癌症研究。作者手稿；PMC 2009年2月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：PMC2519173型
NIHMSID公司：NIHMS59974
癌相关基质成纤维细胞促进胰腺肿瘤进展
,1 ,1 ,2 ,2 ,1 ,1 ,2 ,1和2
罗莎·F·黄
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心外科肿瘤系，德克萨斯州休斯顿
托德穆尔
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心外科肿瘤系，德克萨斯州休斯顿
Thiruvengadam Arumugam公司
2德克萨斯大学安德森癌症中心癌症生物学系，德克萨斯州休斯顿
维贾亚·拉马钱德兰
2德克萨斯大学安德森癌症中心癌症生物学系，德克萨斯州休斯顿
基思·D·阿莫斯
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心外科肿瘤系，德克萨斯州休斯顿
阿曼多·里维拉
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心外科肿瘤系，德克萨斯州休斯顿
宝安记
2德克萨斯大学安德森癌症中心癌症生物学系，德克萨斯州休斯顿
道格拉斯·埃文斯
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心外科肿瘤系，德克萨斯州休斯顿
克雷格·D·洛格斯顿
2德克萨斯大学安德森癌症中心癌症生物学系，德克萨斯州休斯顿
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心外科肿瘤系，德克萨斯州休斯顿
2德克萨斯大学安德森癌症中心癌症生物学系，德克萨斯州休斯顿
转载请求：罗莎·F·黄，德克萨斯大学M.D.安德森癌症中心外科肿瘤系，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号444室，邮编77230-1402。电话：713-563-1873；传真：713-745-1462；电子邮件：gro.nosrednadm@gnawhr公司 摘要
胰腺癌的特征是肿瘤相关基质的密集背景来源于丰富的胰腺星状细胞。本研究的目的是确定人类胰腺星状细胞（HPSC）对胰腺肿瘤进展的影响。从胰腺癌切除标本中分离出HPSC，并用端粒酶和SV40大T抗原永生化。HPSC条件培养基（HPSC-CM）对在体外对两种胰腺癌细胞系的增殖、迁移、侵袭、软黄集落形成以及在吉西他滨或放射治疗的情况下的存活率进行了测定。通过将HPSCs与癌细胞联合注射并分析其生长和转移，在原位胰腺癌小鼠模型中检测HPSCs对肿瘤的影响。HPSC-CM剂量依赖性地增加BxPC3和Panc1肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和集落形成。此外，吉西他滨和放射治疗对HPSC-CM治疗的肿瘤细胞效果较差。原位模型中肿瘤细胞与HPSCs共注射导致原发性肿瘤发生率、大小和转移增加，这与HPSC的比例一致。HPSC产生可溶性因子，刺激与胰腺癌细胞增殖和存活相关的信号通路，肿瘤中HPSC的存在会增加这些细胞的生长和转移。这些数据表明星状细胞在支持和促进胰腺癌方面具有重要作用。HPSC衍生因子的鉴定可能会导致针对胰腺癌的新的基质靶向治疗。
介绍
胰腺导管腺癌具有高度恶性表型，对目前可用的系统治疗耐药；发病率几乎等于死亡率(1). 胰腺癌的特点是其组织中存在密度极高的促结缔组织增生性浸润，这在实体肿瘤中是独特的，可能在分子水平上阻碍有效的系统治疗。重要的是，在许多肿瘤类型中，局部微环境被认为是癌症发生、发展和转移过程中的积极参与者(2,三). 在许多实体肿瘤中，基质在促进肿瘤增殖、侵袭、转移和化疗耐药方面的作用越来越重要(2,4). 然而，尽管胰腺癌具有丰富的促结缔组织增生反应，但肿瘤相关基质在胰腺癌中的作用尚不清楚。
胰腺星状细胞是肌纤维母细胞样细胞，最初被确定为慢性胰腺炎纤维化的来源(5)现在被认为与胰腺癌相关的致密基质有关(6). 胰腺星状细胞与肝星状细胞相似，是肝纤维化的重要效应细胞(7–9). 胰腺和肝星状细胞的波形蛋白、结蛋白和α平滑肌肌动蛋白（αSMA）染色均呈阳性，细胞质中含有维生素A——储存脂滴，表明它们既不是成纤维细胞也不是平滑肌细胞(5). 胰腺星状细胞在胰腺癌肿瘤-基质相互作用中的确切作用尚未明确，部分原因是难以获得足够数量的原代HPSC用于研究。一旦分离，HPSC在经历衰老之前只能传代有限的次数。大多数使用胰腺星状细胞的研究都使用了从大鼠分离的细胞(10,11)使用胰腺癌原代HPSC的研究相对较少(12,13). 详细描述胰腺星状细胞在人类胰腺癌进展中的作用将为间质定向治疗提供一组潜在靶点。此外，胰腺癌相关基质因子也可能作为肿瘤生物标志物和癌症预防的可能靶点。
本研究的目的是研究原发性HPSC对胰腺肿瘤进展和治疗反应的影响在体外以及在胰腺癌的原位模型中。为此，我们从切除的手术标本中分离出人类腺癌相关胰腺星状细胞。这些细胞被永生化并检测其对胰腺癌细胞的影响在体外和体内我们发现星状细胞具有多种促进胰腺癌进展的作用。
材料和方法
细胞培养
BxPC3和Panc1胰腺肿瘤细胞取自美国类型培养物收集。肿瘤细胞在37°C、5%CO的湿润环境中，在含有10%FCS、2 mmol/L谷氨酰胺和青霉素/链霉素（均来自Invitrogen）的DMEM（Invitrogen）中培养2.
