单个mRNA表达谱揭示了特定microRNA的影响

Wilcoxon秩和检验

我们的第一次分析遵循了Sood及其同事描述的“以组织为中心”的方法[16]. 将每组特定miRNA靶基因的表达值向量与所有预测靶基因的表示值向量进行比较。在所有组织中，检测到目标基因表达显著较低的miRNAs（Wilcoxon秩和检验），最低第页-值范围为1.29×10^-5大脑中为7.23×10^-3骨骼肌中。所有组织的结果如图所示​图1。1值得注意的是，特征明确的组织特异性miRNAs，如肝脏中的miR-122和大脑中的miR-124，均在预期组织中检测到，而不是在其他地方。这表明miRNA作用于mRNA表达的“特征”可以在单个基因表达谱中检测到，而与之前报道的其他组织中的水平无关[16].

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图1

通过Wilcoxon秩和检验确定的靶基因表达显著较低的miRNAs。概率（log₁₀，所有miRNAs的x轴第页<0.1以升序绘制，并在分析的所有八个组织中画上红色圆圈。对于每个miRNA，由五组随机预测的靶基因得出的平均概率（±标准误差）用灰色绘制。

排名比例

在另一种分析特定组织中每个miRNA的所有预测靶基因相对表达水平的方法中，我们采用了Yu描述的“排名比”（RR）等. [23]. 他们首先对一系列组织中每个基因的表达水平进行排序。对于每个组织，排名的基因被分为两半，一个高排名，一个低排名。然后通过将“低”等级组中的目标基因数除以“高”等级组来计算RR值。我们没有考虑一系列组织，而是在单个表达数据集中对目标基因进行排序，对于每个miRNA，通过将表达水平低于绝对表达中值的预测目标基因数除以高于该值的预测目标基因组数，计算出RR值（与其他方法的比较表明，这比将基因分成上半部分和下半部分更有效，见下文）。因此，该RR值是miRNA靶基因在单个mRNA群体中分布的指标。高RR表明靶基因的低表达比例较高，因此表明该组织中存在miRNA表达。计算了所有八种组织的所有miRNA的RR值，大脑和肝脏的RR值如图所示​图22（有关分析的所有其他组织，请参阅附加数据文件2）。正如预期的那样，已知的组织特异性miRNAs在其同源组织中具有较高的RR值。

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图2

大脑和肝脏中所有miRNA的排名比值。miRNA按RR值（左侧y轴）排序，显示为红线。较高的值反映了预测目标基因的较低表达，因此表明miRNA活性。虚线表示每个miRNA（右侧y轴）预测的靶基因数量。已知的神经-（例如miR-29）和肝脏特异性（例如，miR-122a）miRNAs出现在左侧。

平均绝对表达式

接下来，我们研究了一种涉及绝对靶基因表达的方法是否可以用于检测miRNA签名。这可能会识别出上述缺失的miRNAs，但可能会受到单个基因的过度影响，从而导致表达发生较大变化。该技术如图所示​图3a。3a年miRNAs是根据其预测目标mRNAs的平均表达值排序的，如图中肝脏的所示​图3b。3亿在肝脏中的所有miRNA中，最低的平均靶基因表达值是miR-122a，这是一种特征明确的肝脏特异性miRNA[28]. 为了确定观察到的mRNA表达减少可能是由于选择了具有特定miRNA靶点的mRNA，我们计算了概率(t吨-这些样本是从组织中表达的所有基因中随机抽取的，这些基因包含预测的miRNA靶序列。所有组织的结果概率如图所示​图3c3立方厘米而那些靶基因表达较低的miRNAs包括许多已知的组织特异性例子，例如大脑中的miR-124a(第页= 6.2 × 10^-4)骨骼肌中的miR-1(第页= 1.9 × 10^-2).

