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分子生物学细胞。2008年7月；19(7): 2777–2788.
数字对象标识：10.1091/桶。E07-10-0995号
预防性维修识别码：项目经理2441662
PMID：18417615

PACS-2介导Calnexin的亚细胞分布

内森·米希尔,* 艾米丽·林斯,* 贾拉尔·南吉,* Anastasia D.布拉戈维申斯卡娅,†‡ 郝飞,†§ 卡蒂亚·卡米恩·西蒙,†‖ 蒂莫西·J·库珀,* 加里·托马斯,†和托马斯·西蒙通讯作者*†
亚当·林斯特特，监控编辑器
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摘要

Calnexin是一种内质网（ER）凝集素，可介导粗内质网上的蛋白质折叠。Calnexin还与定位于线粒体相关膜（MAM）的内质网钙泵相互作用。根据内质网内稳态，不同数量的calnexin靶向质膜。然而，迄今为止尚不清楚calnexin的调节分选机制。我们的结果现在描述了calnexin与细胞溶质分选蛋白PACS-2的相互作用是如何在粗面内质网、MAM和质膜之间分配calnexiin的。在控制条件下，80%以上的calnexin定位于内质网，大多数位于MAM上。PACS-2敲除破坏了内质网内calnexin的分布，并增加了其在细胞表面的水平。两种calnexin胞质丝氨酸（Ser554/564）的蛋白激酶CK2磷酸化降低了calnexiin与PACS-2的结合。与此一致，Ser554/564保存图片、插图等的外部文件。对象名为cjs3589.jpg天冬氨酸磷酸模拟物突变通过增加细胞表面的calnexin信号和减少MAM上的calnexan信号，部分复制PACS-2敲除。PACS-2敲除不会减少其他ER标记的保留。因此，我们的结果表明，calnexin胞质结构域的磷酸化状态及其与PACS-2的相互作用将这种伴侣分子分类在内质网结构域和质膜结构域之间。

简介

内质网的一个主要功能是伴侣介导的新合成蛋白质的氧化折叠，被认为在伴侣的帮助下发生在rER上的转座子附近(Chen和Helenius，2000年). 最近的研究已经开始将内质网视为一种多功能细胞器，它由专门用于特定任务的不同域组成。例如，粗内质网（rER）上发生的氧化蛋白质折叠或与线粒体相关膜（MAM；万斯，1990年;博尔杰塞等。, 2006;Levine和Loewen，2006年). 许多内质网蛋白，包括伴侣蛋白，定位于多个内质网膜域，在那里发挥不同的功能。例如与富含MAM的IP相互作用的伴侣calnexin（CNX）、calreticulin和ERp44三R和SERCA2b(约翰等。, 1998;罗德里克等。2000年;肥后等。, 2005).

基于外壳和受体的保留和提取机制确保内质网折叠伴侣和氧化还原酶定位于内质网(Teasdale和Jackson，1996年;Duden，2003年;米歇尔森等。, 2005). 然而，除了内质网的多个结构域外，在质膜上还发现了许多内质网伴侣，如BiP/GRP78、PDI和CNX，这表明它们在分泌途径中的细胞内滞留和运输是不同的(维斯特等。, 1995;梅兹拉尼等。2000年;阿拉普等。, 2004;米斯拉等。, 2006). 例如，高水平的CNX是未成熟胸腺细胞质膜的特征。相反，ER应力可以减少表面CNX(维斯特等。, 1995;冈崎等。2000年). 改变质膜上CNX的数量可能会影响细胞表面特性，并可能影响吞噬作用或细胞-细胞相互作用(加格农等。, 2002). 因此，质膜上CNX的数量可能取决于细胞类型或细胞内稳态，这可能是调节细胞内滞留的结果。

除了折叠中间体、核糖体和SERCA2b外，CNX还与BAP31相互作用，BAP31是一种内质网货物受体，调节内质网跨膜蛋白的输出，并将其运送至内质网质控室(安娜特等。, 1997;蜘蛛炎等。2000年;卡姆希·内舍尔等。, 2001;祖皮尼等。, 2002;法国等。, 2004;禅宗等。, 2004;格罗恩迪克等。, 2006;瓦卡纳等。, 2008). 迄今为止，这种相互作用的唯一功能意义是在细胞凋亡开始时调节BAP31的caspase裂解(祖皮尼等。, 2002;布雷肯里奇等。, 2003;格罗恩迪克等。, 2006). 目前尚不清楚BAP31是否会影响CNX的细胞内靶向性。

总之，CNX可以到达质膜，也可以与ER的多个结构域（如MAM）上发现的许多ER膜蛋白相互作用。虽然CNX和其他ER伴侣明确定位于多个细胞膜，但目前尚不清楚细胞是否具有控制这些不同位置之间伴侣分布的机制。

对内质网蛋白在特定膜域的受控分布假说的支持来自于对CNX的开创性研究(雪佛兰等。, 1999;罗德里克等。2000年). 这些文章表明，蛋白激酶C（PKC）、细胞外信号调节激酶-1（ERK-1）和蛋白激酶CK2（CK2）可以磷酸化CNX胞浆结构域。ERK-1在丝氨酸583上的磷酸化增加了CNX与核糖体的相互作用，也增加了与SERCA2b的相互作用。此外，CK2对丝氨酸554和564的CK2磷酸化与ERK-1对丝氨酸583的磷酸化协同促进与核糖体的相互作用(雪佛兰等。, 1999). 因此，CNX磷酸化状态可能导致MAM和rER上的富集，在那里可以发现这些CNX相互作用物。然而，目前尚不清楚体内存在的去磷酸化CNX会发生什么变化(Wong（王）等。, 1998).

CNX的CK2位点，而不是ERK-1位点，嵌入在酸性簇内（参见图1A） ●●●●。有趣的是，CK2-磷酸化酸性簇是PACS家族蛋白质的标志性相互作用序列，包括PACS-1和PACS-2(万等。, 1998;科特根等。, 2005;西蒙等。, 2005;费利钱杰利等。, 2006;斯科特等。, 2006). 这些酸性基序与PACS蛋白的相互作用介导了多种细胞内靶向步骤，包括反式-高尔基体（TGN）网络和内体，定位于线粒体并滞留在内质网中。货物蛋白通常可以与PACS-1和PACS-2相互作用(科特根等。, 2005;费利钱杰利等。, 2006). 货物蛋白与PACS相互作用产生的细胞内靶向性通常受到三元复合物与其他蛋白质形成的影响，这些蛋白质包括共聚体（COPI）、衔接蛋白甚至CK2本身(Crump公司等。, 2001;科特根等。, 2005;斯科特等。, 2006;阿特金斯等。, 2008). CK2对与酸性基序相关的丝氨酸的磷酸化作用通常作为促进或阻止与PACS蛋白质相互作用的开关(舍默尔等。, 2005;斯科特等。, 2006).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zmk0070885860001.jpg

