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细胞生物学杂志。2008年8月25日；182(4): 703–713.
数字对象标识：10.1083/jcb.200801035
预防性维修识别码：下午2158709
PMID：18725539
第条

体内自噬的重建酿酒酵母

杨曹,Heesun Cheong先生,宋慧、和丹尼尔·克林斯基
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

自噬是一种主要的细胞内降解途径，与各种人类疾病有关。然而，自噬的作用是复杂的；虽然这一过程通常被认为具有细胞保护作用，但它也可能导致细胞功能障碍和疾病进展。我们在理解自噬方面取得了很大进展，这在很大程度上得益于对自噬的鉴定自噬-相关的(自动变速箱)基因。尽管如此，我们对分子机制的理解仍然有限。在这项研究中，我们生成了一个酿酒酵母24个多敲除菌株自动变速箱基因被删除，我们用它来进行体内自噬途径的重建。我们确定了自噬不同方面的最低要求，并研究了吞噬细胞组装位置的初始蛋白质组装步骤。体内重建能够在控制这一过程的复杂调控网络的背景下研究自噬，这是体外系统无法进行的分析。

介绍

巨自噬（以下简称自噬）是真核细胞中一种保守的降解途径，在发育和分化中也起着重要作用，并与许多人类疾病有关(莱文和克林斯基，2004年;水岛，2007年). 自噬涉及在胞浆中重新形成一个双膜囊泡（自噬体），该囊泡与溶酶体/液泡融合，以及随后的货物分解和再循环。带有以下标识自噬-相关的(自动变速箱)酵母中的基因，自噬研究已经从形态学分析转向对分子机制的理解(克林斯基，2007年). 31自动变速箱已在面包酵母和甲基营养酵母中鉴定出基因，其中许多基因在高等真核生物中具有同源物(Rubinsztein等人，2007年).

自噬通常被认为是非选择性的，但也有选择性的自噬类型。细胞质-空泡靶向（Cvt）途径是选择性自噬的一个例子，其中在营养条件下，常驻空泡水解酶氨基肽酶I（prApe1）的前体形式被选择性地从细胞质运输到空泡(克林斯基，2005年). Cvt途径共享自噬所需的大部分成分，但在货物识别和包装中利用了额外的蛋白质。在细胞溶质中合成后，prApe1形成一个低聚物，它通过受体Atg19和适配器Atg11靶向(Kim等人，1997年;Scott等人，2001年;Shintani等人，2002年;Shintani和Klonsky，2004年;尤里米苏和克林斯基，2005年). 没有证据表明Cvt途径存在于真菌之外。然而，在哺乳动物选择性自噬的例子中也可能使用类似的识别机制(岩手等人，2006年).

在Cvt通路和非选择性自噬中，大多数Atg蛋白至少暂时共定位于吞噬细胞组装位点（PAS；自噬体的假定成核位点）；然而，这个站点的定义和特征很差。了解Atg蛋白如何靶向PAS将有助于我们剖析囊泡形成过程，并了解这些蛋白如何相互作用和功能。包括Atg11在内的货物综合体是植物条件下PAS组装的初始组件(Shintani等人，2002年)而Atg17已被证明是饥饿状态下PAS组装的初始因素(铃木等人，2007年). Atg17复合体中的成分，如Atg1和Atg13，也参与了饥饿期间PAS的组织(Cheong等人，2008年;Kawamata等人，2008年). 然而，关于PAS中蛋白质组装的时间顺序的许多问题仍然存在。

在保守基因中，有8个参与两个独立但相关的接合系统，涉及两个泛素样蛋白Atg8和Atg12。Atg8通过Atg4、Atg7和Atg3的系列作用与磷脂酰乙醇胺（PE）偶联(Ichimura等人，2000年). Atg8的C末端精氨酸残基首先被半胱氨酸蛋白酶Atg4去除，暴露出一种甘氨酸残基，这种残基现在可被E1类激活酶Atg7获得。活化的Atg8随后被转移到类E2结合酶Atg3，最后与PE结合。虽然调控Atg4裂解时间的机制尚不清楚，但Atg8可以通过Atg4的第二次裂解从Atg8–PE中解偶联。第二种泛素样蛋白Atg12通过E1样Atg7和E2样酶Atg10的作用与Atg5共价连接(水岛等人，1998年). Atg12–Atg5结合物还结合另一种蛋白质Atg16，其寡聚化导致Atg12-Atg5-Atg16的四聚体复合物(水岛等人，1999年;Kuma等人，2002年). 在缺乏Atg12、Atg5或Atg16的情况下，Atg8–PE水平降低，并且Atg12–Atg5结合物可能在Atg8-PE结合系统中充当E3类酶(铃木等人，2001;Hanada等人，2007年). 然而，Atg12–Atg5共轭的效率显然不受Atg8–PE系统的影响(Kuma等人，2002年). 虽然之前已经描述过Atg8–PE和Atg12–Atg5结合物的体外重组(Ichimura等人，2004年;Hanada等人，2007年;Shao等人，2007年;Fujioka等人，2008年)在真核细胞中，这两种反应的体内重建是不可用的。因此，一些体外观察的生理意义尚未得到验证。