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图3

每个miRNA的预测靶基因的平均mRNA表达。（a）图解说明如何计算单个miRNA预测目标基因集的平均表达水平，然后与所有预测目标基因的表达水平进行比较。在这个例子中，miR-124a和miR-29被显示为映射到不同但重叠的靶基因亚群。计算所有预测靶基因和miR-124a和miR-29预测靶基因的平均表达值。计算miR-124a和miR-29预测靶基因在该组织中的表达水平从所有预测靶基因的表达水平中随机抽取的概率。（b）每个miRNA（x轴）的所有预测目标基因的排名平均表达值（y轴）以及肝脏中表达的目标基因被描述为红色圆圈（±标准误差）。这些包括已知肝脏特异性miR-122（最左侧）的预测mRNA靶点。一些miRNAs具有高于预期的靶基因表达，例如miR-1和miR-205（最右侧）。（c）红色圆圈表示概率（log₁₀，y轴），从所有miRNA的表达目标基因的总体中随机抽取每个miRNA的目标基因表达水平集（x轴）(t吨-测试，第页< 0.1). 对于每个miRNA，由五组随机预测的靶基因导出的平均概率（±标准误差）以灰色绘制。

为了测试这种方法的可靠性和可用微阵列表达数据的稳健性，将其应用于在几个不同实验室生成的独立小鼠表达数据集（见材料和方法）。从这两个数据集预测的所有组织的miRNAs集非常相似，重叠程度如图所示​图4。4哺乳动物miRNAs及其靶位点高度保守；事实上，序列保守性是TargetScan预测的一个要求[4]. 因此，miRNA的表达在物种之间是保守的[29]，至少对于具有类似生理学的生物体而言[30]miRNAs可能在减少mRNA表达的跨物种差异中发挥作用[31]. 对人类组织mRNA表达谱的分析（附加数据文件3）表明，大约三分之一低靶基因表达的人类miRNAs与在同等小鼠组织中预测的miRNA相对应（小鼠数据集1和2分别为30.6%和35.5%）。例如，在大脑中预测的18个人类miRNA中，有7个与小鼠数据集1相同（图​（图4），4)，而不是如果miRNAs组是独立的，则预期的较低数量（约2）（对于所有其他组织和第二个小鼠数据集，观察到的数量同样较高）。这为保守的miRNA表达和预测方法的独立验证提供了进一步的证据。

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图4

在两个小鼠和一个人类基因表达数据集中检测到的miRNA特征之间的相关性。在单独的维恩图中显示了八种组织的结果（没有合适的人类骨骼肌表达数据）。维恩图中的每个圆圈表示两个小鼠（顶部）和一个人类（底部）mRNA表达数据集中靶基因表达显著较低的miRNAs数量。每个组织中所有数据集之间常见的miRNA数量以粗体表示。

miRNA特征检测方法的比较

接下来，我们比较了Wilcoxon秩和检验、RR和绝对表达三种方法的结果t吨-使用RR方法中10%显著性水平和同等数量的miRNAs进行测试。对于所有组织，预测的miRNAs之间存在显著重叠（图​（图5），5)，采用Wilcoxon秩和检验和绝对表达式t吨-测试结果最为一致。为了评估在目标基因表达中检测到的miRNA特征预测实际miRNA表达的程度，我们将至少两种方法预测的miRNA的组织分布与来自实验证据的方法（克隆和Northern blots）进行了比较。表​表11说明了计算预测miRNA活性（根据TargetScan预测的靶基因）的组织与有实验证据证明存在miRNA的组织之间的一致性（特别是当排除最近表征的miRNA时）。这得到了正马修斯相关系数（MCC）的支持[32]对于所有组织，范围为0.2-0.5（平均值0.34；附加数据文件4）。

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图5

在mRNA表达谱上检测miRNA签名的三种方法之间的重叠。八种组织的结果显示在单独的维恩图中。维恩图中的每个圆圈表示目标基因表达显著较低的miRNAs数量，如t吨-试验、Wilcoxon或RR方法。在所有组织中，预测的miRNAs与Wilcoxon秩和检验和绝对表达有显著重叠t吨-测试结果最为一致。所有三种方法预测的miRNAs数量以粗体表示。

miRNA签名与miRNA表达水平的相关性

miRNA微阵列现在可以提供组织内miRNA表达的全局指示。因此，我们将我们对改变mRNA表达的miRNA的预测与miRNA微阵列确定的miRNA自身的实际表达进行了比较[33]. 对于所有组织，通过绝对表达法（10%显著性水平）测定的低靶基因表达的miRNAs的表达水平显著降低(t吨-测试，第页<0.05），而不是那些对其靶基因没有可检测作用的miRNA（图​（图6）。6). 这进一步证实了我们检测到的miRNA特征是同源组织中miRNA表达的结果。除了目标基因表达较低的miRNAs外，我们还检测到一组目标基因表达水平显著高于背景组的miRNA（图​（图3b）。3亿). 由微阵列测定的这些miRNAs的表达与那些对mRNA表达无影响的miRNA的表达没有显著差异。