人胰腺星状细胞（HPSC）是通过外生长方法制备的(12). 新鲜组织取自德克萨斯大学安德森癌症中心接受初级外科手术切除的患者的残余胰腺癌标本。所有人体样本均根据德克萨斯大学安德森癌症中心机构审查委员会的政策和实践获得。简单地说，将肿瘤样本切碎，接种在含有15%FCS/DMEM的六孔板中，我-谷氨酰胺（2 mmol/L）、青霉素/链霉素和两性霉素。大约5天后，细胞能够从组织团块中生长出来。培养基每3天更换一次。所有细胞在5%CO的增湿环境中保持在37°C2当HPSCs生长汇合时，对细胞进行胰蛋白酶化并以1:3传代。
通过免疫组织化学法测定αSMA、波形蛋白和结蛋白的细胞纯度，以及形态学（纺锤形细胞，胞质延伸）和油红O阳性染色（可见脂质内含物）。使用的抗体为抗人αSMA（克隆1A4）、抗波形蛋白（克隆V9）和抗人结蛋白（克隆D33；均来自DAKO）。对于使用非永生化初级HPSC的分析，使用了第5代至第12代。
使用一种来源于一名术前未接受任何治疗的患者胰腺肿瘤的HPSC系使HPSC永生化。通过转染293个细胞，制备带有人类端粒酶（hTERT）或SV40大T抗原（TAg）的慢病毒载体。含有TAg（pHIV7-CNPO-TAg）和hTERT（pHIV-7-CNPO-hTERT）的质粒已被详细描述(14)由Jiing-Kuan Yee博士（加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城国家医疗中心）提供。48小时后，收集病毒上清液并添加到HPSC中。用1至3 mg/mL G418筛选携带hTERT或SV40-T的HPSC 3周（Invitrogen）。通过Western blotting（Santa Cruz Biotech）证实存在SV40-T。如上所述，确认αSMA和波形蛋白的表达(). 为了量化生长速度，细胞在六孔板中生长，每2天计数一次。倍增时间计算为（0.301×Δt吨)/（日志10 无0)，式中Δt吨表示以小时为单位的时间差，以及N个0和N个表示初始和结束时间点的单元格数。
HPSC的永久化。原发性HPSC暴露于携带hTERT和SV40-TAg的慢病毒载体。hTERT和SV40-TAg转导的HPSCsα-SMA的免疫组织化学染色(A类)和波形蛋白(B类).C类、原代HPSCs、用SV40-TAg转导的HPSCs和用hTERT和SV40-TAg转导的HPSCs的生长曲线。携带hTERT和Tag的HPSCs在超过100代时没有衰老迹象。
条件培养基的制备
初级和永生化的HPSC在20厘米内生长到70%至80%的汇合处2DMEM/10%FCS中的盘子。将培养基更换为无血清DMEM，细胞培养48 h。收集培养基，在1000×克将上清液用Centricon YM3过滤器（Millipore）浓缩10分钟。浓缩HPSC条件培养基（HPSC-CM）的蛋白质含量通过Bradford试验（Bio-Rad Laboratories）测定，等分样品在使用前储存在−80°C。对于使用HPSC-CM的所有功能分析，使用永生化和非永生化HPSC的条件培养基，并产生类似的结果。
增殖试验
将BxPC3和Panc1细胞以3000个/孔的速度接种在96周板中，并在DMEM/10%FCS中培养。培养基改为无血清DMEM，用于过夜培养。以不同浓度（0.1、0.25、0.5、1.0μg/μL）向细胞中添加浓缩HPSC-CM；在对照井中添加无血清DMEM。根据制造商的说明，在读取分光光度读数前1 h，使用MTS试剂（Promega）在24、48和72 h对细胞生长进行分析。
侵入性分析
为了研究细胞侵袭性，使用了BioCoat Matrigel-coated侵袭室（BD Biosciences）。简而言之，2×104将在500μL无血清培养基中的BxPC3或Panc1细胞加入上室。将含有10%FCS或浓缩HPSC-CM（0.1、0.5和1.0μg/μL）的培养基添加到下室中。将无血清培养基添加到对照井的下室。细胞在37°C和5%的CO中侵入Matrigel 48小时2大气。用棉签清除膜上表面的非侵入细胞。细胞在甲醇中固定，苏木精染色，并风干。在放大×20倍的条件下，对每个膜的三个相邻显微镜视野中的侵入细胞进行计数。
软黄菌落形成
将BxPC3或Panc1细胞置于24孔板（104在含有HPSC-CM、无血清培养基或含有10%FCS的DMEM的0.6%琼脂（Noble琼脂，Becton Dickinson）底层上使用0.3%琼脂。每天在顶层补充HPSC-CM。细胞培养15天，每个孔在10个随机字段中计数菌落。
蛋白质印迹分析