利用标准分子遗传学对单缺失和双缺失突变株的自噬过程进行了体内分析，并在体外重建了一小部分反应。由于系统的复杂性以及对基本问题（例如隔离膜的起源）缺乏了解，整个过程不太可能在近期内在体外重建。此外，体外研究固有地缺乏许多关键元素，如细胞骨架和在体内发挥重要作用的调节控制。为了提供一个生理重建系统，我们删除了24个自动变速箱使用多重敲除（MKO）策略，自噬和/或Cvt途径直接需要的基因。我们使用这种MKO菌株来确定货物包装的最低要求、饥饿特异性PAS的初始组装以及泛素样Atg蛋白的结合。我们对MKO菌株的研究结果验证了特定Atg蛋白在货物包装中的作用，并扩展了先前基于单个或双缺失菌株和/或体外研究的PAS组装和蛋白偶联的研究。通过这项工作，我们提出了一种新的方法来处理复杂的细胞路径，特别是那些具有广泛调节网络的路径，例如不能在体外轻易复制的自噬。

结果

研究自噬的MKO菌株的构建

我们能够构建MKO菌株，因为自动变速箱自噬和Cvt途径直接需要的基因是非必需的液氧磷–Cre公司系统允许MKO标记的使用和回收(图1 A;Gueldener等人，2002年). 在31个自动变速箱YCY123菌株中有24个基因缺失(表一).ATG15型,自动液位计22,在25,ATG26型,ATG28型、和自动液位计30没有被删除，因为自噬体与溶酶体/液泡膜融合后的前两个功能，而其他功能在酿酒酵母或仅在其他甲基营养酵母的过氧化物酶体降解中需要(曹和克林斯基，2007年).自动液位计31没有被删除，因为我们在本手稿发表之前已经完成了MKO菌株的产生和本手稿中描述的实验(Kabeya等人，2007年). 我们将菌株YCY123称为MKO菌株。额外删除或存在自动变速箱基因在括号中表示。

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MKO菌株的产生和性质。（A） MKO策略的示意图。这个loxP–Cre公司该系统允许使用不同标记破坏多达五个基因，并通过Cre表达有效去除标记。多轮删除和标记物拯救产生了MKO菌株。有关详细信息，请参见材料和方法。（B） MKO菌株与野生型（WT）和atg1Δ菌株。重量，atg1ΔMKO菌株在YPD中培养过夜并稀释至OD600=0.1。OD去除等分试样600每小时读数13小时。（C）MKO菌株的形态。WT和atg18Δ菌株和具有或不具有表达Atg18的质粒的MKO菌株（pATG18（415））在YPD中生长至中对数期，并通过显微镜观察。MKO菌株的液泡增大，类似于atg18Δ应变；Atg18转化后，液泡大小与野生型相同。棒材，2μm。（D） 表达Atg6的MKO菌株在羧肽酶Y、MVB或碱性磷酸酶途径上没有缺陷，并通过Prc1、Cps1（未描述）和Pho8处理的脉冲相实验进行了分析。这个atg6Δ用表达Atg6的质粒（pATG6（414））或空pRS414载体转化的MKO菌株，按照材料和方法中的描述进行放射性标记/非放射性追踪和三重免疫沉淀，然后用8%SDS-PAGE进行分析。羧肽酶Y（Prc1）以前体（p1）形式穿过内质网，在高尔基复合体中获得其p2形式，并通过晚期内体-MVB途径输送到液泡并转化为成熟（m）形式。液泡碱性磷酸酶（Pho8）通过内质网以前体（p）形式运输到高尔基体但绕过内体，在液泡中被蛋白水解激活为成熟（m）形式。碱性磷酸酶途径不需要Atg6；然而，为了保持一致性，在整个实验中使用了表达Atg6的细胞。

表一。

本研究中使用的酵母菌株
应变描述性名称基因型来源或参考
CWY241型重量(ATG17-GFP公司)6210瑞典克朗ATG17-GFP｜HIS3(Cheong等人，2005年)
海西107MKO公司(ATG17-GFP公司)YCY123万元ATG17-GFP｜HIS3本研究
HCY113型MKO公司(ATG29 ATG17-GFP)YCY121型ATG17-GFP｜HIS3本研究
HCY151型MKO公司(ATG11 ATG17-GFP)YCY152万元ATG17-GFPŞHIS3型本研究
JLY2型atg12Δ6210瑞典克朗atg12ΔбkanMX本研究
第161页atg6Δ6210瑞典克朗atg6Δ｜HIS3本研究
6210瑞典克朗重量马塔乌拉3–52列伊2–3,112嘶嘶声3-Δ200 trp1-Δ901赖氨酸-2–801
    抽吸2-Δ9加仑		(Robinson等人，1988年)
电视1pep4Δ6210瑞典克朗pep4ΔбLEU2(Gerhardt等人，1998年)
为什么001atg1Δ6210瑞典克朗atg1Δ｜HIS5(Shintani等人，2002年)
YCY26年atg18Δ6210瑞典克朗atg18ΔбkanMX本研究
YCY32型atg4Δatg8Δ6210瑞典克朗atg4ΔбLEU2,atg8Δ｜HIS5本研究
YCY121型MKO公司(ATG29型)6210瑞典克朗atg1Δ,2Δ,3Δ,4Δ,5Δ,6Δ,7Δ,8Δ,9Δ,10Δ,
    11Δ,12Δ,13Δ,14Δ,16Δ,17Δ,18Δ,19Δ,20Δ,
    21Δ,23Δ,24Δ,27Δ		本研究
YCY123万元MKO公司6210瑞典克朗atg1Δ,2Δ,3Δ,4Δ,5Δ,6Δ,7Δ,8Δ,9Δ,10Δ,
    11Δ,12Δ,13Δ,14Δ,16Δ,17Δ,18Δ,19Δ,20Δ,
    21Δ,23Δ,24Δ,27Δ,29Δ		本研究
YCY124万元MKO公司(atg15Δ)YCY123万元atg15ΔбkanMX本研究
125日元MKO公司(atg15Δape1Δ)YCY123万元atg15ΔбkanMX,ape1Δ｜HIS3本研究
YCY126万元MKO公司(atg15ΔRFP-APE1)YCY123万元atg15ΔбkanMX,RFP-APE1｜LEU2本研究
YCY137型MKO公司(自动液位计3)6210瑞典克朗atg1Δ,2Δ,4Δ,5Δ,6Δ,7Δ,8Δ,9Δ,10Δ,
    11Δ,12Δ,13Δ,14Δ,16Δ,17Δ,18Δ,19Δ,20Δ,
    21Δ,23Δ,24Δ,27Δ,29Δ		本研究
YCY152万元MKO公司(ATG11型)第123年ATG11｜LYS2本研究

