开发单元。作者手稿；PMC 2009年6月1日提供。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院54680
人ESCRT-II复合物的集成结构模型和膜靶向机制
马里兰州贝塞斯达美国卫生与公众服务部国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病国家研究所分子生物学实验室，邮编：20892。
- 补充资料
1
GUID:2A9136D4-1332-4ABB-ACAF-1D71E3D18696
总结
ESCRT-II在受体下调和多泡体生物发生中起着关键作用，从酵母到人类都是保守的。两种人类ESCRT-II复合物的晶体结构分别以2.6和2.9º的分辨率进行了测定。该复合体有三个叶，包含VPS22和VPS36各一个拷贝，以及VPS25的两个拷贝。该结构揭示了VPS22和VPS36亚单位都参与的动态螺旋结构域，它将GLUE结构域连接到ESCRT-II核的其余部分。流体力学分析表明，完整的ESCRT-II具有紧凑、闭合的构象。ESCRT-II通过螺旋直接与ESCRT-I VPS28 C末端结构域亚单位结合，C末端连接到VPS36-GLUE结构域。ESCRT-II通过Vps36 GLUE结构域和Vps22第一螺旋的脂质结合活性靶向内膜。这些数据为ESCRT-II综合体提供了统一的结构和功能框架。
结果
人ESCRT-II的晶体学分析
缺乏GLUE结构域的人ESCRT-II复合物的2.6μl晶体结构通过多次同晶替换（形式I；;). 该复合物包含两个VPS25分子、一个VPS22分子和一个VPS36拷贝。它具有类似于酵母ESCRT-II的三叶形(Hierro等人，2004年;Teo等人，2004年) (补充图1). 其中两个叶由VPS25亚单位组成，第三个叶由VPN36和VPS22组成(). VPS22和VPS36子单元形成大致平行的并排排列。VPS22和VPS36之间有一个广泛的接口，埋藏表面积为22252VPS22的前四个螺旋和VPS36的前三个螺旋来自一个新的螺旋域（HD，). 这种保守的螺旋结构域在酵母ESCRT-II的结构中不存在，因为对应于Vps36的前三个螺旋的序列在酵母ESCRT-II的结晶部分中不存在() (Hierro等人，2004年;Teo等人，2004年). HD是人类ESCRT-II晶体结构中最易移动的区域之一。事实上，VPS22和VPS36亚单位的HD螺旋具有香肠样电子密度。由于存在一些突出的笨重侧链，因此可以进行序列分配。VPS36亚基中连接螺旋H1和H2（残基202-211）的连接子在结构中不可见。ESCRT-II核心复合物的总B值为78.7º2然而，HD的平均B值为124.7，而平均B值则为61.22用于结构的其余部分(). 这表明HD要么松散地堆积在晶格中，要么具有内在的高迁移率。
人类ESCRT-II复合物的结构（A） 人类（本研究）和酵母ESCRT-II中显示的有序区域示意图(Hierro等人，2004年;Teo等人，2004年)复合物，与完整人类和酵母ESCRT-II复合物的结构域进行比较。（B） 综合体的总体结构。VPS25亚基之一的WH2结构域在电子密度图中很难看到，并且不包括在结构精细化中。图中使用其他亚单位的结构对缺失的VPS25-WH2进行了建模。（C） 综合体的俯视图，显示综合体相对平坦的“剖面”。（D） 溶剂平坦MIR图中的电子密度在核心VPS22–VPS36部分附近以1.0σ等高线表示。最终的精细结构显示在管模型中。（E） 形态I和形态II的晶体结构用B因子着色，以显示高（红色）和低（蓝色）迁移率区域。
ESCRT-II的螺旋畴（A） VPS22和VPS36的N端螺旋结构域（HD）。（B） 人类和酵母ESCRT-II在HD区域的比较。左侧显示了由人VPS22和VPS36形成的新观察到的N-末端螺旋结构域，与右侧酵母结构中看到的该结构域的分离的VPS22片段相比。
表1
| 水晶 | 原生形态I | TMLA衍生物 | K（K）2氯化铂6导数 | KAuCl公司4导数 | 原生形态II |
|---|