为了评估有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Akt通路在HPSC-CM存在下的激活，BxPC3细胞在6孔板中以10%DMEM至70%的汇合度生长，血清饥饿过夜，并用HPSC-CM（1μg/μL）处理0至120分钟。细胞用PBS洗涤两次并溶解。制备细胞裂解物并通过SDS-PAGE分离，然后转移到硝化纤维素。在室温下将膜在0.1%吐温的5%脱脂牛奶中封闭1小时，清洗，并在4°C下与以下抗体之一孵育过夜：总p44/42，磷酸化p44/41（Thr202/提尔204)、Akt或磷酸化Akt（Ser473)全部来自Cell Signaling Technology。用相应的二级Alexa Fluor 680结合抗体进行免疫检测。用奥德赛荧光成像仪（Li-Cor Biosciences）检测荧光。
化疗和放疗的反应
将BxPC3细胞接种在8个培养箱的载玻片中（1×105每口井）在DMEM中使用10%FCS。培养过夜后，清洗细胞，将培养基改为DMEM+10%FCS，添加或不添加HPSC-CM（1μg/μL）。用100μmol/L吉西他滨（礼来）或单独载体处理细胞。48h后，用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析凋亡细胞（ApopTag，Chemicon），细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。使用Simple PCI软件（Compix，Inc.）对细胞进行计数。凋亡细胞比率计算为（TUNEL阳性细胞数/DAPI染色细胞核数）×100。实验重复进行，每种情况统计10个随机字段。
HPSC-CM对肿瘤细胞对辐射反应的影响以类似的方式进行。在添加HPSC-CM（或DMEM和10%FCS用于对照孔）后，细胞暴露于0或100 Gy电离辐射。培养24小时后，使用Magic Red试剂盒（免疫化学技术公司）检测caspase激活，并用DAPI染色细胞核。使用Simple PCI软件（Compix，Inc.）计算凋亡细胞百分比和细胞核总数。实验重复进行，每种情况统计10个随机字段。
胰腺癌原位模型
所有动物实验均由得克萨斯大学M.D.安德森动物护理和使用委员会审查和批准。本实验室先前描述了一种使用标有萤火虫荧光素酶（BxPC3-FL）的BxPC3胰腺癌细胞建立的胰腺癌原位裸鼠模型(15). 所有小鼠被分为接受胰腺内注射(一)单独使用BxPC3 FL，0.5×106或1×106每只小鼠；(b条)BxPC3-FL与永生化HPSC，肿瘤与基质的比率不同（1:1、1:1或1:5）；或(c（c）)仅永生化HPSC（0.5×106或1×106). 所有细胞悬液，包括BxPC3和HPSC的混合物，均注入50μL体积的HBSS中。每周进行生物发光成像，以跟踪BxPC3细胞的荧光素酶信号。处死小鼠，采集并测量肿瘤。
统计分析
使用GraphPad Prism（GraphPat）进行统计分析。使用双尾Student’s进行比较t吨检验和显著性差异定义为P（P）< 0.05. 数据显示为平均值±SE。
结果
HPSC的原代培养和永生化
从新鲜人胰腺癌手术标本的残余组织中分离出胰腺星状细胞，并通过αSMA和波形蛋白的免疫组织化学染色确认其身份（数据未显示）。在慢病毒转移hTERT和SV40-TAg并在G418中选择后，HPSCs继续表达αSMA和波形蛋白(). hTERT和SV40-TAg永生化细胞的HPSCs生长速度最高，而SV40-TAg单独或非永生化HPSCs转导的细胞生长速度最高（倍增时间分别为12小时、42小时和113小时）。用hTERT和SV40-Tag永生化的HPSCs在>100代时没有衰老迹象。单独使用SV40 Tag或同时使用hTERT和SV40-Tag永生化的HPSC与非永生化HPSC相比，其形态学没有显著差异（数据未显示）。
来自HPSC的条件培养基刺激胰腺癌细胞在软琼脂中的增殖、侵袭和集落形成
与无血清培养基对照组相比，将永生化HPSC的条件培养基（表达SV40 Tag和hTERT）添加到BxPC3细胞中可诱导肿瘤细胞增殖增加(). 在0.5μg/μL（对照组的301.7%±43.1%；P（P）< 0.005). 最高剂量HPSC-CM（1μg/μL）的细胞增殖相当于含有10%FCS的培养基。Panc1细胞对HPSC-CM更敏感，因为在低至0.25μg/μL的浓度下，观察到增殖显著增加，呈剂量依赖性。HPSC-CM对Panc1细胞增殖的最大作用与在BxPC3细胞中观察到的作用相似，同样与10%FCS的作用相同().