WT，野生型。

MKO菌株除了轻微的生长延迟外，没有任何明显的意外缺陷(图1 B). 在MKO株中，我们观察到一个异常增大的液泡，与atg18Δ表型(图1 C;Dove等人，2004年). 当我们将Atg18引入MKO菌株时，正常的液泡形态得到恢复(图1 C). 我们还测试了MKO菌株是否存在其他空泡靶向途径的缺陷。羧肽酶Y（Prc1）通过内质网、高尔基复合体和晚期内体-多泡体（MVB）传递到液泡。羧肽酶S（Cps1）是MVB途径的载体，通过类似于Prc1的早期分泌途径转运，但在空泡输送之前被包装到MVB的腔泡中。液泡碱性磷酸酶（Pho8）通过内质网转运到高尔基体，但绕过内质体MVB(鲍尔斯和史蒂文斯，2005年). 通过脉冲相分析和免疫沉淀，我们跟踪了MKO菌株中Prc1、Cps1和Pho8的处理过程。作为自动液位计6是羧肽酶Y途径的关键，我们将表达Atg6的质粒转化为MKO和atg6Δ菌株。如所示图1D尽管表达Atg6的MKO菌株存在动力学延迟，但大多数前体Prc1、Cps1（未描述）和Pho8在培养基中45分钟后成熟。考虑到MKO菌株的生长延迟，这些数据表明，表达Atg6的MKO菌种在羧肽酶Y、MVB和碱性磷酸酶空泡蛋白传递途径上没有缺陷，这些途径是非自噬性的。

Cvt通道中货物包装所需且足够的组件

接下来，我们想确定MKO菌株在表达适当的自噬基因时是否忠实地再现了自噬的不同步骤。先前对标准缺失菌株的研究只能证明对参与自噬不同步骤的各种蛋白质的需求，而不能证明其充分性。在下一组实验中，我们重建了Cvt途径的货物包装步骤。在货物包装过程的开始，prApe1形成一个大的低聚物，如果蛋白质被荧光标记，荧光显微镜可以观察到代表低聚物的明亮的单点结构(Kim等人，1997年;Shintani等人，2002年). MKO中也检测到相同的模式(在15ΔRFP-APE1时)RFP标记的表达prApe1的菌株(图2 A，左）。额外击倒ATG15型在MKO菌株中，其生长速度略有降低，但不影响Cvt囊泡/自噬体的形成（未描述）。在ape1Δ细胞，Atg19受体和Atg11适配器都分散在胞浆中(尤里米苏和克林斯基，2005年). 为了确定MKO菌株是否复制了这些表型，我们构建了一个缺乏APE1接口并用表达YFP-Atg19或GFP-Atg11的质粒将其转化。在没有prApe1（货物）的情况下，YFP-Atg19是细胞溶质(图2 A，中间），但GFP-Atg11形成点状结构(图2 A，右侧）。Atg11能够与自身和其他几种Atg蛋白相互作用，并且Atg11自我相互作用所通过的螺旋结构域与Atg1、Atg17和Atg20使用的相互作用位点重叠(尤里米苏和克林斯基，2005年). 因此，在没有与其他Atg蛋白竞争的情况下，Atg11可能通过MKO菌株中的自我作用形成一个大的低聚物。通过梯度分馏对Atg11蛋白的分析表明，它确实在MKO菌株中形成了一个大的复合物（未公布的数据）。

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重建Cvt路径的货物识别和包装步骤。（A） MKO中货物prApe1的本地化(atg15ΔRFP-APE1)MKO中受体Atg19和适配器Atg11的定位(ape1Δatg15Δ)应变。MKO公司(atg15ΔRFP-APE1)应变和MKO(ape1Δatg15Δ)用表达YFP-Atg19（pYFPATG19（416））或HA标记CFP-Atg11（pCuHACFPATG11（414））的质粒转化的菌株在选择性SMD培养基至中对数期生长，并通过荧光显微镜观察。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。（B） prApe1、Atg19和Atg11的染色。MKO公司(atg15ΔRFP-APE1)用表达YFP-Atg19、HA标记CFP-Atg11或两者的质粒转化该菌株，生长到中对数期，并通过荧光显微镜观察。当Atg19与MKO中的prApe1共存时(在15ΔRFP-APE1时)菌株，货物prApe1与受体Atg19共定位（顶部）。当Atg19不存在时，适配器Atg11（箭头）没有与货物（中间）协同定位。当prApe1、Atg19和Atg11都存在时，这三种蛋白质共定位到相同的结构（底部）。棒材，2.5μm。