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图6

miRNA微阵列检测到的miRNA对mRNA表达和miRNA表达水平的预测影响之间的相关性。miRNAs分为显著低于预期目标mRNA表达（标记为“低”）、对其目标表达无明显影响（标记为”mid“）和显著高目标表达（标记“高”）的miRNAs。箱线图显示汤姆森确定的表达式值（y轴）等[33]，每组的miRNAs（x轴）。低靶基因表达的miRNAs的表达显著高于(t吨-测试，第页<0.05），而在除心脏外的所有组织中，目标表达为中或高水平。汤姆森等[33]用Cy3标记来自每个组织的微小RNA，并使用对应于所有成熟微小RNA的参考寡核苷酸集，在所有杂交中用Cy5（红色通道）标记。该参考集为阵列上的每个探针提供了内部杂交控制。我们分析中使用的miRNA微阵列表达值是以中位数为中心的标准化对数比Cy3/Cy5值。

最近，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定的人类组织miRNA表达的综合数据已经可用[34]. 这揭示了人类miRNA拷贝数和预测的靶基因表达水平之间更清晰的关系（图​（图7）。7). 为了证明人类和小鼠miRNAs之间的相似性，选择了从小鼠数据分析中预测的具有“低”或“中等”预测目标基因表达的miRNAs-人类同源序列。令人惊讶的是，这两组miRNAs在人类组织中的拷贝数存在显著差异，这两种miRNAss是根据小鼠靶基因表达选择的（附加数据文件5）。这证明了小鼠和人类之间miRNAs及其靶基因的保守性以及RT-PCR测量的准确性。

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图7

通过RT-PCR检测miRNA与mRNA表达预测影响和miRNA表达水平的相关性。如前所述，miRNAs根据预测的靶基因在人体组织中的表达情况分为组。由RT-PCR[34]（y轴）确定的这些组（x轴）中miRNAs的表达由箱线图描述，这些箱线图显示了显著更高的表达(t吨-测试，第页从肾脏中的0.0014到大脑中的0.0385），目标基因低表达的miRNAs相对于目标基因中或高表达的miRNA（在除心脏外的所有组织中）。如果需要有效地表示中位数和四分位数范围，则省略了多达两个离群值。

其中一些对mRNA表达有显著影响的miRNA被高度表达（例如，miR-122a、miR-124a、miR-125），并且它们观察到的mRNA水平的降低可以合理地归因于弱的mRNA降解活性，其次要作用是针对翻译。然而，其他显著影响靶基因表达的miRNAs没有得到高表达，这可能表明这些特定miRNAsmRNA降解效率更高。因此，特定miRNAs导致mRNA降解的程度可能会影响我们检测其存在的能力。我们推断，miRNAs之间的差异在高表达但对mRNA表达没有明显影响的miRNAss和低表达但对靶mRNA表达有显著影响的miRNA之间最为显著。除了广泛的互补性[9]miRNAs指导mRNA切割所需的miRNA-靶相互作用的特征尚不清楚，尽管许多位点上下文的特征，包括位置、局部AU含量以及与miRNA3'残基配对，已被证明可以提高位点功效[2]. 为了初步表征上述潜在类miRNA的区别性质，我们分析了miRNA与预测位点之间的相邻互补长度，但没有显著差异。