HPSC-CM对胰腺癌细胞表型的影响。将HPSC的CM（μg/μL）加入到BxPC3或Panc1胰腺肿瘤细胞中。A类MTS法检测48h后肿瘤细胞增殖。B类，采用改良的Boyden小室法在48小时时评估肿瘤细胞的侵袭性。C类，在添加HPSC-CM后15天测定肿瘤细胞在软琼脂中形成集落的能力。D类，肿瘤细胞增殖是在存在来自未固定化HPSC的条件培养基的情况下测量的。柱，三个实验的平均值。*，P（P）<0.05和**，P（P）<0.005与无血清培养基(SFM公司)控件编号，P（P）<0.0005与HPSC-CM 1.0μg/μL相比。
HPSC-CM还诱导BxPC3和Panc1细胞迁移和侵袭的剂量依赖性增加(; 细胞迁移数据未显示）。低至0.1μg/μL HPSC-CM可诱导BxPC3侵袭[3.4±1.78对0.4±0.51；P（P）< 0.0001]. 随着HPSC-CM剂量的增加，BxPC3侵袭的刺激增加，最大值为21.5±6.2。与BxPC3相比，HPSC-CM诱导Panc1细胞的细胞迁移增加更大，与其对细胞增殖的影响相似。与无血清培养基相比，0.1μg/μL HPSC-CM的最小剂量刺激了Panc1侵袭性增加19倍(P（P）< 0.0001). 1.0μg/μL HPSC-CM的最大剂量导致Panc1的侵袭水平高于含有10%FCS的培养基（48±15 vs 28.3±3.4；P（P）< 0.001).
为了确定基质成纤维细胞分泌的因子是否影响肿瘤细胞的凤尾鱼非依赖性生长，在HPSC-CM存在或不存在的情况下进行软琼脂集落形成试验。与无血清培养基对照组相比，添加HPSC-CM后，BxPC3细胞在软琼脂中形成更多的集落(; 0.5μg/μL HPC-CM为146.7±7.6，1μg/μL HPC-CM为178.7±13.6，无血清培养基为105.3±5.5；P（P）<0.005）。同样，以剂量依赖性的方式添加HPSC-CM后，Panc1细胞在软琼脂中形成了更多的菌落（无血清培养基为144±6.6，0.1μg/μL HPSC-CM为171±11.5，0.25μg/µL HPSC-CM为209±12.7，0.5μg/¦ΜL HPSC-CM为261±23.1，1.0μg/ΜL-HPSC-CM.为371±20.2；P（P）<0.005，与无血清培养基相比）。
来自非永生化HPSC的条件培养基也以剂量依赖性的方式刺激肿瘤细胞增殖，BxPC3和Panc1肿瘤细胞系的增殖量为0.25至1.0μg/μL(). 来自非永生化HPSCs的HPSC-CM对肿瘤细胞迁移、侵袭和软琼脂集落形成的刺激作用与来自永生化HPSC的HPSC-CM相似，但未显示。
胰腺星状细胞抑制化疗和放疗对肿瘤细胞的影响
在吉西他滨（100μmol/L）处理的BxPC3细胞中加入HPSC-CM后，细胞凋亡受到抑制（无血清培养基为38.9±3.1%，HPSC-CM为9.4±1.1%；P（P）< 0.0001;). 加入或不加入HPSC-CM的吉西他滨对细胞总数无显著影响。
用吉西他滨（100μmol/L）处理BxPC3细胞，加入或不加入HPSC的条件培养基（1μg/μL）48小时。A类TUNEL法检测细胞凋亡，DAPI染色细胞核。B类，在每种情况下的10个随机字段中测定凋亡细胞的百分比。SFM公司，无血清培养基。
同样，暴露于100-Gy辐射后，经HPSC-CM（1μg/μL）处理的BxPC3细胞与在10%DMEM中生长的细胞相比，凋亡较少（29.9%±6.9对66.8±7.8；P（P）< 0.01;). 未暴露于辐射的细胞在有无HPSC-CM的情况下，凋亡没有差异（未显示）。与不含HPSC-CM的细胞相比，有HPSC-CM照射的细胞活核总数较高（210.8±13.6对53.8±5.6；P（P）< 0.0001;).
HPSC的条件培养基保护胰腺癌细胞免受辐射诱导的凋亡。在含有10%FCS的培养基或来自HPSC的条件培养基（1μg/μL）中，用100 Gy的辐射处理BxPC3细胞。24小时后，对细胞进行caspase激活分析(A类)和凋亡细胞百分比(B类)和原子核总数(C类)进行了计算。控制DMEM，10%FCS；X射线衍射，辐射处理。*，P（P）与对照组相比<0.01；**，P（P）<0.0001与对照组相比。
胰腺星状细胞分泌因子刺激肿瘤细胞MAPK和Akt通路的激活