CNX的鉴定，PACS-2的潜在相互作用体。（A） 犬CNX细胞溶质结构域示意图。残基554和564的CK2位点以红色突出显示，而残基583的ERK-1位点以绿色显示。（B） 一部分CNX与PACS-2共定位于线粒体附近。HeLa细胞在盖玻片上生长24小时，并进行免疫荧光显微镜检查。用小鼠单克隆抗体（BD Biosciences）检测CNX，用兔多克隆抗血清（604）检测PACS-2，用预加载的线粒体检测线粒体。底行，放大区域，用覆盖图上的白色边框指示。白色箭头，PACS-2/线粒体重叠；红色箭头，三重重叠。比例尺，25μm。

多功能细胞溶质分选蛋白PACS-2与COPI相互作用，并通过细胞溶质CK2-磷酸化酸性簇控制跨膜蛋白如多囊蛋白-2或profurin的内质网定位(科特根等。, 2005;费利钱杰利等。, 2006). PACS-2还介导从早期内体到TGN的内化阳离子非依赖性甘露糖6-磷酸受体（CI-MPR）的分选，并与HIV-1 Nef相互作用，形成触发MHC-I下调的多激酶级联反应(阿特金斯等。, 2008). 此外，PACS-2促进MAM的完整性并调节其成分(西蒙等。, 2005). 因为在细胞凋亡开始时，MAM含有内质网和线粒体之间的钙通讯机制(里祖托等。, 1998;戈茨等。, 2007)PACS-2的敲除降低了ER–线粒体钙交换和细胞凋亡触发(西蒙等。, 2005).

在这里，我们将CNX鉴定为内质网上的一种新型PACS-2货运蛋白。CNX利用其酸性CK2基序与PACS-2相互作用。尽管磷酸化形式的序列增加了与核糖体的相互作用(雪佛兰等。, 1999)，我们的结果表明，非磷酸化CK2基序与PACS-2相互作用，从而将CNX保留在内质网内，并促进CNX定位到内质网的厚膜和MAM。这种PACS-2定位机制是特异性的，因为敲低PACS-2不会显著影响缺乏PACS-2基序的内质网蛋白的膜分级，如BAP31、核黄素I或PDI。它也不会导致BAP31的ER保留率降低。因此，我们的结果表明，CNX与PACS-2的磷酸调节相互作用如何导致其分布在质膜、rER和MAM之间。因此，PACS-2相互作用决定了可用于与rER上的核糖体和MAM上的SERCA2b相互作用的CNX量。

材料和方法

抗体和试剂

所有化学品均来自Sigma（加拿大安大略省奥克维尔）。PACS-1和PACS-2表达病毒和兔抗PACS-1（601）和抗PACS-2（604）抗体(西蒙等。, 2005). 针对BAP31的多克隆抗血清由G.Shore（Montréal，QC，Canada）提供，单克隆抗生物素是L.Berthiaume博士（Edmonton，AB，Canada）赠送的。使用的抗体如下：肌动蛋白、BAP31、PDI、核黄素-I、ACAT1、Sec61α（亲和生物试剂，Golden，CO）；ERGIC53（瑞士劳森亚历克西斯）；线粒体复合体II（MitoSciences，Eugene，OR）；硫氧还蛋白（Invitrogen，Carlsbad，CA）；CNX（多克隆：Stressgen，BC维多利亚；单克隆：BD Biosciences，Mississauga，ON，Canada）；BiP（BD Biosciences，密西索加，安大略省，加拿大）；β-COP（MaD，GeneTex，德克萨斯州圣安东尼奥）；GM-130和caspase-3（细胞信号传导，丹佛，MA）；FLAG标签（宾夕法尼亚州吉尔伯茨维尔，罗克兰）；和血凝素（HA）标签（加利福尼亚州伯克利市科万斯）。CNX野生型和敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）来自M.Michalak（加拿大爱德蒙顿）。HeLa细胞来自ECACC（英国波顿顿）。人和小鼠PACS-2小干扰RNA（siRNAs；HSS146279，MSS211622）来自Invitrogen。所有其他siRNAs之前都有描述。

表达载体与突变

PACS-2质粒先前有描述(西蒙等。, 2005). 狗CNX cDNA由E.Chevet（加拿大QC Montréal）提供。对于谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）结构，特异性引物（Sigma）用于通过PCR产生尾部突变，如文中所示。使用BamHI和XhoI限制位点将PCR产物插入pGEX4T1（GE Healthcare，Baie d'Urfé，QC，加拿大）。对于丝氨酸554和564的突变，我们使用了以下寡核苷酸：TS157:GCAGATGCTGGAAGAAGATGGCGCCACCGCACAAGAGGACGAT；TS158:GGTGCGCCATCTTCTTCAGCATCTGCTTTTTGCTTCTCTTCAAGTTT；TS173:GCTGAAGAAGATGGCGGCAGCTGATACAGAGGACGAGAGAGAGG；和TS174:CAGCTGGCCGCCATCTCTTCAGCATCATCTTTTTGCCTCTTC。

FLAG标记的CNX构建如下：首先，PCR在信号序列后插入管腔FLAG标记。我们使用了以下交错引物：TS262:TACAAGGACGATAGACAGGACATGAGACATGATGATATG；TS263:ATGTTACTGGTCCTTGGAACTACTGTCAGGCTGACTAGAGACGACGAC；和TS264:TATGTACCACATGGAAGGAAATGTGCTGTATGTTACTGTCCTTGGAACTAC。

接下来，使用诱变寡核苷酸来重新产生GST突变体。

免疫荧光显微镜、转染和蛋白质印迹

免疫荧光显微镜的处理如下。简单地说，HeLa细胞在盖玻片上生长24小时（未转染细胞）或72小时（当siRNA-转染时）。用含有1 mM CaCl的PBS清洗细胞2和0.5 mM氯化镁2（公共广播系统2+)用PBS清洗后，用3%多聚甲醛固定20分钟2+，用0.1%Triton X-100，0.2%BSA在PBS中透化细胞1分钟2+然后用PBS中的一级抗体（1:100）和二级抗体培养细胞2+0.2%BSA，每次1h，用PBS三次洗涤中断2+所有次级抗体均为1:2000时使用的AlexaFluor-conjugated 350、488或546（Invitrogen，Carlsbad，CA）。最后清洗后，将细胞安装在ProLong Antifade（Invitrogen）中。使用Axiocam在Axioobserver显微镜（德国耶拿卡尔蔡司）上使用100×Plan-Apochromat透镜获得图像。使用Axiovision 4软件对所有图像进行迭代去卷积。稳定转染和Western blotting协议与西蒙等。(1999,2005)siRNAs瞬时转染与西蒙等。(2005)敲除后第二天，当PACS-2敲除最大时，分析沉默的细胞。利用线粒体特征性断裂的评分，对PACS-2缺失细胞进行免疫荧光鉴定。

