB的替代端部连接对于保护DSB也很重要。