为了确定哪些信号通路可能参与HPSCs的促瘤作用，通过Western blotting检测经HPSC-CM处理的BxPC3肿瘤细胞中MAPK和Akt的激活。与对照细胞相比，用HPSC-CM处理的细胞中磷酸化Erk1/2从5分钟开始增加，并持续到处理后120分钟(). 同样，在刺激后5分钟添加HPSC-CM激活Akt，并持续60分钟。与无血清对照组相比，HPSC-CM刺激15分钟时Erk1/2激活增加43%，5分钟时Akt激活增加125%。在Panc1细胞中观察到类似结果（数据未显示）。
通过Western blotting分析不同时间点经HPSC-CM（1μg/μL）处理的BxPC3细胞蛋白裂解物的Erk1/2和Akt活化(A类)并通过密度测定进行量化。对照细胞仅用无血清培养基处理。B类，与无血清对照组比较磷酸化Erk1/2和Akt水平的变化。
HPSCs与肿瘤细胞共注射诱导肿瘤进展和转移体内胰腺癌原位模型
胰腺腺癌因其重要的纤维化成分而臭名昭著(16)，这在使用注射培养的人类肿瘤细胞的胰腺癌原位裸鼠模型中没有很好地概括。因此，评估基质成纤维细胞对胰腺癌生长的作用体内，我们将HPSC与BxPC3肿瘤细胞联合注射。为了实时跟踪肿瘤进展，用萤火虫荧光素酶标记BxPC3细胞，并如前所述测量生物发光(15,17). 联合注射中HPSC相对于肿瘤细胞的比例从1:0到1:5不等，这反映了人类胰腺腺癌中常见的更丰富的基质。
当小鼠同时注射HPSC和肿瘤细胞时，肿瘤形成的发生率增加。在注射等量肿瘤和基质细胞（0.5×10）的组中6细胞/小鼠），只有57%的小鼠在胰腺中形成肿瘤(). 然而，在注射了5倍于肿瘤细胞数量的基质细胞的组中（肿瘤与基质的比例为1:5），胰腺肿瘤的形成率为100%。当小鼠单独接受HPSCs（0.5或1×10）时，未发生肿瘤6每只小鼠）。
在胰腺癌原位裸鼠模型中，HPSCs与BxPC3肿瘤细胞共注射会导致肿瘤发生率、转移和肿瘤大小增加。HPSC注射BxPC3细胞（0.5×106或1×106)在不同的肿瘤/间质比率中。8周时，处死小鼠并观察原发性肿瘤发病率(A类)和转移(B类)被量化。C类，对胰腺肿瘤进行称重，并显示各组中代表性小鼠的荧光素酶信号。D类，H&E染色显示注射0.5×10的小鼠胰腺内无肿瘤6仅BxPC3细胞(左边)但证实了联合注射BxPC3和HPSCs（胰腺、，中心和腹膜转移，正确的). 每个实验重复两次，并显示所有结果的摘要。*，P（P）与肿瘤/间质比率1:0或0:1相比，<0.01。
接受BxPC3细胞的小鼠均未达到0.5×106每只小鼠都会发生胰腺肿瘤，但当BxPC3细胞数量增加到1×10时643%的小鼠发生肿瘤。因此，HPSC基质成纤维细胞的存在有助于肿瘤的形成，尤其是在肿瘤细胞数量较少的情况下。当HPSCs与肿瘤细胞数量相等或更多时，肿瘤形成的发生率比单独的肿瘤细胞增加，且发生率与较高的肿瘤细胞数量（1×106)对于每个给定的肿瘤与基质比率。这些结果表明，HPSCs可以补偿较低的肿瘤细胞数量，并可以促进肿瘤的发生，从而导致相当于较高肿瘤细胞数量的肿瘤发展。
有趣的是，随着注射HPSC的数量增加，发生远处转移的小鼠比例也增加。肿瘤细胞数低（0.5×106每只小鼠），没有一只小鼠发生转移(). 当相同数量的肿瘤细胞与HPSC混合时，转移的发生率随基质成纤维细胞比例的增加而呈剂量依赖性增加（分别为14.3%和40%；肿瘤与基质的比例分别为1:1和1:5）。转移瘤主要为腹腔内转移、淋巴转移和肝脏转移；其他器官均未见肉眼可见或IVIS成像。肿瘤细胞数较高时（1×106每只小鼠的转移率高于起始数较低的转移率，但随着星状细胞的存在，转移率以浓度依赖的方式进一步增加。正如预期的那样，在只接受HPSC的小鼠中没有发现转移病灶。
基质成纤维细胞的存在不仅影响肿瘤发生率，也影响肿瘤大小。随着HPSCs相对于肿瘤细胞的比例增加，包括肿瘤在内的胰腺总重量增加(). 在只接受肿瘤细胞（0.5×10）的小鼠中6每只小鼠的胰腺重量为0.22±0.01 g，与仅接受HPSC的小鼠的胰腺体重没有显著差异。随着混合液中HPSC比例的增加，胰腺重量增加[0.46±0.18 vs.0.82±0.22 g；肿瘤与基质比率分别为1:1 vs.1:5（平均值±SE）]。肿瘤与基质比率为1:5的组的平均胰腺重量与仅含肿瘤细胞的组有显著差异(P（P）< 0.05). IVIS信号反映了肿瘤负荷的增加（各组在8周时的代表性图像如). H&E染色证实了原发性和转移性肿瘤的组织学().