我们使用ImageJ软件进行了辐射剖面分析和曝光分析(网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/)及其交互式3D表面图插件。简单地说，本文使用的免疫荧光图像被分割为RGB，并转换为补充图S2A所示的3D热图，并进行同等处理。相同曝光对应相同的颜色轮廓。CNX和BAP31免疫荧光信号的径向减少是以直线上从最大信号到最小信号的距离百分比来测量的（n=8张图像）。

膜分离、蛋白质结合和生物素化分析

使用25、20、15、10和5%的Optiprep在连续的Optipprep梯度（苏格兰邓迪Axis-Shield）上对构成ER和高尔基体的膜进行分馏。在均质缓冲液（0.25 M蔗糖，10 mM HEPES-NaOH，pH 7.4，1 mM EDTA）中采集HeLa细胞，并通过球形均质器（德国海德堡Isobiotec）进行15次，间隙为18μM。细胞碎片和细胞核通过1000×g离心10分钟制成颗粒。将核后上清液覆盖在连续梯度上，并在4°C下以32700 rpm离心3小时。从梯度顶部收集六个等分，并用丙酮沉淀。通过Western blot检测各组分的CNX、β-COP、表面生物素化蛋白、线粒体复合物II和核黄素I。

重膜和轻膜的分离如下：按上述方法均质细胞，并将所得细胞裂解液在800×克去除未破碎的细胞和细胞核。核后裂解物在10000×克产生重膜组分（HM）。然后将上清液以100000×克分离细胞溶质部分（Cyt.）和轻膜部分（LM）。如前所述进行体外结合试验和表面生物素化(西蒙等。, 2005). 我们通过将5%的总裂解物与100%的生物素化样品进行比较来确定表面CNX的量（见插图图3D） ●●●●。用抗核糖蛋白I抗体（亲和生物试剂）检测ER的完整性。

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PACS-2基因敲除改变了CNX和线粒体染色模式，但对BAP31的影响不大。用打乱寡核苷酸（a–D）转染细胞和PACS-2 siRNA（E–H）转染的细胞在盖玻片上生长，并在Mitotracker加载（B和F）后用抗CNX（a和E）和抗BAP31抗血清（C和G）进行免疫荧光处理。叠加图显示了所有三个标记（D和H）。插图显示了指定的放大倍数。CNX与线粒体的重叠用绿色箭头表示，而CNX与BAP31的重叠用红色箭头表示。PACS-2缺失细胞通过特征性线粒体断裂进行鉴定，如西蒙等。(2005).比例尺，25μm。

协同免疫沉淀

对于CNX/HA-PACS-2联合免疫沉淀，在m-RIPA中收集质粒转染的HeLa细胞（1%NP40，1%脱氧胆碱酯酶，150 mM NaCl，50 mM Tris，pH 8.0，完全蛋白酶抑制剂；瑞士巴塞尔罗氏）。用抗HA单克隆抗体HA.11免疫沉淀HA标记的PACS-2。所有抗体均用蛋白A Sepharose沉淀（GE Healthcare，Baie d’Urfé，QC，加拿大）。用抗HA和抗CNX抗体检测蛋白质印迹。

结果

PACS-2与CNX交互

CNX与核糖体和SERCA2b的相互作用取决于丝氨酸583在其胞浆结构域的ERK-1/PKC磷酸化状态(雪佛兰等。, 1999;罗德里克等。2000年;图1A） ●●●●。此外，丝氨酸554和564的CK2磷酸化与丝氨酸583磷酸化协同作用，促进核糖体相互作用。由于这两个CK2磷酸化位点嵌入PACS蛋白结合共识的酸性簇内，我们假设CNX可能与PACS家族分选蛋白相互作用(万等。, 1998;科特根等。, 2005;西蒙等。, 2005;费利钱杰利等。, 2006;斯科特等。, 2006). 与这种可能性相一致，我们发现在静息状态下，PACS-2染色模式与CNX和线粒体部分重叠。此外，一些同时含有CNX和PACS-2的区域也与线粒体重叠，这表明这两种蛋白质可以在相同的膜域上找到(图1B、 红色箭头）。

基于PACS-2和CNX的共定位，我们接下来测试了CNX和PACS-2是否相互作用(图2，A–D）。大多数与PACS蛋白质相互作用的蛋白质不仅与PACS-2相互作用，还与PACS-1相互作用。两个例子是profurin和polycystin-2。虽然PACS-2相互作用调节其在内质网内的滞留，但PACS-1相互作用在TGN和内质体水平调节其转运(科特根等。, 2005;费利钱杰利等。, 2006). 因此，我们检查了CNX在下拉实验中是否与其中一种PACS蛋白表现出优先相互作用。我们用细菌产生的GST-标记的CNX细胞溶质片段（GST-CNX）从细胞裂解物中培养HA-标记的全长PACS-1和PACS-2。出乎意料的是，我们发现GST-CNX拖出的PACS-2约是PACS-1的三倍(图2A） ●●●●。这种相互作用模式将CNX与其他PACS蛋白相互作用物区分开来，并表明PACS-2对其细胞内途径比PACS-1更重要。接下来，我们旨在通过免疫沉淀法确认CNX/PACS-2的相互作用。为此，我们使用来自在pcDNA3或空质粒中用HA标记的PACS-2瞬时转染的HeLa细胞的裂解物来免疫沉淀PACS-2，并通过Western印迹检测相关的CNX。在这些条件下，我们能够检测到内源性CNX，从而证实了PACS-2/CNX的相互作用(图2B） ●●●●。