| 构造 | VPS36（170–386） | | | | VPS36（149–386） |
| VPS22（26–258） | | | | VPS22（1–258） |
| VPS25（1-176） | | | | VPS25（1-102） |
| 空间组，单位单元格 | P（P）21，a=70.2，b=89.2，c=91.4，β=101.5 | | | | P（P）三212，a，b=81.5，c=226.2 |
| 重原子浸泡条件 | | 10 mM，1天 | 1 mM，2小时 | 2 mM，1天 | |
| X射线源 | SER-CAT 22ID系列 | CuK（库克）α | CuK（库克）α | CuK（库克）α | SER-CAT 22-ID系列 |
| 波长（Å） | 1 | 1.5418 | 1.5418 | 1.5418 | 1 |
| 分辨率（λ）（最后一个shell） | 2.6 (2.69 – 2.60) | 3.6（3.73–3.60） | 3.1 (3.21 – 3.10) | 3.2 (3.31 – 3.20) | 2.9 (3.0 – 2.9) |
| 独特反射次数 | 30680 | 11712 | 19725 | 17604 | 19408 |
| I/σ（最后一个外壳） | 33.0 (3.1) | 16.1 (5.0) | 28.8 (4.5) | 23.8（4.2） | 41.3 (3.3) |
| Rsym公司一(%) | 4.9 (30.2) | 10.6 (33.1) | 7.1 (41.3) | 8.4 (43.3) | 4.7 (42.9) |
| 数据完整性（%） | 91.4 (61.1) | 94.7 (96.5) | 99.9 (100.0) | 99.8 (99.5) | 99.6 (99.5) |
| 阶段化和细化 | | | | | |
| 平均FOM（50–3.6º） | | | 0.54（解决） | | 先生 |
| 总体FOM（50–3.6º） | | | 0.75（分辨率） | | |
| R系数b条(%) | 23.8 | | | | 23.2 |
| 自由R系数c（c）(%) | 29.4 | | | | 31.7 |
| R.m.s.粘结长度（Ω） | 0.013 | | | | 0.010 |
| R.m.s.粘结角（°） | 1.463 | | | | 1.275 |
| 平均B值（Ω2)d日 | 78.7 | | | | 89.8 |
| 高清（22版34-76，36版172-225）124.7 | | | | 高清101.6 |
| 堆芯（V22 77–252，V36 226–385）61.2 | | | | 芯79.1 |
| VPS25 84.7型 | | | | VPS25 100.8型 |
VPS22、VPS25和VPS36均包含两个翼螺旋（WH）结构域重复，具有H1/β1/H2/H3/β2/β3拓扑结构。N端WH域（WH1）以头对尾的方式与C端WH区（WH2）进行打包。ESCRT-II复合体中的所有WH结构域相互重叠，r.m.s.d小于2º，尽管亚基之间没有可识别的序列相似性。
一个VPS25亚基的N端结构域与VPS22的C端结构域接触，另一个VPS25亚基与VPS36和VPS22都接触。VPS25亚基埋藏762μ2(63 Å2对于VPS22），在与VPS36和其他VPS25亚基埋藏1149º2与VPS22和VPS36结合后的表面积。VPS36近端VPS25亚基的WH2结构域沿c轴排列在晶格中，似乎完全无序，无法在电子密度图中显示。这表明VPS25在其两个WH域之间具有内在的灵活性。