在野生型细胞中，Atg19结合prApe1的前肽并与之共定位。Atg11与Atg19相互作用，以PAS为目标(Scott等人，2001年;Shintani等人，2002年;尤里米苏和克林斯基，2005年). 因此，存在蛋白质相互作用的时间顺序，在没有Atg19的情况下，Atg11不能与prApe1复合物结合。为了测试这种时间组织是否忠实地保留在MKO菌株中，我们转换了MKO(atg15ΔRFP-APE1)质粒表达YFP-Atg19、CFP-Atg11或两者的菌株。与之前的模型一致，RFP-Ape1和YFP-Atg19在没有其他Atg蛋白的情况下相互共定位(图2 B，顶部）。相反，如果没有Atg19，RFP-Ape1不能与CFP-Atg11共定位(图2 B，中间）。当三种蛋白质全部共存时，它们在一个点状突起内共定位(图2 B，底部）。这些数据表明，prApe1、Atg19和Atg11对于Cvt路径中的货物包装是必要的和足够的。然而，我们注意到，仅～50%的punta代表货物复合物（由prApe1、Atg19和Atg11组成）位于PAS（即液泡周围），这表明需要额外的Atg蛋白来促进货物复合物靶向该位点。

初始饥饿特定PAS的组装

对货物包装的分析证实，MKO菌株忠实地复制了先前研究中推导出的Atg蛋白相互作用的时间顺序。接下来，我们决定使用MKO菌株来解决一个否则将极难解决的问题。特别是，我们想确定Atg蛋白在PAS的组装顺序。理论上，通过对多个缺失菌株的广泛分析，可以对蛋白质进行排序，从而产生一系列上位关系。然而，最好在完全没有其他（即那些未被检测的）Atg蛋白的情况下进行明确的研究。最近的研究表明，Atg11和Atg17是在PAS处建立Atg蛋白组装序列的两个初始因子(Shintani等人，2002年;铃木等人，2007年). 特别是，Atg11对营养生长期间的PAS组装至关重要，而Atg17被提议作为在饥饿特异性PAS形成期间招募其他Atg蛋白的支架。

为了测试Atg17本身是否足以组装最初的PAS，我们通过荧光显微镜观察了带有GFP标记的Atg17在MKO菌株中的定位。在野生型细胞中，Atg17-GFP在营养状态和饥饿状态下均显示出清晰的PAS点状结构和弥漫的细胞溶质信号；在一些细胞中，我们可以检测到不止一个泪点，特别是在饥饿条件下(图3 A). 相反，Atg17-GFP在MKO中主要是细胞溶质(ATG17-GFP公司)应变(图3 A，矢量），这表明即使在饥饿期间，Atg17也不足以进行初始PAS组装。因此，我们决定确定在自噬过程中需要哪些额外的因素才能正确定位Atg17。

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重建特定于匮乏的PAS组件的初始步骤。（A） Atg17-GFP在野生型（WT）和MKO中的定位(ATG17-GFP公司)菌株。WT公司(ATG17-GFP公司)应变；MKO公司(ATG17-GFP公司)用载体（pRS415）、表达Atg1（pATG1（415））、Atg13（pATG13（415；和MKO(ATG11 ATG17-GFP)用表达Atg1或Atg13的质粒转化的菌株在选择性SMD培养基中生长到中对数期，然后转移到SD-N中饥饿2小时。从生长（中对数期）和饥饿条件下采集样品，用于荧光显微镜分析。生长和饥饿条件下，Atg17-GFP在WT细胞中均呈点状结构；有些细胞在饥饿状态下有多个点状突起。在MKO中(ATG17-GFP公司)菌株Atg17在两种条件下均为胞质；只有当Atg1和Atg13同时表达时，其定位模式才在饥饿状态下转变为点状结构。Atg1和Atg11的共表达或Atg13和Attg11不能将Atg17从胞浆重新分配到点状结构。显示了具有代表性的图像。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。（B） Atg17-GFP在MKO中的空泡周围定位(ATG17-GFP公司)应变。MKO公司(ATG17-GFP公司)用表达Atg1和Atg13的质粒转化的菌株（pATG1-Atg13（415））生长到中对数期，用材料和方法中描述的空泡染料FM 4–64染色，并在成像前转移到SD-N 2 h。当Atg1和Atg13都表达时，在饥饿条件下，Atg17-GFP斑点定位在液泡周围位置。棒材，2.5μm。（C） 在营养（开放栏）和饥饿（封闭栏）条件下，对多种Atg蛋白组合共表达的MKO菌株（HCY107、HCY113和HCY151）中含有Atg17-GFP PAS点的细胞数量进行量化。对每个菌株的大约100–250个细胞进行分析，以对带有荧光PAS点的细胞百分比进行评分。

最近，人们发现，在饥饿特异性PAS的组装中，需要Atg1和Atg13以及Atg17(Cheong等人，2008年). 因此，我们假设Atg1、Atg13和Atg17都是非特异性自噬期间PAS初始组装所必需的。为了验证这一点，我们将表达Atg1、Atg13或两者的质粒转化为MKO(ATG17-GFP公司)并通过荧光显微镜观察Atg17-GFP的定位。只有当Atg1和Atg13同时表达时，Atg17-GFP在饥饿条件下才显示出清晰的点状结构(图3 A，附件1+附件13）。相反，单独或与Atg11组合的Atg1或Atg13的表达不促进Atg17-GFP点状点的形成(图3 A). GFP-Atg1检测到相同的定位模式；该蛋白在自身表达时是细胞溶质的，只有当Atg13和Atg17同时存在时，才能在饥饿条件下形成点状结构（未公布的数据）。此外，～75%的Atg17-GFP或GFP-Atg1点状物是空泡周围的（用亲脂染料FM 4-64检测），这表明Atg1、Atg13和Atg17足以在饥饿期间进行最初的PAS组装(图3 B). 总之，这些数据表明Atg17不足以形成特定于饥饿的PAS；相反，Atg1、Atg13和Atg17在饥饿期间似乎都在PAS组装中起着初始作用。