讨论
多年来，局部肿瘤微环境对肿瘤进展的重要性得到了承认，并在一些综述中得到了强调(2,三,18). 最近有人描述了肿瘤相关基质在乳腺癌和前列腺癌中的作用(4,19–27); 然而，与此相反，基质对胰腺癌生长和转移的可能作用尚不清楚。这尤其令人遗憾，因为胰腺癌的基质特别丰富。使用一种新的人类肿瘤相关星状细胞模型，我们发现来自HPSC的条件培养基以剂量依赖性的方式刺激胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和锚定物非依赖性生长。此外，来自HPSC的条件培养基抑制肿瘤细胞对化疗和辐射的反应。这些观察结果表明，可溶性因子是由星状细胞产生的，可以刺激胰腺癌细胞的增殖和存活。我们还观察到，在原位胰腺癌模型中，联合注射星状细胞会增加肿瘤发生率、生长和转移。综上所述，这些研究表明胰腺癌丰富的基质在该疾病的侵袭性中起着重要作用。
此前，研究胰腺癌相关基质成纤维细胞的相关细胞模型尚不存在。尽管胰腺星状细胞已被确定为慢性胰腺炎和胰腺癌中负责基质产生的细胞(5,6,28)由于可用的新鲜肿瘤标本相对较少，且原代细胞的寿命有限，很少有研究使用人胰腺癌样本中的胰腺星状细胞。老鼠的不朽(10)和人类(29)星状细胞以前被发现是有用的，因为原始细胞生长缓慢，并在10到15代后最终衰老。我们的研究是首次报道胰腺癌来源的永生化原发性HPSC的应用。以往对其他实体瘤的研究表明，肿瘤来源的基质细胞与正常组织之间存在表型差异(23). 因此，这些肿瘤衍生细胞是研究胰腺癌相关基质成纤维细胞作用的最相关的细胞模型。
我们发现HPSCs对胰腺癌的影响具有剂量依赖性。体外，这表现为条件培养基效应的直接浓度依赖性。体内肿瘤与基质的比例至少为1:1或更高，导致肿瘤生长和转移的增加最为显著。与肿瘤细胞相比，基质细胞的比例更高，这与人类胰腺癌的组织学外观一致，其中促结缔组织增生性基质相对于肿瘤上皮细胞极其丰富(16). 这是首次在胰腺癌原位模型中联合注射HPSC和癌细胞的研究；然而，其他研究人员也发现，胰腺星状细胞的存在会增加皮下移植模型中胰腺癌细胞的生长(12,30,31).
其他研究小组认为实体肿瘤的广泛基质成分会影响肿瘤对化疗的反应(32,33). 在目前的研究中，我们已经证实了这一假设。我们观察到HPSC介导的吉西他滨和辐射对胰腺癌细胞反应的抑制。有趣的是，Ohuchida等人(34)还发现，基质成纤维细胞的放射治疗比未经辐射的成纤维细胞更能增加胰腺癌细胞的侵袭性。因此，通过包括基质对胰腺癌的作用，我们联合注射HPSC和胰腺肿瘤细胞的异种移植模型可能是一种比以前单独注射肿瘤细胞的移植模型更具临床相关性的胰腺癌模型。
用星状细胞条件培养液处理胰腺癌细胞后，其存活率增加的机制尚不明确。我们观察到，这种治疗导致增殖相关（Erks）和生存相关（Akt）通路的激活；这些过程可能由胰腺星状细胞分泌的白细胞介素-1β和转化生长因子-β介导(35). 通过与CFPAC1胰腺癌细胞共培养的基质成纤维细胞的基因表达谱分析，确定了可能介导肿瘤-基质相互作用的其他候选分子(36). 在确定的基因中，环氧化酶-2当一起培养时，在癌细胞和成纤维细胞中都显著增强，并且显示出介导CFPAC1细胞的侵袭。相反，其他基质衍生因子可能抑制肿瘤生长。Sato等人(37)发现SPARC在胰腺癌基质成纤维细胞中过度表达，外源性SPARC降低胰腺癌细胞的增殖在体外因此，肿瘤和间质成纤维细胞之间的相互作用是相当复杂的，需要进一步的研究来积极确定这些相互作用中涉及的因素和信号机制。
本研究中的另一个重要观察结果是，当注射的癌细胞数量有限时，HPSC的存在会增加肿瘤形成的发生率。星状细胞的包涵体允许注射少量的癌细胞，否则无法形成肿瘤。这支持了星状细胞提供微环境对胰腺癌细胞特别有利的假设。基质成纤维细胞可能与胰腺癌干细胞相互作用，Li等人最近对此进行了描述(38). 肿瘤血管系统是肿瘤微环境的另一个重要组成部分，最近研究表明它影响脑癌干细胞（nestin）的数量+和CD133+;参考39). 因此，靶向癌症干细胞的“小生境”或独特的微环境可能是一种有效的治疗策略。这种作用的机制尚不完全清楚，但观察结果表明星状细胞在肿瘤发生中起着重要作用。
目前的研究仅限于从单个胰腺癌患者分离的单个HPSC株。如前列腺癌所示，来自不同个体的基质成纤维细胞的作用可能不同(40). 我们的实验室已经从其他几个胰腺癌患者中分离出HPSC，但这些还没有被永久化。本研究的另一个潜在局限性是在体外实验。人们越来越认识到，肿瘤和基质细胞的细胞形态和行为的二维模型与三维模型有显著差异(20,41–43). 在三维培养中，HPSC可能表达我们研究中未发现的基因，无论是单独培养还是与肿瘤细胞共培养。最后，我们的研究侧重于癌相关成纤维细胞作为与肿瘤细胞相互作用的唯一基质元素。然而，已知基质中的许多其他细胞类型会影响肿瘤细胞，其中研究得最好的是构成血管室的内皮细胞和周细胞。基质中的其他细胞类型，如免疫细胞(44)和脂肪细胞(45)也与肿瘤细胞相互作用，介导恶性行为。因此，一个与人体胰腺癌更具生理相关性的模型是一个包含所有基质细胞类型以及三维环境中肿瘤细胞的模型，该模型是我们实验室积极研究的主题。
总之，我们的数据提供了证据，基质成纤维细胞和肿瘤细胞相互作用，促进胰腺癌的肿瘤进展。基质也会损害肿瘤细胞对化疗和放疗的反应。此外，在胰腺癌原位模型中，基质成纤维细胞促进了肿瘤的生长、转移和起始。我们的实验室目前正在研究几种与胰腺癌相关的基质特异性因子，我们希望阐明这些分子的具体作用机制。根据这些信息，以胰腺癌基质为靶点不仅可以有效治疗原发肿瘤和转移瘤，还可以在预防肿瘤发展方面发挥作用。这些星状细胞衍生因子的身份及其作用机制是正在进行的研究的主题，并可能导致针对胰腺癌微环境的新疗法。