VPS22的N端25个残基含有8个碱性带电残基，预计会形成α-螺旋(补充图2). 我们将该预测螺旋称为VPS22-H0。GLUE结构域和VPS36的C末端核心（残基140–169）之间的连接子还包含预测的α-螺旋，我们称其为VPS36-H0(). 为了揭示VPS22和VPS36的这些N端区域的结构，并获得关于HD的更详细信息，我们确定了2.9º的晶体结构（形式II，)第二个构造（构造a，). 第二种结构中删除了VPS25的柔性WH2结构域，以生成更有序的晶体。形式I和II的结构几乎相同，r.m.s.d.为1.25Å2晶型II在HD中表现出更好的电子密度。可以可视化VPS36的H1和H2之间的链接器。密度的提高也使我们能够确认HD中氨基酸的分配。VPS22-H0、VPS36-H0和相邻残基被扰乱。溶剂通道占据了晶体中可能被无序N端区域占据的空间。HD的平均B值为101.6欧2，高于79.1 Au的值2对于结构的其余部分，尽管低于形式I中的HD(). HD区域在两种不同的晶体形式中具有如此高的B因子，这一发现使我们得出结论，该区域具有内在的动态性。
ESCRT-II的解决方案结构和ESCRT-I相互作用（A） 在280 nm吸收监测的Superdex 200（16/60）柱上分析重组ESCRT-II复合物。完整ESCRT-I斯托克斯半径R的比较H（H）从大小排除数据中导出。计算的RH（H）ESCRT-II结构的晶体结构值与凝胶过滤标准的预期值精确对应。标准物显示为由牛甲状腺球蛋白（670 kDa，R）组成的开环（BioRad，Hercules，CA）H（H）=8.5 nm），牛γ球蛋白（158 kDa，RH（H）=5.3 nm），鸡卵清蛋白（44 kDa，RH（H）=2.7 nm）和马肌红蛋白（17 kDa，RH（H）=2.1纳米）。（B） 通过使用Hydropro将结构坐标拟合到（A）中所示四种结构的水动力数据，得出完整ESCRT-II的解构象(Garcia de la Torre等人，2000年). （C） 本研究中使用的结构。（D） GST下拉实验显示VPS28-CTD和各种ESCRT-II结构之间存在直接交互作用。用于分析的ESCRT-II结构如第2-8栏所示，以供参考。车道9和10显示了全长ESCRT-II与GST结合珠的结合缺失，作为对照。与VPS28-CTD结合阳性的复合物亚单位对应的带用彩色点突出显示，如面板（B）所示。
完整ESCRT-II复合物的溶液构象
为了研究全长ESCRT-II络合物在溶液中的构象，我们测量了Stokes半径RH（H）各种ESCRT-II结构。构造物的斯托克斯半径是使用用已知R的标准物校准的尺寸排除色谱法（SEC）获得的H（H）(). 为了深入了解全长ESCRT-II的整体形状，我们定位了GLUE域结构(Alam等人，2006年;Hirano等人，2006年)基于RH（H）来自SEC实验的值(). 调整胶水域的位置，直到计算出RH（H）与实验值一致，在0.1nm以内。可以排除结晶核和GLUE域之间涉及扩展连接体的构象，因为这些构象预测RH（H）值大大高于实际观察值(补充图3). 另一方面，GLUE域与WH域相对填充的构象导致预测RH（H）低于实验值的值。基于这一研究，我们得出结论，GLUE结构域可能与结晶的ESCRT-II核心的HD结构域紧密堆积，并且人类ESCRT-II在溶液中处于紧密的闭合构象().
人类ESCRT-I和ESCRT-II之间的相互作用
酵母ESCRT-I通过Vps28的C末端结构域（CTD）与ESCRT-II相互作用(Kostelansky等人，2006年;Teo等人，2006年)Vps36的NZF1域(Gill等人，2007年;Teo等人，2006年). 然而，人类ESCRT-II不包含NZF域。人类ESCRT-I和II之间结合的证据来自对ESCRT-II和II亚基之间成对相互作用的酵母双杂交分析(Langelier等人，2006年). 然而，双杂交研究中表达的分离ESCRT亚基包含广泛的非合作疏水区。在生理条件下，这些蛋白会被埋藏在更大的复合体中，导致假阳性率可能升高。鉴于Vps28 CTD表面存在重要的保守序列(Gill等人，2007年;Pineda-Molina等人，2006年)以及酵母和人类CTD序列之间36%的序列一致性，我们推测该结构域可能在与ESCRT-II结合中具有保守作用。因此，我们试图在直接结合分析中使用纯化的、稳定的、独立折叠的VPS28 CTD和各种形式的纯化的、完全组装的ESCRT-II复合物，重新审视人类ESCRT-I和II之间的相互作用().