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CNX根据其磷酸化状态与PACS-2相互作用。（A） 使用CNX细胞溶质域拉下转染的标记PACS蛋白。在pcDNA3中转染或不转染HA标记的PACS-1或PACS-2 HeLa细胞。GST标记的CNX细胞溶质结构域用于下拉材料。使用抗HA抗体在Western blot上分析相关蛋白。对两个独立的实验进行了量化。（B） CNX/HA-PACS-2联合免疫沉淀。在pcDNA3中用HA标记的PACS-2转染HeLa细胞或不转染。裂解物与抗HA单克隆抗体孵育，免疫沉淀物通过Western blot分析相关CNX。对三种硅酸盐进行量化。（C） CNX体外结合。左侧，与GST对照组相比，检测PACS-2（furin-binding region，FBR）硫氧还蛋白（TRX）标记的货物结合域与GST标记的CNX细胞溶质尾部的结合。对，TRX-PACS-2FBR与GST或GST标记的CNX尾部一起孵育，之前是否与蛋白激酶CK2孵育。用抗GST抗体通过Western blot检测结合分子。通过Ponceau染色验证了等负荷（数据未显示）。对三个独立实验进行了量化。（D） CNX尾部删除。顶部的图表显示了与野生型CNX（顶部，503-592）相比，缺失及其第一个和最后一个残基。用方框符号表示的还有两个CK2站点。凝胶显示检测到PACS-2（FBR）硫氧还蛋白（TRX）标记的货物结合域与GST标记的CNX细胞溶质尾部缺失的结合。

货物与PACS-2的结合通常由蛋白激酶CK2磷酸化调节(科特根等。, 2005;西蒙等。, 2005). 因此，我们询问丝氨酸554和564上的CK2磷酸化是否调节CNX与PACS-2的结合(图1A） ●●●●。我们发现，PACS-2（TRX-PACS-2）的硫氧还蛋白标记货物结合域在体外优先与非磷酸化GST-CNX结合(图2C） ●●●●。为了确定哪一个CK2位点优先负责与PACS-2结合，我们从CNX细胞溶质结构域中删除部分，并将这些构建物表达为GST融合蛋白。通过这些缺失，我们确定膜近端CK2基序包含554-557残基的存在对于结合PACS-2是必要的(图2D） ●●●●。

综上所述，我们的结果表明，一部分PACS-2和CNX共同定位于线粒体附近，在体内外均可观察到PACS-2/CNX相互作用。

PACS-2控制CNX的细胞内定位

鉴于PACS-2参与内质网定位，我们询问CNX-PACS-2相互作用是否将CNX靶向内质网，以及PACS-2是否优先影响其相互作用物CNX或整个内质网。因此，我们首先通过免疫荧光重新检查了CNX在HeLa细胞中的胞内定位。在转染干扰siRNA寡核苷酸的对照细胞中，CNX显示出典型的ER染色模式，与线粒体部分重叠，如图1B（参见中的绿色箭头图3、A和B）。接下来，我们通过2-d瞬时siRNA转染沉默PACS-2基因，并测试这种情况是否导致CNX染色改变。如前所述，PACS-2敲除导致碎片状线粒体的形成（补充图S1A，插图图3F；西蒙等。, 2005). 伴随着线粒体结构的改变，CNX和线粒体之间的重叠在细胞周围几乎完全消失(图3、E和F）。有趣的是，CNX似乎以并列模式崩溃，与线粒体的相互作用原则上仍然可能发生，因为大多数线粒体都在那里。

为了确定PACS-2敲除后CNX的细胞内再定位是否特异，我们将其染色模式与已知的CNX相互作用物BAP31的染色模式进行了比较(祖皮尼等。, 2002). 在用打乱寡核苷酸转染的细胞的对照条件下，BAP31显示出网状染色模式，显示出与CNX广泛但不完美的重叠（参见图3、A和C）。CNX和BAP31也与线粒体部分重叠（参见图3，A–D）。在PACS-2被2-d瞬时siRNA转染沉默的细胞中，BAP31在一定程度上集中在近核区，但仍在细胞外周显示染色，与CNX的效果相反。令人惊讶的是，BAP31也与细胞外周的线粒体保持重叠（参见插图图3、F和G）。我们使用细胞表面热图上的径向剖面图确认了这一印象，该热图测量了单个染色的梯度，并评估了图像的曝光水平（补充图S2A）。尽管在用打乱的siRNA寡核苷酸转染的细胞的控制条件下，CNX和BAP31的染色梯度相等，但PACS-2敲除导致CNX信号的梯度更尖锐，但仅在较小程度上影响BAP31染色梯度（补充图S2B）。这些结果表明，PACS-2将CNX定位于内质网的外周部分。相反，PACS-2-敲除以更微妙的方式影响BAP31。尽管BAP31信号与线粒体的重叠并未因PACS-2基因敲除而显著减少，但BAP31仍集中在缺乏PACS-2的细胞的相邻区域。

由于PACS-2基因敲除可能影响线粒体和ER-localized CNX以外的其他细胞器，我们还检查了PACS-2敲除对高尔基复合体的影响，发现其没有显著影响，如之前所报告的（补充图S1B和科特根等。, 2005). 此外，活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3检测表明，超过90%的PACS-2耗竭不会引起毒性，这表明PACS-2沉默的细胞是可行的（补充图S1C）。

接下来，我们旨在进一步描述PACS-2击倒后CNX的重新定位。我们询问CNX对相邻区域的限制是否源于CNX内质网滞留减少和向下游隔室（如ER-Golgi中间隔室（ERGIC））的转移，或者PACS-2是否只是改变了CNX的内质网靶向性。通过回答这个问题，我们打算阐明PACS-2对内质网靶向的重要性，并为存在特定域内质网的靶向机制提供证据。

我们的免疫荧光方法无法明确区分这两种可能性，也无法量化CNX与同一细胞中多个膜域的关联。因此，我们转而对CNX/PACS-2靶向机制进行生化分析，这使我们能够同时量化与分泌途径的各种膜相关的CNX量。我们首先检查了CNX是否在ER的任何域上富集。

为此，我们制定了一项方案，在连续Optiprep梯度上将ER与后期分泌室以及rER与MAM分离。我们在此梯度上分离HeLa细胞膜，发现组分1和2中的表面生物素化蛋白在组分1中出现峰值(图4A） ●●●●。与高尔基复合体结合的β-COP在组分2中达到峰值，而ERGIC标记物ERGIC53在组分3中达到峰值。跨膜rER标记物核糖蛋白I在第4组中达到峰值(图4A） ●●●●。大多数线粒体复合物II分为梯度的最低两部分，普遍存在的MAM标记物酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1（ACAT1，芸香醇等。, 1994;李等。2000年). 使用我们的梯度，我们发现CNX沉淀物分为3–6组分，在控制条件下，大部分沉淀物位于6组分中，因此与MAM标记显著共分馏(图4A） ●●●●。我们的结果表明，PACS-2敲除使MAM组分中的CNX从66%降至42%，但使其在组分4中的信号增加，这与核磷蛋白I最为重叠。MAM组份的减少具有统计学意义（两个组分均p<0.05）。总的来说，与ER标记物相关的CNX数量从83%下降到69%。CNX重新分布到富含ERGIC53、β-COP和表面生物素化蛋白（组分1-3）的组分中，弥补了这种减少。PACS-2沉默不会改变PDI、ERGIC53、β-COP和线粒体复合物II的模式（数据未显示）。连同我们的免疫荧光分析(图3)因此，我们的结果表明，PACS-2基因敲除有两个作用：第一，它导致MAM上CNX的减少，但rER上CNX增加。其次，它导致ERGIC、高尔基体和表面组分中CNX的回收增加，其中CNX信号大约翻了一番。