最后，我们量化了表达不同Atg蛋白的MKO菌株中含有Atg17-GFP点的细胞百分比。在饥饿条件下，大约40%的共表达Atg1和Atg13的细胞显示Atg17-GFP点状结构，而当Atg17-GFP自身表达时，<5%的细胞显示任何点状结构(图3 C). Atg17复合体中其他成分的额外表达进一步增加了显示Atg17-GFP点的细胞百分比。例如，Atg29本身并没有显著影响Atg17-GFP点状细胞的形成，但Atg29在Atg1和Atg13存在下的表达使点状细胞在饥饿期间的百分比增加到～53%。当Atg11与Atg1和Atg13一起表达时，导致更大的增加至～80%(图3 C). 总之，这些结果表明，饥饿特异性PAS的形成最初需要最少的一组Atg蛋白，包括Atg1、Atg13和Atg17；Atg1复合体中的其他组件，如Atg29和Atg11，进一步增强了组装。

Atg8共轭体系影响Atg12–Atg5共轭物的形成

在确定了MKO菌株在生长条件下再现了货物包装中所涉及组件的时间顺序，并确定了饥饿期间PAS组装的初始因素后，我们决定扩展我们对该系统效用的分析。特别是，我们选择检测Atg12–Atg5结合系统，因为这部分自噬过程已在体外重建。因此，已经确定了反应所必需和充分的组分。我们提出的问题是，从这些先前的实验中获得的信息是否准确地反映了完整的体内情况。先前的数据表明，Atg5、Atg7、Atg10和Atg12对共轭至关重要(水岛等人，1998年)，且Atg16是该反应效率所必需的(水岛等人，1999年)，但来自Atg8–PE系统的Atg3、Atg4和Atg8不参与Atg12–Atg5共轭(Kuma等人，2002年). 因此，我们在MKO菌株中表达了这些蛋白质的各种组合。我们使用3×HA标记的Atg12来检测Atg12–Atg5共轭物。当用atg12Δ菌株，我们检测到游离的HA-Atg12和与Atg5偶联的HA-Atg12(图4，车道2）。正如预期的那样，当MKO菌株中只有Atg5和HA-Atg12表达时，我们没有检测到共轭物种(图4，车道4）。相反，如果Atg7和Atg10也存在，我们检测到对应于HA-Atg12–Atg5共轭物的微弱带；然而，大多数HA-Atg12是以自由形式存在的(图4，车道5）。当我们添加Atg16时，我们发现形成了大量共轭物(图4，车道6）。

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重组Atg12–Atg5共轭体系。MKO，MKO(自动液位计3)、和atg12Δ用不同质粒转化的细胞在选择性SMD培养基中生长，在中对数期收集，并使用抗HA抗体进行Western blot分析。0.2外径600在每条车道上装载单元单元。Pgk1被用作加载控制。表达HA标记Atg12的质粒（pHA-Atg12（416））；附件7和附件10（pATG7-Atg10（414））；Atg5和HA标记的Atg12（pATG5-HA-Atg12（416））；Atg5、HA-Atg12和Atg16（pATG5-HA-Atg12-Atg16（416））；如图所示，使用Atg8、Atg4、Atg7和Atg10（pATG8-Atg4-Atg7-Atg10（414））。随着Atg5、Atg12、Atg7和Atg10在MKO菌株中表达，少量Atg12–Atg5共轭物形成（车道5）。Atg16的额外表达提高了共轭效率（车道6）。来自Atg8共轭体系的Atg8、Atg4和Atg3的存在进一步促进了Atg12–Atg5的形成和/或增强了其稳定性（车道7和8）。

接下来，我们研究了Atg8共轭体系的可能贡献。当我们将Atg4和Atg8与Atg5、Atg7、Atg10、Atg12和Atg16一起表达时，Atg12–Atg5的结合效率进一步提高(图4，车道7）。Atg8–由于缺乏Atg3（未描述），该菌株中未产生PE。因此，即使没有形成Atg8–PE，Atg8-PE系统中的一些蛋白质的存在也可以促进Atg12与Atg5的结合。此外，当添加Atg3时，Atg12–Atg5共轭物的水平甚至更高(图4，车道8）。因此，我们的数据表明，Atg5、Atg7、Atg10和Atg12是Atg12–Atg5共轭形成的最低要求，而Atg16有助于共轭，这与已发布的数据一致。然而，我们进一步发现，Atg8–PE体系中的组分也增强了共轭反应。两种植物都得出了相同的结论(图4)或饥饿（未示出）条件。

Atg8–PE形成和Atg4解理

我们将我们对MKO菌株的分析扩展到Atg8-PE结合的重建。虽然已经对Atg8-PE的体外重组进行了广泛的研究，但体内重组仅在大肠杆菌其中不发生自噬(Ichimura等人，2004年). 初生Atg8的C端精氨酸通常被Atg4去除，Atg4也可以从PE中释放Atg8。当C端精胺酸被去除时，如Atg8ΔR，初始处理步骤被绕过。先前使用纯化的Atg8ΔR、Atg3、Atg7和含PE脂质体的实验表明，当PE含量达到总膜的70%时，Atg8–PE的形成达到峰值，但当浓度接近酵母细胞器膜时，效率很低(Ichimura等人，2004年). 然而，共轭效率因Atg12–Atg5共轭物的存在而提高，进一步添加Atg16只会略微增加Atg8–PE的形成(Hanada等人，2007年). 我们的数据支持Atg8脂化的当前观点。此外，他们还对共轭和去共轭反应提供了额外的见解。