全长ESCRT-II构造绑定到VPS28-CTD，但不绑定到GST控制(). 分别删除了GLUE域、VPS25 WH2域和VPS22-H0（构造a、d、e和f）的构造也绑定到VPS28-CTD。然而，含有VPS36-H0的缺失残基149–169的结构体没有与VPS28-CTD相互作用，这表明VPS36-H0和/或相邻残基是与VPS28 CTD结合所必需的。VPS36这一区域的作用与双杂交分析一致(Langelier等人，2006年). 为了精确定位该位点，将两个保守残基突变为多胺。VPS36-H0（结构体m2）中的一个四重突变体IERK（159-162）AAAA与野生型和另一个突变体（结构体m1、，). 对VPS36短区域（残基147-171和残基147-201）进行GST标记构建，以测试这些隔离区域是否足以结合。这些结构没有拉下VPS28-CTD()也没有分离的GLUE域(，数据未显示）。因此，VPS36-H0对于与VPS28-CTD的相互作用是必要的，但还不够。我们试图表征VPS28-CTD-ESCRT-II络合物在溶液中的构象。这两种通常可溶的蛋白质的混合物导致了它们的沉淀。最简单的解释是VPS28-CTD和ESCRT-II的结合导致一个或两个伙伴的构象变化。
人ESCRT-II膜靶向性的决定因素
为了研究人类ESCRT-II中的脂质特异性和膜结合位点，我们测试了不同ESCRT-III构建物与不同成分的脂质囊泡的结合(). 为了方便起见，我们使用了一个伪接触ESCRT-II（构造f，)缺乏VPS25-WH2作为比较的基线。这种结构与囊泡以及或优于完整的复合物结合(补充图4)我们发现它更稳定，并且可以比完整的络合物高几倍的产率进行纯化。在这种伪接触复合物的背景下进行了以下缺失结构：GLUE结构域（结构e）的缺失、VPS22（结构h）的基本N末端24个残基（Δ1–24）的缺失以及GLUE和VPS22-H0（结构c）的双重缺失。纯化的假接触ESCRT-II与由磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PIP）组成的合成脂质体有很强的结合力()与PC:PE和PC:PE:磷脂酰肌醇（PI）脂质体弱结合(). VPS22-H0（结构体h）的缺失显著降低了与所有受试PIP的膜结合。然而，VPS22-H0的缺失对PC:PE脂质体的结合没有明显影响(). GLUE域删除与PC:PE和PC:PE:PI失去绑定(). 删除VPS22的GLUE和Δ1–24（构造c）基本上取消了与所有测试成分的结合(). 从这些数据中，我们得出以下结论。人类ESCRT-II与PIP结合强烈但相对杂乱，与不带电脂质结合较弱。全膜结合需要GLUE结构域和VPS22-H0。
ESCRT-II复合物的脂质体结合将ESCRT-II复合物的纯化构建物与脂质体混合。（A） 用于脂质体结合分析的ESCRT-II结构物仅供参考。为了方便起见，所有用于结合分析的构建物都缺少VPS25-WH2。然而，该构造与全长ESCRT-II的绑定基本相同(补充图3). （B） 与PC的结合：PE脂质体。分子量标记如车道1所示。上清液中的未结合样品显示在2-5道中，以供参考。（C） –（J）脂质体与不同脂质成分的结合结果。将不同量的PI和PIP混合到PE:PC混合物中，以检查特异性。选择PIP的摩尔分数以在膜上保持恒定的电荷密度。（K） 颗粒中蛋白质的相对量以条形显示。构建物双缺失构建物（c）与所有受试脂质体的结合可忽略不计，但未显示在条形图中。
Vps22-H0的功能角色
Vps22-H0从酵母到人类都是保守的，在这个区域这两个物种之间有30%的序列一致性(补充图2). 确定Vps22-H0对ESCRT-II的货物分拣功能是否重要体内，在表达野生型和突变等位基因的酵母中检测ESCRT底物Cps1的定位第22版酵母Vps22在N-末端50个残基中含有9个带碱性电荷的残基。测试Vps22的N端区域对货物分拣功能的贡献体内，我们构建了一个N末端30残基缺失突变体Vps22Δ1–30(补充图2). 如预期(Babst等人，2002年),vps22Δ表现为GFP-Cps1定位错误，位于突出的E类隔室，且在空泡腔中缺失(). 野生型表型完全由携带野生型的质粒拯救VPS22系列(). 的表达式第22页Δ1–30导致一些空泡GFP-Cps1定位()，但大多数货物保留在限制膜上，与弱E类表型一致。这表明Vps22-H0对ESCRT-II的货物分拣功能很重要。