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PACS-2依赖于CNX和BAP31的细胞内贩运。（A） PACS-2敲除后的ER和高尔基体分馏。HeLa细胞被耗尽或未耗尽PACS-2，细胞膜在不连续的Optiprep梯度上分离。标记蛋白表示细胞表面（生物素化蛋白）、高尔基体（β-COP）、ERGIC（ERGIC53）、rER（核黄素I）、MAM（ACAT1）和线粒体（线粒体复合体II）。标记蛋白不受PACS蛋白敲除的影响。通过四个独立实验对CNX分布进行了量化。菱形和虚线，控制数据；正方形和实线，PACS-2击倒。分数5和6中的信号p<0.05。（B） 裂解液分馏。HeLa裂解物被分为重膜、轻膜和胞浆；检测裂解产物中的指示标记。（C） PACS-2敲除后的CNX和BAP31膜分离。将HeLa细胞中的PACS-2耗尽或未耗尽，将细胞膜分为低速和高速颗粒，通过Western blot分析CNX、全长BAP31、PDI、核磷蛋白I和肌动蛋白。我们量化了单个蛋白质相对于总信号的重定位。对三个实验进行了量化。CNX和所有其他标记物之间p<0.05。（D） PACS-1和PACS-2击倒后的CNX表面靶向。HeLa细胞被PACS-1或PACS-2耗尽2天，或被模拟转染。生物素化表面CNX在Western blots上定量（n=3）。CNX的量用总裂解物负荷控制（插图）的10%表示为总裂解物的百分比。siPACS-2和其他两种情况之间的p<0.05。（E） zVAD-fmk孵育抑制PACS-2敲除后BAP31p20的形成。检测全长BAP31和BAP31p20的总裂解物。（F） 在有或无PACS-2的情况下，分析thapsigargin诱导凋亡时BAP31p20的形成。无论PACS-2是否耗尽HeLa细胞，用1μM thapsigargin诱导细胞凋亡16 h。细胞膜被分为低和高速颗粒，通过Western blot分析全长和裂解的BAP31。

接下来，我们使用第二种方案来补充我们的Optiprep分析，并通过不同的方法检测PACS蛋白敲除后CNX的重新分布。为此，我们通过差速离心将细胞裂解物分离为细胞溶质部分、重膜部分和轻膜部分(图4B） ●●●●。Optiprep梯度根据膜的密度进行分离，与此相反，这种方法主要根据膜的大小进行分离。我们的研究表明，rER标记物（Sec61α）和MAM标记物（ACAT1）主要分为重膜颗粒，但在轻膜颗粒中显示出一些信号。相反，ERGIC和高尔基体的标记物（ERGIC-53和β-COP）几乎只分馏到轻质膜颗粒中。CNX显示出与粗略ER和MAM标记相对应的分馏模式。

使用此分馏分析，我们分别分析了对照HeLa细胞和耗尽PACS-1或PACS-2的HeLa电池的匀浆。我们的结果表明，PACS-2敲除导致CNX总信号的约25%从重膜转移到轻膜，并导致重膜和轻膜之间50:50的分布。然而，即使在PACS-2基因敲除后，CNX分馏模式也与高尔基体或ERGIC标记的分馏方式不同，后者主要分馏成轻质膜。相反，与我们的Optiprep梯度一致，PACS-2敲低导致重膜和轻膜之间的均匀分布，这与ERGIC和涂布器的分布模式明显不同(图4、B和C）。

接下来，我们试图确认，如Optiprep梯度所示，耗尽PACS-2是否会导致一些CNX出现在质膜上(图4A） ●●●●。因此，我们通过表面生物素化方案分析了PACS-1和PACS-2 siRNA转染后CNX的表面靶向性。使用10%的总裂解物负荷控制计算表面上的CNX总量，并在稳态条件下确定为总量的～2%（插图，图4D） ●●●●。耗尽PACS-2而非PACS-1导致表面CNX增加六倍(图4D） ●●●●。然而，与我们的分级和免疫荧光结果一致，PACS-2缺失细胞中的表面CNX仅占总CNX的12%。总之，这些结果证明了改变PACS-2表达水平如何为调节CNX表面量提供机制。

为了检查观察到的向分泌途径和质膜的后区室的转移是否仅限于PACS-2相互作用物CNX，我们在生物化学上检查了与CNX在不同程度上重叠的三种ER标记物的靶向性。在PACS-2敲除之前，这些标记蛋白（BAP31、PDI和核黄素I）与CNX的膜分布相似。然而，这些标记物中没有一个显示出明显的向较轻的膜转移（PDI小于总蛋白的5%，Ribophorin I仅为1%，图4C） ●●●●。肌动蛋白是一种细胞溶质蛋白，其膜结合和分布也不受影响(图4C） ●●●●。与PDI类似，与预期一致图3，BAP31显示出该分离方案的微小变化。我们还检查了BAP31的表面靶向性。BAP31生物素化信号不受PACS-1或PACS-2敲除的影响(图4D） 从而证实BAP31对PACS-2敲除无反应图3和​和44C、。

事实上，BAP31在PACS-2被击倒后没有重新分布是令人惊讶的，因为这是CNX的一个经证实的交互作用物(祖皮尼等。, 2002). BAP31是一种凋亡调节蛋白，在凋亡开始时产生一个称为BAP31p20的caspase生成片段，导致线粒体断裂(布雷肯里奇等。, 2003). 全长BAP31具有一个KKEE C末端基序，这是一个COPI结合的共有基序，而BAP31p20缺乏该基序。因此，我们接下来检查了与全长BAP31相反，BAP31p20在PACS-2敲除时是否显示出改变的膜分布。如前所示(西蒙等。, 2005)，PACS-2敲除导致静息状态下caspase介导的BAP31p20形成(图4E） ，但没有显著改变BAP31的定位(图3). 接下来我们研究了BAP31p20，它缺乏大部分细胞溶质结构域和COPI基序，在PACS-2基因敲除后是否仍像全长BAP31一样局限于内质网的厚膜。无论是否存在凋亡诱导剂thapsigargin，情况确实如此(图4E） ●●●●。因此，在PACS-2敲除后，无论是劈开的还是全长的BAP31都没有显著地重新定位。