我们首先测试了Atg8、Atg4、Atg7和Atg3是否足以形成Atg8–PE。当我们将表达这些蛋白的质粒转化为MKO时(ATG3型)菌株Atg8–PE在生长和饥饿条件下基本未检测到(图5 A，车道3）；即使我们表达了Atg12–Atg5共轭系统的所有成分，我们仍然无法检测到Atg8–PE的信号(图5 A，车道4）。这些数据与体外重建数据不一致。这些先前的研究与我们的实验之间的差异之一是，先前的分析使用修改的Atg8ΔR来绕过初始Atg4裂解的需要，并在随后的反应中忽略了Atg4。然而，Atg4的缺失也阻碍了Atg8–PE的去共轭，因此有利于共轭物种的积累。考虑到Atg4在决定Atg8和Atg8–PE之间平衡中的作用，我们将表达Atg8ΔR、Atg7和Atg10的质粒导入MKO(自动液位计3)应变；在这种情况下，检测到大量Atg8–PE(图5 A，车道5）。当我们额外表达Atg5、HA-Atg12和Atg16时，几乎所有的Atg8都是共轭形式(图5 A，车道6）。因此，当存在Atg4时，如体内情况一样，即使存在Atg12–Atg5结合系统，MKO菌株中的Atg8–PE水平也极低。这些结果表明，体外系统不能忠实地反映控制Atg4活性所需的其他因素的作用。

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重组Atg8–PE共轭体系。（A） Atg4和Atg12-Atg5共轭系统在Atg8-PE形成中的作用。MKO公司(自动液位计3)用不同质粒组合转化的细胞在选择性SMD培养基中生长，在中对数期或饥饿后2h收集，然后用抗Atg8抗血清进行Western blot分析。0.2盎司600在每条车道上装载单元单元。Pgk1被用作加载控制。表达Atg8的质粒（pATG8（414））；Atg8、Atg4、Atg7和Atg10（pATG8-Atg4-Atg7-Atg10（414））；Atg5、HA-Atg12和Atg16（pATG5-HA-Atg12-Atg16（416））；如图所示，使用了Atg8ΔR、Atg7和Atg10（pATG8ΔR-Atg7-Atg10（414））。即使表达了Atg8–PE和Atg12–Atg5共轭系统中的所有已知成分（通道4），在生长和饥饿条件下也几乎未检测到Atg8-PE。然而，当表达Atg8ΔR且不表达Atg4时，观察到大量的Atg8–PE（第5条车道），并且当Atg12–Atg5共轭系统的所有成分也表达时，数量进一步增加（第6条车道）。请注意，Atg8–PE在SDS-PAGE期间异常迁移，并低于Atg8。（B） Atg12–Atg5共轭系统在Atg8–PE形成中的作用。实验程序与表达Atg8ΔR（pATG8ΔR414）的A.质粒相同；Atg8ΔR、Atg4、Atg7和Atg10（pATG8ΔR-Atg4-Atg7-Atg10（414））；Atg8ΔR、Atg7和Atg10；附件5（pATG5（416））；HA标记的Atg12（pHA-Atg12（416））；附件16（pATG16（416））；Atg5和HA-Atg12（pATG5-HA-Atg12（416））；如图所示，使用Atg5、HA-Atg12和Atg16。这个atg4Δatg8Δ用表达Atg8ΔR（pATG8ΔR414）的质粒转化的菌株pep4Δ应变被用作对照（第10和11车道）。当Atg4存在时，未检测到Atg8–PE频带（比较通道3和4）。仅表达Atg5、Atg12或Atg16并不能改善Atg8-PE形成（将车道5-7与车道4进行比较）。当通过表达Atg7、Atg10、Atg12和Atg5形成Atg12–Atg5共轭物时，Atg8–PE形成的效率大大提高（车道8）。Atg16进一步促进了Atg8–PE共轭和/或增强了共轭的稳定性（车道9）。

最后，我们试图进一步确定该系统中Atg8-PE水平低的原因。在野生型细胞中，Atg8在液泡内不断降解，因此Atg8的总量低于MKO株。因此，我们使用了pep4Δ作为对照，阻断Atg8降解的菌株(图5 B，第11车道）。发生去共轭时，未检测到Atg8–PE带(图5 B，车道3），而Atg8ΔR的表达式atg4Δatg8Δ解偶联缺陷的菌株导致所有蛋白质以脂溶形式积聚(图5 B，车道10）。当我们分别表达Atg8ΔR、Atg7和Atg10以及Atg5、Atg12或Atg16时，Atg8-PE结合没有增加(图5 B，车道4-7）。然而，Atg12–Atg5缀合物的存在促进了Atg8–PE的形成(图5 B，第8车道；且未描述）。在该体内系统中，Atg16还促进了Atg8–PE的形成和/或增强了其稳定性(图5 B，车道9），可通过其对Atg12–Atg5共轭物的作用进行间接(图4，车道6）。

讨论

在这项研究中，我们创建并验证了一株MKO菌株，其中24株自动变速箱自噬和Cvt途径直接需要的基因被删除(图1). 使用这种体内系统，我们确定了货物包装的最低要求(图2)，初始饥饿特定PAS装配(图3)，Atg12–Atg5共轭(图4)和Atg8–PE形成(图5). 虽然单、双缺失分析和体外重组为我们提供了重要的机制见解，但这些步骤的最低要求和调控通常尚未得到广泛探讨。MKO菌株是实现这些目的的一个有价值且强大的工具。此外，与体外重建系统相比，它还有一个明显的优势，可以更准确地再现体内发生的情况，并使研究自噬的复杂步骤/方面变得可能和更有效。