Vps22和Vps36突变体的货物分类和定位（A–L）每列最上面的面板显示了GFP-Cps1结构（绿色）在不同菌株中的排序，如每列顶部所示。（M–S）Vps22-GFP监测的指定ESCRT-II结构在指定菌株中的定位。中间的面板显示了FM4-22 64（红色）标记的液泡的限制膜，下面的面板显示DIC图像。此处显示的结果是对所示每个菌株>100个细胞的观察结果。
接下来，我们试图确定Vps22-H0在功能上是否与Vps36-GLUE域合作。酵母Vps36 GLUE域PI（3）P结合囊双突变体，虚拟专用交换机36R89A/R261A具有强烈的E类表型(Teo等人，2006年). 我们发现单个GLUE域突变体虚拟专用交换机36R89A型和第36页R261A型用a表示vps36Δ背景分别具有接近正常和正常的功能(). 然而，当这些突变体中的任何一个与第22页Δ1–30在一个vps22Δ vps36Δ背景，观察到强烈的E类表型(). 功能丧失比任何单个突变体都强烈，这与Vps22-H0和Vps36-GLUE结构域在ESCRT-II的排序功能中合作的概念一致。
为了确定分选缺陷是否是由于膜靶向的改变，评估了野生型和突变型Vps22-GFP结构的定位(). ESCRT组分广泛分布于野生型酵母中，因为作为其正常功能的一部分，胞内ESCRT快速循环到胞浆中。然而，在vps4Δ抑制了ESCRT组分从内胚小室的分离，从而可以监测它们的内胚定位。与以前的结果一致(Babst等人，2002年)，Vps22-GFP广泛分布于vps22Δ背景()，但发现于vps4Δvps22Δvbs36Δ应变，应变(). 单个GLUE域突变体虚拟专用交换机3689A兰特和虚拟专用交换机36R261A型分别表现为Vps22-GFP在vps4Δvps22Δvbs36Δ应变，应变(). 因此，这些突变并未实质性损害ESCRT-II靶向性。这个VPS22系列Δ1–30-绿色荧光粉等位基因主要表现为点状定位，与野生型相比，弥漫性定位略有增加VPS22系列(). 这个VPS22系列Δ1–30-GFP公司等位基因与任何一种结合第36页89A兰特或虚拟专用交换机36R261A型然而，显示出完全扩散的定位模式(). 因此，Vps22-H0和GLUE结构域中的这些缺陷仅在组合中消除了ESCRT-II的内胚定位。
讨论
结构分析的一个主要目标是获得分子组装的整体图像。这通常是通过使用电子显微镜或溶液状态技术将较小碎片的高分辨率x射线和核磁共振结构与完整络合物的低分辨率数据相结合来实现的。在ESCRT-II的情况下，WH域核心的原子结构可用(Hierro等人，2004年;Teo等人，2004年)，NZF1结构域(Gill等人，2007年)和酵母复合物的胶状结构域(Teo等人，2006年)和人类复合体的GLUE域(Alam等人，2006年;Hirano等人，2006年). 缺少一个基本组件来模拟完整的ESCRT-II结构：Vps22 N末端和Vps36中GLUE和WH域之间预测螺旋区域的结构。我们现在发现，每个亚单位（H0）核心的N末端预测螺旋最灵活地附着在核心组件上。我们已经能够为这两个区域中的每个区域分配函数。VPS22-H0参与膜结合，而VPS36-H0与ESCRT-I相互作用。晶体学分析的最重要发现是，ESCRT-II包含由VPS22和VPS36亚基组成的螺旋结构域。如下所述，此域似乎是GLUE域的结构平台。
虽然ESCRT-II太小，无法进行低温电子显微镜重建，但我们已经能够使用流体动力学分析(Garcia de la Torre等人，2000年;Kostelansky等人，2007年)连同ESCRT-II核心结构和先前确定的GLUE域结构(Alam等人，2006年;Hirano等人，2006年)以模拟溶液中完整的人类复合体的构象。该分析清楚地表明，人ESCRT-II在溶液中具有紧密构象。这与ESCRT-I复合体形成了鲜明对比，其中功能域从自由伸缩的连接器上的核心延伸出去(Kostelansky等人，2007年). 已知晶体结构和实验流体力学数据施加的约束表明，GLUE畴必须直接接触螺旋畴。因此，螺旋结构域的一个功能似乎是在ESCRT-II的闭合构象中支撑GLUE结构域。