CNX CK2位点突变调节PACS-2相互作用和重膜上的量

CK2的CNX丝氨酸磷酸化消除了与PACS-2的有效结合(图2B） ●●●●。因此，我们决定进一步测试CNX细胞内靶向性是否依赖于PACS-2和CNX磷酸缺陷和磷酸化突变。我们首先检测了这些突变体与PACS-2的硫氧还蛋白标记货物结合域（TRX-PACS-2）的结合，发现当丝氨酸554和564突变为天冬氨酸（SSDD，图5A） ●●●●。相反，当这些丝氨酸突变为丙氨酸时，CNX细胞溶质结构域与PACS-2的结合稍有增加（补充图S3A中的SSAA和图5A） ●●●●。从这些结果中，我们预计SSAA可以有效地复制PACS-2依赖的野生型CNX靶向，而SSDD应显示ER中的保留减少和MAM靶向受损。

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CNX的PACS-2结合基序突变。（A） PACS-2–结合基序表征。硫氧还蛋白（TRX）标记的PACS-2（FBR）与GST标记的CNX尾部结构体（全长尾部结构体，SSAA=S554564A，SSDD=S55464D）孵育，并使用抗GST抗体通过Western blot检测结合的GST标记分子。通过Ponceau染色验证了等负荷（数据未显示）。TRX-PACS-2信号的强度被量化，并表示为GST信号的倍数（n=3）。SSAA和SSDD之间的p=0.01。（B） CNX+/+和−/−MEF稳定转染剂的膜分数。稳定表达FLAG标记CNX野生型或SSAA/SSDD突变体的CNX−/−MEF被分为重膜和轻膜，并通过Western blot分析FLAG（未显示）或CNX信号。（C） SSAA和SSDD突变体的内质网和高尔基体分级。用FLAG标记的CNX野生型和SSAA和SSDD突变体瞬时转染HeLa细胞。细胞裂解物被分馏并量化（n=3），如图4不连续Optiprep梯度上的A。分数6的p<0.01。（D） CNX−/−MEF稳定转染剂中的CNX表面靶向。通过生物素化对稳定表达FLAG标记CNX野生型或SSAA/SSDD突变体的CNX−/−MEF进行分析，通过对FLAG（未显示）或CNX信号的Western blot对表面靶向FLAG标记的CNX构建物进行分析。凝胶中的线条表示为本演示而切割的车道。SSDD与其他结构之间p<0.005。（E） CNX CK2突变体的细胞内定位。用免疫荧光法检测稳定表达FLAG标记的CNX SSAA/SSDD突变体的CNX−/−MEFs，通过将其FLAG信号与内源性PDI和有丝分裂跟踪器共定位来定位转基因。CNX-FLAG SSAA与PDI重叠，线粒体用红色箭头表示。比例尺，25μm。

为了检测这些CNX突变体的靶向性，我们从CNX基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs；格罗恩迪克等。, 2006). 在这些克隆中，CNX-FLAG野生型和PACS-2结合SSAA突变体主要出现在厚膜中，而不能有效结合PACS-2的CNX-FLAG突变体在轻质膜上的数量增加(图5B、 SSDD）。野生型和SSAA突变型CNX-FLAG的分布与野生型MEF中发现的内源性CNX相似(图5B） ●●●●。这表明CNX的SSDD突变，如PACS-2的敲除，导致一些CNX进入分泌途径。通过Optiprep梯度检测证实了这些结果，我们检测到SSDD突变体的ERGIC和表面部分1-3的数量略有增加。这种效应与MAM中信号的等效减少有关。然而，这种减少仅在分数6中显著，从36.5%降至29%。因此，与PACS-2基因敲除后野生型CNX的减少相比，SSDD突变的影响要小得多(图4A和​和5C）。5C） ●●●●。相反，在我们的生物素化检测中，CNX-FLAG SSDD突变体的表面信号增加了三倍(图5D） 表明PACS-2基序确实在一定程度上影响CNX ER靶向性。

我们接下来想确定CNX-FLAG突变体是否也能可靠地复制内源性CNX与线粒体的重叠(图1和​和3）。三). 为此，我们检测了其FLAG信号与线粒体的共定位程度。我们发现，CNX-FLAG SSAA与内源性CNX一样，与线粒体有显著重叠。该突变的定位与内源性的CNX非常相似(图5E、 顶行；与…相比图3A） ●●●●。正如对野生型内源性CNX所观察到的那样，我们观察到FLAG、PDI和线粒体染色之间有许多重叠区域（用红色箭头表示）。相反，尚不清楚磷酸化模拟物CNX-FLAG SSDD突变体是否与线粒体的重叠减少(图5E、 底行）。其网状染色均匀分布于整个细胞液中。有趣的是，尽管PACS-2基因敲除后的生物化学分布与野生型CNX相似，但这种磷酸化突变并没有重现近核染色模式(图3E） ●●●●。我们在讨论中解决了这一差异。

PACS-2将CNX连接到涂布剂

PACS蛋白将货物蛋白的胞浆酸性基序连接到分类外壳；例如，PACS-1将弗林连接到AP-1，PACS-2将多囊蛋白-2连接到涂层聚体（COPI；Crump公司等。, 2001;科特根等。, 2005). PACS蛋白与它们的载脂蛋白和外壳复合物一起形成一个特征性的三元复合物。因此，我们测试了CNX、PACS-2和互变异构体是否也能形成这样的三元络合物。我们将COPI与硫氧还蛋白标记的PACS-2或GST标记的CNX或两者一起孵育。由于GST标记的CNX在PACS-2存在下能够捕获四倍以上的COPI，因此CNX、PACS-2和COPI确实能够形成三元复合物(图6A） ●●●●。接下来，我们想将COPI对CNX和BAP31细胞内路径的影响与PACS-2的影响进行比较。与PACS-2敲除类似，在siRNA转染2天后分析细胞时，COPI敲除导致细胞表面CNX增加。有趣的是，与BAP31的C末端存在COPI结合基序一致，我们还观察到细胞表面BAP31略有增加(图6B） ●●●●。然而，COPI敲除而非PACS-2敲除导致了一些细胞死亡，我们通过活性caspase-3的出现检测到了这些细胞死亡（补充图S1B），因此可能允许一些细胞内蛋白质被生物素化。我们能够使用LDLf细胞系证实COPI依赖性效应，LDLf以温度敏感的方式降解ε-COP(郭等。, 1994). 当这个突变CHO细胞系从34℃转移到40℃6 h时，我们观察到CNX和BAP31的细胞表面量增加(图6C） ●●●●。在本实验中，它们在质膜上的数量增加更多，可能是由于使用siRNA不完全敲除β-COP所致(图6B） ●●●●。