我们体内重组的Atg12–Atg5和Atg8–PE结合系统证明了MKO菌株的有用性，因为它为我们提供了体外研究中缺失的信息。例如，我们的数据表明，Atg8–PE系统中的成分有助于提高Atg12–Atg5共轭的效率(图4). 关于Atg8–PE共轭体系，结果更加有趣。我们发现，当Atg4存在时，可以裂解Atg8的C末端精氨酸，并从PE中解偶联Atg8，这种情况比用于体外重建研究的条件更具生理相关性；即使两个结合系统中的所有蛋白质也不能维持检测到的Atg8–PE(图5 A)与野生型细胞相比。这意味着要么去共轭发生得太快，要么在MKO菌株中共轭效率仍然受到影响，要么两者兼而有之。一种可能是MKO株中基于质粒的Atg4导致过度表达和Atg4活性升高，有利于Atg8–PE的去结合。因为我们没有针对Atg4蛋白的抗体，所以我们无法直接确定Atg4水平。然而，为了解决这种可能性，我们检测了Atg4表达质粒在atg4Δ应变。我们发现Atg4在atg4Δ菌株补充了prApe1的成熟，并且该菌株没有积累未结合的Atg8（未发表的数据），这表明我们表达Atg4的质粒是有功能的，需要额外的因素来调节Atg4在MKO菌株中的蛋白酶活性或解偶联功能。Atg4的调控是自噬的一个重要课题。例如，为什么当Atg4立即去除C末端甘氨酸后的残基时，会合成Atg8？此外，如何调节Atg4以防止Atg8–PE过早去偶联？最近的一项研究表明，Atg4活性受氧化还原调节(Scherz-Shouval等人，2007年)虽然在体内发生这种情况的实际机制尚不清楚。后续分析将对去偶联和偶联的调节产生更多的见解。

与单缺失或双缺失菌株的分析相比，使用MKO菌株可以更直接、更有效地研究PAS处的蛋白质组装顺序。先前的研究表明，Atg11和Atg17分别是植物和饥饿条件下PAS组装的初始因子(Shintani等人，2002年;铃木等人，2007年). 然而，自噬途径中的一些蛋白质可能会一起作用或相互替代，以靶向PAS的Atg11和Atg17。我们的数据表明，在营养条件下，Atg11不足以将自身和货物复合体定位于PAS，即使货物复合体形成，这意味着需要额外的蛋白质才能有效组装Cvt特异性PAS。我们还提供了直接证据，证明不仅Atg17，而且Atg1和Atg13对于最初的特定于饥饿的PAS组装也很重要(图3 A). 在存在Atg1和Atg13的情况下，大约75%的Atg17-GFP点状物是空泡周围的(图3 B)这表明这三种蛋白质足以完成这一过程。我们还注意到，表达Atg1、Atg13和Atg17-GFP的MKO细胞往往比野生型细胞具有更多的点状结构。一些点状结构可能是最初PAS的前体或中间结构。除Atg1、Atg13和Atg17外，其他蛋白质如Atg29和Atg11也有助于组装过程的效率(图3 C). 在我们的研究过程中，发表了一篇论文，验证了Atg29在特定于饥饿的PAS装配中的作用(Kawamata等人，2008年). 然而，这两组研究之间存在一些差异。例如，Kawamata等人（2008年）发现Atg29对饥饿特异性PAS的组装是必需的，而我们目前的研究表明，该蛋白增强了PAS组装，但不是必需的。需要进行进一步分析，以解决这一问题以及与此主题相关的其他问题。虽然Atg11是一种Cvt特异性因子，但在饥饿状态下，它与Atg1、Atg13和Atg17一起促进了PAS的组装(图3 C). 营养生长期间依赖Atg11的Cvt特异性PAS的生成可能有助于在Atg17复合体中招募成分，从而在细胞随后转移到饥饿状态时增强PAS的组装(Cheong等人，2008年).

体外系统可以成为解剖分子机制的非常有用和强大的工具，而本研究并未提出其他建议。相反，我们证明体内重建可以补充和扩展体外分析。产生24个菌株自动变速箱基因敲除是研究自噬等复杂途径的一种独特而新颖的方法，而菌株将是研究自吞噬的一种非常有用的工具。我们可以预见该菌株在确定蛋白到达PAS的时间顺序、在自噬体形成后提取Atg蛋白以及自噬的许多其他方面的潜在用途。这些实验将奖励我们新的发现，并为潜在的研究开辟领域。

材料和方法

酵母菌株、培养基、试剂和抗血清

酵母酿酒酵母本研究中使用的菌株列于表一使用loxP–Cre公司系统(Gueldener等人，2002年). 通过基于PCR的程序在相应的染色体位点对Atg17进行GFP标记(Longtine等人，1998年). 用于氮饥饿的酵母培养基包括YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖）或含有casamino acids（SMD+CA）和SD-N的合成最小培养基(Shintani等人，2002年). 从Invitrogen中获得FM 4-64和碱性磷酸酶（Pho8）和羧肽酶Y（Prc1）抗体。抗Ape1抗血清(Klonsky等人，1992年)和附件8(Huang等人，2000年)前面已经描述过。血凝素表位的抗体是从圣克鲁斯生物技术公司获得的。抗Cps1的抗血清和磷酸甘油酸激酶（Pgk1）分别来自S.Emr（纽约州伊萨卡康奈尔大学）和J.Thorner（加利福尼亚州伯克利大学）。