目前的ESCRT功能模型调用了内胚层膜上多个ESCRT复合物的顺序或协同组装(Hurley，2008年;尼克森等人，2007年;Saksena等人，2007年;Williams和Urbe，2007年). 通过ESCRT-I Vps28-CTD和ESCRT-II Vps36 NZF1结构域之间所需的相互作用，酵母ESCRT-1和II复合物聚集在一起(Gill等人，2007年)，尽管还没有排除其他交互作用的存在。事实上，我们发现酵母ESCRT-I/II超复合物在溶液中是致密的（Kostelansky和J.H.H.，未发表），这与存在多个相互作用位点一致。人类ESCRT-II缺乏NZF结构域，现有证据表明它与人类ESCRT-1直接相互作用，但仅限于对分离亚基的双杂交研究(Langelier等人，2006年). 在这里，我们发现人类ESCRT-II与人类VPS28-CTD强烈相互作用。ESCRT-II VPS36-H0中的图案对于这种交互是必要的，但还不够。该基序在酵母Vps36中保守，这与酵母ESCRT-I/II相互作用涉及多个接触点的可能性一致。观察到该基序对相互作用是必要的，但不足以说明ESCRT-II对ESCRT-I的识别涉及一个扩展的表位。
基于ESCRT-II HD区域的高度动态性质，以及在混合ESCRT-II和ESCRT-I VPS28-CTD时观察到的溶解度急剧变化，我们推测ESCRT I/II超复合体的形成需要很大的构象变化。当酵母ESCRT-II或其Vps25亚基与酵母ESCRT-III亚基Vps20混合时，观察到类似的溶解度变化(Teo等人，2004年). 当ESCRT相互组装和与膜组装时，评估是否存在广泛的构象变化将是有趣的。这些变化可能对ESCRT系统催化的膜重塑相互作用具有重要意义。
ESCRT-II的膜靶向机制已引起广泛关注。ESCRT-II在功能上被ESCRT-II激活。然而，ESCRT-I的招募并不需要ESCRT-I1，因为ESCRT-III亚单位的过度表达可以挽救ESCRT-Il的丢失(Babst等人，2002年). 在没有ESCRT-I的情况下，酵母ESCRT-II与含PIP的脂质体具有中到高亲和力(Kostelansky等人，2007年;Teo等人，2004年;Teo等人，2006年). 在Stenmark及其同事对人类ESCRT-II的研究中，PIP结合的主要位点首次定位于GLUE域(Slagswold等人，2005年). 本研究表明，人类ESCRT-II GLUE结构域结合在体外固定PI（3,4,5）P三以点位格式，在较小程度上为PI（3,4）P2和PI（3,5）P2(Slagsvold等人，2005年). PI（3,4,5）P三通常存在于受胰岛素和PDGF等激素刺激的细胞的质膜上，但不是内胚层膜的特征。相反，酵母ESCRT-II的GLUE结构域在脂质体中表达时优先与PI（3）P结合，分离的酵母GLUE区域在培养的人类细胞中表达时靶向内体(Teo等人，2006年). 在这里，我们通过比较完整的和GLUE-domain缺失的ESCRT-II复合物，推断出人类ESCRT-II-GLUE结构域与多种磷脂酰肌醇结合。GLUE结构域的缺失显著降低了与内胚体脂质PI（3）P和PI（3,5）P的结合2，但更适度地减少与PI（3，4，5）P的结合三与GLUE域删除相比，删除Vps22-H0对PI（3）P和大多数其他PIP的绑定影响不大。然而，Vps22-H0缺失减少了与PI（3,5）P的结合2和PI（3,4,5）P三与GLUE域删除的程度大致相同。我们推断Vps22-H0和聚阴离子PI（3,5）P之间存在强静电相互作用2和PI（3,4,5）P三人类ESCRT-II与PI（3）P和PI（3,5）P结合的能力2与ESCRT-II的内体功能一致。与PI（3,4,5）P的结合三和其他非内胚体PIP与先前的GLUE-PI（3,4,5）P报告一致三相互作用(Slagswold等人，2005年)但就ESCRT-II的内体作用而言，很难合理化。果蝇ESCRT-II的胶结构域与二倍体mRNA结合(Irion和St Johnston，2007年). 因此，人类ESCRT-II结合高酸性脂质的倾向可能反映了这种或其他非内体功能(Slagswold等人，2006年)与各种高酸性配体结合。