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CNX和BAP31的细胞内定位依赖于互变异构体。（A） 纯化COPI、PACS-2和CNX之间形成三元络合物。信号对应于GST-CNX S554564A在存在或不存在TRX标记的PACS-2FBR的情况下固定的β-COP。（B）COPI敲除后的细胞表面CNX和BAP31。检测HeLa对照细胞或β-COP缺失细胞的细胞表面CNX和BAP31。量化细胞表面CNX的相对数量（n=3）。siPACS-2与其他条件之间p<0.05。（C） LDLf细胞中的细胞表面CNX和BAP31（ε-COP对温度敏感）。LDLf细胞在34°C（允许温度）或40°C（导致ε-COP损失）下培养，并分析细胞表面CNX和BAP31。（D） COPI击倒后CNX和BAP31的细胞内定位。对β-COP缺失的HeLa细胞进行CNX和BAP31的免疫荧光定位。通过高尔基体扩散和CNX限制鉴定β-COP缺失细胞。比例尺，25μm。

我们通过免疫荧光证实了2d siRNAβ-COP敲除后CNX和BAP31的重新定位(图6D） ●●●●。同样，与PACS-2击倒相反(图3)，CNX和BAP31均聚集在近核区。总之，这些发现表明PACS-2和COPI对CNX和BAP31的细胞内定位没有相同水平的控制。尽管CNX和BAP31的细胞内定位都依赖于COPI，但PACS-2为CNX提供了一种特定的机制，导致该伴侣蛋白沿分泌途径和ER内的正常稳态分布。

讨论

内质网是一种最复杂的细胞器，具有多种功能，包括蛋白质合成、蛋白质折叠、蛋白质降解、糖基化、脂质合成、脂质转移、钙信号传导和钙储存等。不出所料，这种多功能细胞器由多个结构域组成，但调节蛋白质在ER内分布的信号和蛋白质的分类尚不清楚。我们的结果表明，CNX在MAM处富集，这一发现最近由Hayashi和Su（2007）我们的结果还表明，PACS-2是一个有助于CNX在MAM上富集的因子。

PACS-2的敲除以多种方式干扰了正确的CNX靶向。首先，它将CNX从与线粒体重叠的外周内质网小管转移到清晰的近端定位(图3). 如免疫荧光和分馏所示，这种变化也对应于CNX和线粒体之间重叠的减少(图3和​和4A）。4A） ●●●●。第二，正如我们的分馏和差异离心分析所表明的那样，PACS-2敲除导致CNX从内质网膜组分有限地重新分布到富含ERGIC和高尔基复合体标记的膜组分(图4、A和C）。第三，通过生物素化试验和Optiprep分馏观察到，PACS-2敲除增加了细胞表面的CNX水平，尽管这两种方法都表明大多数CNX仍在细胞内(图4、A和D）。总之，PACS-2调节MAM和rER上的CNX量。PACS-2还将CNX保留在内质网内，并防止CNX在含有ERGIC、高尔基体和质膜的生化组分中出现。因此，PACS-2和CNX之间可调节的相互作用可以解释某些细胞类型质膜上CNX数量的增加(维斯特等。, 1995).

有几个模型可以解释我们的观察结果：PACS-2可以直接调节MAM上CNX的含量（另请参阅下文了解更多讨论）。在这种情况下，内质网靶向性的丧失最初会导致内质网内的无限制分布，这可能会在一定程度上压倒内质网保留机制，导致内质网上的相对富集。或者，PACS-2可以简单地调节内质网出口处或之后CNX内质网的滞留。PACS-2的丢失将导致CNX从ER中泄漏，这最终也将导致MAM-定位CNX的丢失。与此模型一致，PACS-2也与COPI相互作用，这表明COPI和PACS-2合作将CNX保留在ER中。这两种蛋白质用于此保留的机制很可能是可检索的，如前面对COPI本身所示(勒图尔纳等。, 1994). 一种尚未探索的可能性是，PACS-2还与ER分拣和贩运机制的其他组件（如COPII）相互作用。

为了进一步阐明PACS-2介导的CNX贩运，我们检测了CNX磷酸模拟突变体。虽然组成性PACS-2结合SSAA突变体很好地再现了野生型CNX的染色和膜分离，但SSDD突变体与PACS-2的结合减少，但没有像预期的那样定位错误。我们的数据表明，这种突变表现出一些渗入Optiprep组分的现象，这些组分富含细胞表面标记物和ERGIC(图5、B和D）。该突变体还显示，进入含有MAM标记ACAT1的内质网最底层的沉降显著减少(图5C） ●●●●。然而，当通过免疫荧光染色检测时，该突变体并没有再现PACS-2基因敲除时细胞核周围的陡峭梯度（相比之下图3E带​带5E）。5E） ●●●●。导致这种行为的原因有几个：首先，SSDD突变体与PACS-2的结合显著减少，但没有被消除(图5A） ●●●●。其次，磷酸化CNX仍然能够与核糖体相互作用，这种相互作用导致内质网滞留(雪佛兰等。, 1999). 第三，PACS-2基因敲除预计会导致CNX与COPI的结合减少，但不会废除(图6A） ，因此可能导致COPI对检索的部分挽救。

因此，尽管CK2的磷酸化促进了CNX与核糖体的结合(雪佛兰等。, 1999)，其去磷酸化促进CNX与PACS-2的相互作用，并靶向重ER膜，包括MAM，如图所示。这两项研究共同表明，内质网内磷酸化和非磷酸化CNX达到平衡，从而在rER和MAM之间建立野生型CNX稳态分布。

CNX和BAP31的内质网保留率均表现出COPI依赖性。有趣的是，无论是对COPI的干扰，还是对PACS-2的干扰，或两者的结合（数据未显示）都不会导致内质网中任一蛋白的完全释放。这些观察结果表明，CNX通过多种机制保留在内质网内。他们还证明，虽然PACS-2贡献对于CNX ER保留，PACS-2不是鞋底CNX ER保留系数。还有哪些其他机制可以将CNX保留在ER中？CNX的管腔结构域可能有助于其细胞内滞留。一种可能是硫醇介导的保留，因为CNX有两个二硫键：球状结构域中的Cys161-Cys195和臂中的Cys361-Cys367(施拉格等。, 2001;阿内利等。, 2003). 然而，通常用于释放通过该机制保留在内质网中的蛋白质的β-巯基乙醇对细胞表面的CNX量没有影响（补充图S3B）。另一种可能的内质网滞留机制可能是CNX与粗内质网中新合成的蛋白质的结合，也由CNX管腔结构域介导。然而，衣霉素处理10小时，消除了CNX与这些底物的相互作用，实际上减少了细胞表面的CNX数量(冈崎等。2000年). 总的来说，这表明其他未知机制还将CNX保留在ER中。