MKO菌株的构建

MKO菌株来源于野生型单倍体菌株SEY6210(Robinson等人，1988年)、和loxP–Cre公司系统(Gueldener等人，2002年)被修改为多基因敲除(图1 A). 基因断裂盒由一个选择标记和两个选择标记组成液氧磷序列通过PCR扩增，所用的引物包含60个核苷酸片段，这些核苷酸片段与目标基因的起始密码子上游或终止密码子下游的序列同源，随后是与侧翼序列互补的19或22个核苷酸片段液氧磷标记质粒中的位点。PCR产物被转化为酵母细胞，并在缺乏特定氨基酸或含有特定抗生素的平板上选择转化子。使用两组引物通过菌落PCR检查所选转化子的正确整合。自动变速箱使用标记一次删除一个基因，包括kanMX（汉字）,布尔第页,HIS5型,URA3公司、和LEU2级.最多五个自动变速箱在表达Cre重组酶以圈出标记之前，先删除基因。复制板用于识别丢失所有标记的菌落。因此，可以重复使用标记来删除其他自动变速箱基因。经过几轮删除和标记救援，24自动变速箱基因被删除。该菌株命名为YCY123（MKO）。

质粒构建

对于pATG4（414）、pATG7（414(西科尔斯基和希特，1989年). 使用SacI和BamHI位点克隆pATG6（414），pATG8（414）的NotI和NcoI，pATG1（415）的SacI和PstI，以及pATG13（415）的XbaI和XmaI。对于pHA-ATG12（416），插入物从3×HA-APG12扩增(水岛等人，1998年)并克隆到pRS416中。通过检测prApe1成熟度，在相应的敲除菌株中测试这些质粒的功能。

随后通过限制性酶切去除启动子、开放阅读框和终止插入物，并以各种组合进行克隆，以生成多基因质粒pATG1-ATG13（415）、pATG7-ATG10（414）、pATAG5-HA-ATG12（416）、pATOG5-HA/ATG12-ATG16（416。设计的关键是克隆每个后续基因的位点在现有质粒中不存在。一步定点突变方案(Zheng等人，2004年)用于从ATG8型打开读取框以生成pATG8ΔR（414）。NotI-和NcoI-消化的Atg8ΔR片段与Atg8片段交换，生成pATG8ΔR-ATG4-ATG7-ATG10（414），其中ATG4通过BglII和SacII消化去除，然后进行钝化和重排，形成pATG8-ΔR-ATG7-ATG10。质粒pRFPAPE1（305）(Stromhaug等人，2004年)，pGFPATG11（416）（pGFPCVT9（416；Kim等人，2001年)，pYFPATG19（416）（pYFP-Cvt19；Shintani等人，2002年)，pCuHACFPATG11（414）(尤里米苏和克林斯基，2005年)和pATG18（415）（pCVT18（411）；Guan等人，2001年)前面已经描述过。

脉冲相位分析和免疫沉淀

收集在SMD+CA培养基中生长的中对数期5 ml细胞，并在500μl SMD中用20μCi标记35在30°C下保持5分钟。添加Chase培养基（5 ml含有2 mM半胱氨酸和1 mM蛋氨酸的YPD），在每个时间点收集1 ml细胞，用TCA沉淀，用丙酮洗涤，干燥，并在100μl MURB（50 mM磷酸钠、25 mM MES、pH 7.0、1%十二烷基硫酸钠、3 M尿素和0.5%β-巯基乙醇）中重新悬浮。添加玻璃珠以打破细胞，然后将每个样品煮沸并在800μl TWIP（0.5%吐温20，50 mM盐酸曲斯，pH 7.5，150 mM NaC1和0.1 mM EDTA）中稀释。上清液部分进行三重免疫沉淀：第一次用3μl Prc1抗血清进行沉淀，用蛋白A–Sepharose去除抗体-抗原复合物后的上清液用1μl Cps1抗血清免疫沉淀，然后用6μl Pho8抗血清免疫沉降；第二次和第三次免疫沉淀各进行两次，以消除先前抗血清的残留。

蛋白质提取和蛋白质印迹

酵母细胞在适当的培养基中在30°C至中对数期培养，收获后用10%的TCA重新悬浮，并在冰上保持30分钟。用100%丙酮清洗细胞颗粒，空气干燥，并在MURB缓冲液中重新悬浮。用玻璃珠旋转进一步破碎细胞，然后在75°C下加热10分钟。对于每个样品，0.2 OD600细胞单位通过SDS-PAGE分离，转移到聚偏氟乙烯膜上，并用适当的抗血清或抗体进行检测。

荧光显微镜

酵母细胞在选择性SMD培养基中生长到对数中期。为了标记液泡膜，细胞用0.8 mM FM 4-64染色15分钟，清洗，并在相同的培养基中培养30分钟。为了饥饿，将细胞转移到SD-N培养基中2小时。在成像之前，将1 ml细胞丸化并重新悬浮在30μl的相同培养基中。显微镜在室温下使用显微镜（IX71；Olympus）和100×Universal Plan Apochro物镜（Olympas）和相机（CoolSnap HQ；Photometrics）进行。显微镜由工作站（DeltaVision Spectris；Applied Precision，LLC）控制。使用DeltaVision softWoRx软件（Applied Precision，LLC）采集图像并进行去卷积。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院公共卫生服务拨款GM53396对D.J.Klonsky的支持。

笔记

本文中使用的缩写：Ape1，氨肽酶I；自动液位计，自噬相关；羧肽酶S；细胞浆-空泡靶向性；MKO，多次击倒；MVB，多泡体；PAS，吞噬细胞组装位点；PE，磷脂酰乙醇胺；Pgk1，磷酸甘油酸激酶。

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文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社