观察到Vps36 GLUE结构域和Vps22 H0都有助于体外脂质结合，这提示我们进化出一种组合机制来驱动ESCRT-II的高亲和力膜靶向(). 多价膜靶向在ESCRT系统和其他贩运途径中广泛用于信号整合和符合检测。鉴于ESCRT-I参与了ESCRT-II的功能激活，令人感兴趣的是，ESCRT-I1与一个非常靠近膜结合位点的ESCRT-II区域结合，并且这种相互作用似乎会触发结构变化。总之，我们在这里导出了一个结构和概念框架，以更精确地从机械上理解ESCRT-I和ESCRT-II膜结合之间的相互作用。更重要的是，这里推导出的ESCRT-II的组织结构，以及Vps27-Hse1整体结构的类似模型(Prag等人，2007年)和ESCRT-I(Kostelansky等人，2007年)复合物将支持ESCRT系统的高阶结构研究。
实验程序
蛋白质表达和纯化
通过基于PCR的基因合成合成了人类VPS22、VPS25和VPS36的全长基因。寡核苷酸由DNAWorks计划设计(胡佛和卢布科夫斯基，2002年). 基因的核苷酸序列在大肠杆菌和pST39载体的多个克隆位点中的限制性内切酶识别序列从基因中删除，以便将多个基因高效克隆到载体中。VPS22被一个N末端六组氨酸和一个TEV蛋白酶裂解位点标记。质粒被转化为大肠杆菌菌株BL21（DE3）Star，在30°C下过夜表达。将细胞重新悬浮在缓冲液中（2X PBS加20 mM咪唑），并通过超声波进行裂解。使用镍分离ESCRT-II复合物2+亲和层析。浓缩洗脱液，用TEV蛋白酶去除组氨酸标签。通过Superdex S200尺寸排除色谱进一步纯化ESCRT-II复合物。将含有络合物的部分浓缩在10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和100 mM NaCl的缓冲液中。
结晶
构造g的I型晶体()在25°C的温度下，通过蒸汽扩散法在100 mM醋酸钠（pH 4.5）、5%聚乙二醇4000和15%甘油的贮存器上生长一周。晶体在添加20%（v/v）甘油的储液中进行冷冻保护，并在N295 K下的气体。通过共结晶或将晶体浸泡在重原子溶液中制备重原子衍生物晶体。构造a的II型晶体()采用显微进料技术在100 mM Tris-HCl（pH 8.5）、40%PEG300中获得。
结晶分析
I型晶体VPS36 GLUE域和VPS22 H0截断的本地数据（构造g，)在APS光束线22-ID处用MAR CCD探测器从单个冷冻晶体中采集到2.6º的分辨率。数据集是各向异性的，沿c方向的弱衍射仅延伸至2.9°分辨率。所有数据均使用HKL2000（HKL Research）进行处理和缩放。重原子导数数据集是通过连接在Rigaku旋转阳极发生器上的R-AXIS IV成像系统收集的，该发生器提供Cu Kα辐射。使用SOLVE程序执行MIR定相(Terwilliger和Berendzen，1999年)分辨率为3.6Å()RESOLVE进一步改善了相位(特威利格，2000年). 使用程序O将初始模型手动构建到密度修改图中(Jones等人，1991年)和库特(埃姆斯利和考坦，2004年). 通过比较酵母ESCRT-II复合物的同源结构，促进了对主链的追踪。然后利用模型相位组合对密度图进行了改进，分辨率提高到2.6º。使用CNS进行精炼(Brunger等人，1998年)和Refmac(CCP41994年). 形式I的最终模型包括来自VPS36的残基172-385、来自VPS22的残基34-252以及来自VPS25的残基4-176和5-101。在Ramachandran地块的最有利和额外允许区域中有97.2%的残留。七个残基在不允许的区域中有构象，所有这些残基都位于链末端、螺旋结构域或柔性VPS25 WH2结构域的高迁移率区域。II型晶体的结构（构造a，)以I型结构为起始模型，通过分子替换程序MOLREP确定。VPS36的残基149–169和VPS22的残基1–25存在于构造a中，但无法在电子密度中显示，推测它们是无序的。所有结构图均采用PyMOL（W.Delano，http://pymol.sourceforge.net/)
流体动力学建模
形式I的结晶结构中存在但在电子密度中缺失的N端和C端残基（VPS25中的残基1-3、VPS22中的残体27-33和253-258）被建模为随机线圈，并使用交互式图形反复调整随机线圈构象，直到计算和实验RH（H）值在<0.1nm内一致(). 基本上，相同的程序用于放置VPS22-H0和VPS36-H0，它们在二级结构预测的基础上建模为螺旋，使用形式II的晶体结构和相应的RH（H）价值(). 通过交互定位GLUE域，对全长ESCRT-II进行建模，以获得计算值与实验值之间的一致性H（H）值(). 人类ESCRT-II胶结构域的结构是从PDB条目2HTH获得的(Alam等人，2006年).