致谢
拨款支持：国家胰腺基金会、消化道外科学会职业发展奖、Topfer基金会（R.F.Hwang）和NIH拨款R01DK052067-08（C.D.Logsdon）。
参考文献
1Evans DB、Abbruzzese J、Willett C.胰腺癌。收录人：Devita V Jr、Hellman S、Rosenberg S，编辑。癌症：肿瘤学原理与实践。费城：利平科特；2001年，第1126–61页。[谷歌学者] 2Liotta LA，Kohn EC。肿瘤-宿主界面的微环境。自然。2001;411:375–9.[公共医学][谷歌学者] 三。菲德勒IJ。器官微环境与癌症转移。区别。2002;70:498–505.[公共医学][谷歌学者] 4De Wever O，Mareel M.组织基质在癌细胞侵袭中的作用。病理学杂志。2003;200:429–47.[公共医学][谷歌学者] 5Apte MV，Haber PS，Applegate TL，等。大鼠胰腺周星状细胞的鉴定、分离和培养。内脏。1998;43:128–33. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Apte MV，Park S，Phillips PA，等。胰腺癌中的促结缔组织增生反应：胰腺星状细胞的作用。胰腺。2004;29:179–87.[公共医学][谷歌学者] 7Blomhoff R，Wake K。肝窦周星状细胞：在视黄醇代谢和纤维化中的重要作用。美国财务会计准则委员会J。1991;5:271–7.[公共医学][谷歌学者] 8de Leeuw AM、McCarthy SP、Geerts A、Knook DL。在培养物中纯化的大鼠肝脏脂肪储存细胞分裂并含有胶原蛋白。肝病学。1984;4:392–403.[公共医学][谷歌学者] 9Yokoi Y，Namihisa T，Kuroda H，等。脂肪储存细胞（Ito细胞）结蛋白的免疫细胞化学检测肝病学。1984;4:709–14.[公共医学][谷歌学者] 10Sparmann G、Hohenadl C、Tornoe J等。永生化大鼠胰腺星状细胞的生成和表征。美国生理学杂志胃肠病学肝病生理学。2004;287：G211–9。[公共医学][谷歌学者] 11Phillips PA、McCarroll JA、Park S等。大鼠胰腺星状细胞分泌基质金属蛋白酶：对细胞外基质周转的影响。内脏。2003;52:275–82. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Bachem MG、Schunemann M、Ramadani M等。胰腺癌细胞通过刺激星状细胞的增殖和基质合成而诱导纤维化。胃肠病学。2005年；128:907–21.[公共医学][谷歌学者] 13Erkan M，Kleeff J，Reiser C，等。壶腹周围肿瘤术前急性胰腺炎：外科治疗的意义。消化。2007;75:165–71.[公共医学][谷歌学者] 14Kowolik CM、Liang S、Yu Y、Yee JK。人肾近端小管上皮细胞的Cre介导的可逆永生化。致癌物。2004;23:5950–7.[公共医学][谷歌学者] 15Amos K、Moore T、Arumugam T、Logsdon C、Hwang RF。胰腺星状细胞促进胰腺癌的恶性潜能。美国癌症研究协会第97届年会；华盛顿特区，2006年。[谷歌学者] 16Seymour AB、Hruban RH、Redston M等。胰腺癌的等位基因型。癌症研究。1994;54:2761–4.[公共医学][谷歌学者] 17Arumugam T、Simeone DM、Van Golen K、Logsdon CD。S100P促进胰腺癌生长、存活和侵袭。临床癌症研究。2005年；11:5356–64.[公共医学][谷歌学者] 18Kallui R，Zeisberg M.癌症中的成纤维细胞。Nat Rev癌症。2006;6:392–401.[公共医学][谷歌学者] 19Park CC，Bissell MJ，Barcellos-Hoff MH。微环境对恶性表型的影响。今天的Mol Med。2000;6:324–9.[公共医学][谷歌学者] 20Weaver VM，Petersen OW，Wang F，等。三维培养中人类乳腺细胞恶性表型的逆转体内通过整合素阻断抗体。细胞生物学杂志。1997;137:231–45. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Shekhar MP、Werdell J、Santner SJ、Pauley RJ、Tait L.乳腺基质在乳腺上皮生长和分化中起主导调节作用：对肿瘤发展和进展的影响。癌症研究。2001;61：1320–6。[公共医学][谷歌学者] 22Tuxhorn JA、Ayala GE、Smith MJ、Smith VC、Dang TD、Rowley DR。人类前列腺癌的反应性基质：诱导肌成纤维细胞表型和细胞外基质重塑。临床癌症研究。2002;8:2912–23.[公共医学][谷歌学者] 23Olumi AF、Grossfeld GD、Hayward SW、Carroll PR、Tlsty TD、Cunha GR。癌相关成纤维细胞直接导致启动的人类前列腺上皮的肿瘤进展。癌症研究。1999;59:5002–11. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Cunha GR、Hayward SW、Wang YZ。基质在前列腺癌变中的作用。区别。2002;70:473–85.[公共医学][谷歌学者] 25Bhowmick NA、Chytil A、Plieth D等。成纤维细胞中的TGF-β信号调节邻近上皮的致癌潜能。科学。2004;303:848–51.[公共医学][谷歌学者] 26基质细胞可以提供致癌信号。塞明癌症生物学。2001;11：97–104。[公共医学][谷歌学者] 27Bissell MJ、Radisky DC、Rizki A、Weaver VM、Petersen OW。组织原理：微环境对正常和恶性乳腺的影响。区别。2002;70:537–46. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Bachem MG、Schneider E、Gross H等。大鼠和人类胰腺星状细胞的鉴定、培养和表征。胃肠病学。1998;115:421–32.[公共医学][谷歌学者] 29Jesnowski R，Furst D，Ringel J，等。胰腺星状细胞作为一种在体外胰腺纤维化模型：失活由Matrigel和N-乙酰半胱氨酸诱导。实验室投资。2005年；85:1276–91.[公共医学][谷歌学者] 30Neesse A、Wagner M、Ellenrieder V、Bachem M、Gress TM、Buchholz M。胰腺星状细胞增强胰腺癌异种移植瘤中SERPINE2表达的促侵袭作用。胰腺学。2007;7:380–5.[公共医学][谷歌学者] 31Schneiderhan W，Diaz F，Fundel M等。胰腺星状细胞是人类胰腺癌中MMP-2的重要来源，并在小鼠异种移植模型和CAM检测中加速肿瘤进展。细胞科学杂志。2007;120:512–9.[公共医学][谷歌学者] 32Miyamoto H，Murakami T，Tsuchida K，Sugino H，Miyake H，Tashiro S。人类胰腺癌的肿瘤-基质相互作用：对抗癌药物的获得性耐药性和增殖调节依赖于细胞外基质蛋白。胰腺。2004;28:38–44.[公共医学][谷歌学者] 33Muerkoster S、Wegehenkel K、Arlt A等。肿瘤间质相互作用诱导胰腺导管癌细胞产生化疗耐药性，包括一氧化氮和白细胞介素-1β分泌增加和旁分泌作用癌症研究。2004;64:1331–7.[公共医学][谷歌学者] 34Ohuchida K、Mizumoto K、Murakami M等。辐射至基质成纤维细胞通过肿瘤-基质相互作用增加胰腺癌细胞的侵袭性。癌症研究。2004;64:3215–22.[公共医学][谷歌学者] 35Aoki H、Ohnishi H、Hama K等。大鼠胰腺星状细胞中TGF-β1和IL-1β之间通过Smad3-和ERK依赖性通路的自分泌环。美国生理学杂志《细胞生理学》。2006;290：C1100–8。[公共医学][谷歌学者] 36Sato N，Maehara N，Goggins M.胰腺癌细胞与基质成纤维细胞之间肿瘤-基质相互作用的基因表达谱。癌症研究。2004;64:6950–6.[公共医学][谷歌学者] 37Sato N、Fukushima N、Maehara N等。SPARC/骨连接蛋白是胰腺癌异常甲基化的常见靶点，也是肿瘤-基质相互作用的介质。致癌物。2003;22：5021–30。[公共医学][谷歌学者] 38Li C，Heidt DG，Dalerba P等。胰腺癌干细胞的鉴定。癌症研究。2007;67:1030–7.[公共医学][谷歌学者] 39Calabrese C、Poppleton H、Kocak M等。脑肿瘤干细胞的血管周围生态位。癌细胞。2007;11:69–82.[公共医学][谷歌学者] 40Tuxhorn JA、McAlhany SJ、Dang TD、Ayala GE、Rowley DR。基质细胞在差异反应性基质（DRS）异种移植模型中促进人类前列腺肿瘤的血管生成和生长。癌症研究。2002;62:3298–307.[公共医学][谷歌学者] 41Yamada KM，Cukierman E.三维组织形态发生和癌症建模。单元格。2007;130:601–10.[公共医学][谷歌学者] 42Kenny HA，Krausz T，Yamada SD，Lengyel E.使用新型3D培养模型阐明间皮细胞、成纤维细胞和细胞外基质在卵巢癌细胞粘附和侵袭网膜方面的作用。国际癌症杂志。2007;121:1463–72.[公共医学][谷歌学者] 43Nelson CM、Bissell MJ。动态交互建模：构建乳房结构、功能和肿瘤转化的三维培养模型。塞明癌症生物学。2005年；15:342–52. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Yu H，Kortylewski M，Pardoll D.癌症与免疫细胞之间的串话：STAT3在肿瘤微环境中的作用。Nat Rev免疫学。2007;7:41–51.[公共医学][谷歌学者] 45Iyengar P、Espina V、Williams TW等。脂肪源性胶原VI影响早期乳腺肿瘤进展体内，显示了肿瘤/基质微环境中的关键相互作用。临床投资杂志。2005年；115:1163–76. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