虽然CNX定位于核糖体附近源于其在蛋白质折叠中的作用，但不太清楚为什么CNX可能位于线粒体附近和MAM上(图1,​,3,三,​,4,4、和​和5）。5). 据报道，CNX的两种功能表明该伴侣在MAM上发挥重要作用。一方面，CNX充当IP的监护人三MAM上的R(约瑟夫等。, 1999). 此外，CNX与MAM上的SERCA2b钙泵相互作用(罗德里克等。2000年;绍鲍德考伊等。, 2006). 这种相互作用调节细胞内钙振荡，依赖于CNX磷酸化。原则上，这一发现可能暗示了CNX与PACS-2在该机制中的相互作用。然而，CNX上调节钙振荡的丝氨酸583与PACS-2结合酸性簇不同(罗德里克等。2000年). 因此，我们的结果表明，PACS-2在CNX在内质网域之间穿梭或提供足够的内质网保留方面发挥了作用，这将导致CNX在MAM上的稳态富集(图4A） ●●●●。

PACS-2位于线粒体上或其附近(图1;西蒙等。, 2005). PACS-2不仅影响MAM上CNX的量，还影响一些脂质转移蛋白的量(西蒙等。, 2005). 由于后一组中的蛋白质不显示任何明显的酸性簇基序，PACS-2可能通过定位“主”MAM蛋白来影响MAM的形成和靶向。然而，与这一观点相矛盾的是，我们的发现是BAP31并没有离开内质网，并且维持着一个重膜结合(图3和​和4，4、C和D）。此外，即使BAP31p20缺乏COPI结合基序，在PACS-2基因敲除后仍与MAM相关(图4F） ●●●●。总之，我们的数据表明，PACS-2以比最初想象的更复杂的方式影响MAM靶向性。

然而，很明显，我们的结果证明了PACS-2介导的CNX在分泌途径上的分类的特异性，这依赖于酸性的可磷酸化簇。他们也同意最近的研究，这些研究报告了PACS-2在CI-MPR的早期内体到TGN分选以及HIV-1 Nef下调细胞表面MHC I的能力中的作用，因为两者都依赖于相似的一致序列(阿特金斯等。, 2008). 因此，我们的发现与直至吕本等。(2007)由此得出结论，PACS蛋白质“……对于具有酸性簇基序的货物蛋白质的分类来说是不可或缺的。”

与呋喃与PACS-1和PACS-2的结合一样，蛋白激酶CK2调节CNX与PACS-2之间的结合。在分析PACS蛋白的所有已知相互作用物时，PACS-2似乎表现出对去磷酸化货物蛋白的偏好，但不是要求，如Bid和CNX（本研究和西蒙等。, 2005). 有趣的是，PACS-2/货物结合的这一特征类似于14-3-3蛋白对内质网前向转运的调节，后者也受货物蛋白磷酸化状态的调节(Mrowiec和Schwappach，2006年). PACS-2和14-3-3蛋白在内质网滞留中起着相反的作用：虽然PACS-2通过形成三元货物/COPI复合物促进内质网的滞留，但14-3-3蛋白质与COPI竞争货物结合，并在相互作用时允许其退出内质网(奥凯利等。, 2002;Vivithanaporn公司等。, 2006). 确定PACS-2和14-3-3蛋白是否与COPI在功能和/或物理上相互作用以调节内质网滞留是一件有趣的事情。此外，除了已知的COPI参与外，还需要确定14-3-3蛋白参与CNX的ER内定位(拉贾戈帕兰等。, 1994).

我们最有趣的发现之一是关于PACS-2敲除后BAP31的裂解。这种现象的解释是什么？由于zVAD-fmk抑制这种切割，推测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶参与PACS-2敲除后BAP31p20的形成。因此，ER上PACS-2的不足可能触发半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活。这种效应可能源于PACS-2敲除时观察到的内质网应激(西蒙等。, 2005)或者CNX从ER中错误分类（本研究）。然而，由于PACS-2的敲除最终阻止了细胞凋亡的发生，并且不会导致下游半胱天冬酶的激活，因此我们的结果排除了PACS-2敲除只是有毒的可能性。

BAP31p20被认为通过激活Drp-1具有促凋亡活性，Drp-1会导致线粒体断裂。激活Drp1的后果目前尚不清楚，因为这可能促进或抑制凋亡诱导(布雷肯里奇等。, 2003;绍鲍德考伊等。, 2004). 我们现在的结果表明，BAP31p20的形成确实不足以触发细胞凋亡，但该分子需要PACS-2来触发。这与BAP31和BAP31p20的定位形成对比，后者并不显著依赖于PACS-2。

总之，我们的结果提出了PACS-2在内质网正常功能中的两个不同作用：一方面，它与共沸器合作保留内质网蛋白的一个子集，内质网结构域（包括MAM）上有酸性细胞溶质簇，但另一方面，PACS-2也需要诱导凋亡。如前所示，后一种功能是否仅限于将去磷酸化的Bid分拣到线粒体上(西蒙等。, 2005)还有待测试。

补充材料

【补充材料】

致谢

我们感谢莎拉·休斯（Sarah Hughes）在联合免疫沉淀方面的建议，感谢安德鲁·西蒙兹（Andrew Simmonds）在共焦显微镜方面的帮助，感谢瑞克·拉丘宾斯基（Rick Rachubinski）在本项目的初始阶段提供了实验室空间。我们感谢Rainer Duden（伦敦大学皇家霍洛韦分校）提供的纯化共变异构体。我们还特别感谢Marek Michalak（阿尔伯塔大学）为我们提供了CNX野生型和淘汰型MEF。我们感谢Michael Bui的技术支持，感谢Paul Melançon对这份手稿的批判性阅读。这项工作得到了瑞士国家科学基金会奖学金PA00A-101489、加拿大国家癌症研究所拨款17291和阿尔伯塔省传统医学研究基金会拨款200500396（T.S.）以及国家卫生研究院拨款DK37274和AI49793（G.T.）的支持。这项研究得到了特里·福克斯基金会的支持。

使用的缩写：

BAP31号机组31 kDa的B细胞受体相关蛋白
CI-MPR公司阳离子非依赖性甘露糖6-磷酸受体
CK2型蛋白激酶CK2
CNX公司钙结合蛋白
COPI公司外被体
急诊室内质网
ERK公司细胞外信号调节激酶
MAM公司线粒体相关膜
PACS-2系列磷酸呋喃酸性簇分选蛋白2
交车前检查蛋白质二硫异构酶
rER公司粗面内质网

脚注

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E07-10-0995)2008年4月16日。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会