下拉分析
对于GST下拉物，使用结合缓冲液（1X PBS）预洗50µl谷胱甘肽琼脂糖树脂。GST标记的人VPC28 C末端结构域（残基123–220）与树脂结合。将人ESCRT-II复合物的各种纯化结构与GST-VPS28 CTD-结合树脂在室温下混合30分钟。GST结合树脂作为阴性对照。然后用1X PBS洗涤珠子三次，并用SDS-PAGE分析结合蛋白。
脂质体结合实验
本研究中使用的合成脂质均购自Avanti Polar lipids，但来自Echelon的PI（3）P除外。所有脂质体都含有0.5%的染料，用于脂质体定量的赖氨酸-罗丹明B。脂质体在总脂质浓度为1 mg/ml的条件下制备，方法是使用氮气流从所需的脂质混合物中蒸发溶剂。将干燥的油脂重新悬浮在150 ml 0.3 M蔗糖中，并在室温下在氮气下培养1小时，周期性地旋转；添加1ml水，并将样品在128000×g的超离心机中在4°C下沉淀30 min。去除上清液，将颗粒冷冻并在液氮中解冻三次。将颗粒溶解在1 ml缓冲液A中（20 mM HEPES，pH 7.4和150 mM NaCl），并通过0.1µm过滤器挤压10次。对于结合实验，将100µg脂质体与80µg蛋白质混合，并用缓冲液a将其总体积增加至200µl，在室温下培养30 min，并在4°C下在128000×g沉淀30 min。用200µl缓冲液a洗涤一次小球，然后再次沉淀30 min。上清液（10µl）和沉淀的样品通过SDS-PAGE进行分析。使用LabWorks 5.6程序（UVP）测量SDS-PAGE凝胶中的条带强度。
质粒构建和酵母菌株
这个vps22Δ vps36Δ通过替换虚拟专用交换机36一个含有抗诺沙星基因的基因vps22Δ同源重组菌株。这个vps4Δ vps22Δ vps36Δ菌株是通过VPS4和URA3基因在vps22Δ vps36Δ应变。从酵母基因组DNA中扩增出Vps22的完整表达盒和Vps36的开放阅读框，并分别克隆到YCplac111和pRS413MET25载体中。通过快速突变（Stratagene）引入Vps22的N末端30氨基酸缺失和Vps36的R89A和R261A突变。使用PCR将绿色荧光蛋白（GFP）编码的DNA融合到vps22盒的3’端，并将PCR产物克隆到YCplac111载体。质粒编码VPS22系列和虚拟专用交换机36基因和pGO45载体被转化为野生型和突变株。使用了以下酵母菌株：BY4741（MAT一 his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)，BY4741vps22Δ::KanR公司，BY4741vps36Δ::堪萨斯州共和党，乘4741vps22Δ::KanR vps36Δ::NATR公司，BY4741vps22Δ::KanR vps36Δ::NATR vps4Δ::URA3公司.
显微镜
表达适当等位基因的酵母菌株在0.4–0.6的A660处收获，并用FM4-64标记以进行液泡膜染色(Vida和Emr，1995年). 活细胞在30℃下摄取FM4-64 1小时，然后将细胞重新悬浮在选择培养基中，并在30℃培养30分钟。细胞的可视化在配备异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明滤光片的LSM510荧光显微镜（Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）上进行，该滤光片由数码相机拍摄。
致谢
我们感谢Will Prinz和Beverly Wendland对酵母实验的技术建议，感谢W.P.和Greg Odorizzi提供质粒和酵母菌株，感谢Boris Baibakov对酵母显微成像的技术帮助，感谢SER-CAT工作人员对高级光子源（APS）的用户支持，感谢B.W.对手稿的评论。美国能源部基础能源科学办公室根据第W-31–109-Eng-38号合同支持APS的使用。本研究得到了NIH内部支持、NIDDK和IATAP的支持。
脚注
协调
结晶坐标已保存在蛋白质数据库中，晶体形态I的登录代码为3CUQ，形态II的登录代码是2ZME。
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
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