干扰miRNA表达影响同源mRNA表达

为了验证在正常组织的mRNA图谱中观察到的miRNA特征，我们将我们的方法应用于几个公开可用的基因表达数据集，这些数据集是在实验性干扰miRNA表达后测得的，这些干扰或导致miRNA表达减少[13]或增加[12]在每种情况下，都在靶基因表达中观察到预期的反应。克鲁茨费尔特等. [13]证明静脉注射化学修饰的寡核苷酸或“antagomirs”（补充miRNA）可以特异性降低小鼠体内相应miRNA的内源性水平。当我们分析肝脏中miR-122a因使用安替戈米尔而沉默的基因表达数据时[13]影响mRNA水平的miRNAs列表非常相似，但miR-122a不再具有可检测的作用（图​（图8）。8). 这最终证明了我们观察到的靶基因表达上miR-122a的特征是由于miR-122a的物理存在，而不是由于与同源miRNA共同表达的靶基因的表达受到进化压力。

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图8

在操纵miRNA表达后检测改变的miRNA特征。在顶部和底部面板中，miRNAs（x轴）按照平均目标基因表达（y轴）的顺序排列，为了清楚起见，分别只标记了miR-122a和miR124。在antagomir抑制miR-122后[13]，肝脏中miR-122平均靶基因表达的位置从左到右移动到所有miRNAs的位置（上表）。这反映在miR-122a预测的靶基因表达不足的概率降低（y轴），而所有其他miRNA效应相对未被miR-122a-antagomir改变（左中框中的红色与灰色虚线）。相反，miR-124在HepG2细胞系中24小时的过度表达[12]导致miR-124-靶基因表达从显著的高表达转变为显著的低表达（底部面板）。右中面板显示了miR-124靶基因表达的选择性下降（这对于用于此分析的TargetScan版本中的miR-122a和miR-122u亚型很明显）。虽然该图中的数据来自平均绝对表达式的分析，但替代方法产生了类似的结果（数据未显示）。

王和王[12]用模拟miR-124前体的RNA双工体转染HepG2细胞系。他们通过测量mRNA表达谱证明了miR-124过度表达的影响，并表明与阴性对照RNA双链相比，在该治疗后下调的mRNA中，miR-124的预测靶点过度表达。正如预期的那样，对这些表达数据集中miRNA特征的分析显示，miR-124在其过度表达但在对照组中没有表达的细胞中具有活性（图​（图88).

预测目标基因群的特征

我们没有发现miRNAs靶向互补性的增加对mRNA水平有显著影响。然而，我们注意到，那些在特定组织中总体目标基因表达较低的miRNAs通常在该组织中表达更多的目标基因。这在组织中是正确的，支持Farh的观察等. [17]他证明组织特异性miRNA靶基因通常在同源组织中表达，但表达水平低于其他组织。

在某些组织中，一些miRNA预测的靶基因集的表达水平显著高于其他miRNA的表达水平（10%的概率）。我们观察到，这些通常涉及miRNA不正常表达的组织中高表达的组织特异性miRNA，例如肝脏中的miR-1（图​（图2）。2). 然而，这种现象似乎并不表明由于这些组织中的miRNA表达较低，miRNA水平的抑制减弱（图​（图66和​和77).

miRNAs靶向mRNAs与3'UTR GC含量和长度相关[16,35]. 然而，我们发现目标基因表达显著较低（“低”基因）的miRNAs预测目标基因的3'UTR GC含量与背景基因的3'UTR GC浓度没有一致性差异。然而，对于所有组织，具有显著高目标基因表达（“高”基因）的miRNAs预测目标基因的GC含量显著较低（附加数据文件6）。对于“低”基因，3'UTR长度显著长于背景，但“高”基因甚至更长。这些观察结果的生物学意义尚不清楚。人们可能预期表达较低的基因富含AU，因为miRNAs与含有AU-丰富元素的mRNAs的降解有关[35]. “低”基因的3’UTR越长，miRNA靶点越多，因此降解越严重，但这与“高”基因的更长3’UTRs不一致。

基因表达数据

涵盖一系列组织的小鼠和人类mRNA表达数据集从GEO下载[20,21,44]. 此外，根据不同实验室提交的数据汇编了第二个涵盖相同组织的老鼠数据集。组织、GEO样本和平台登录号列于附加数据文件3中。文献综述确定了克隆、Northern杂交或表达序列标签定位支持的组织特异性miRNA表达的证据。

miRNA靶基因表达的计算

只考虑了单个基因特异性Affymetrix探针（后缀_at），只分析了每个数据集中表达的探针（如果可用，由“当前”调用指定，或者信号强度大于中值）。使用Biomart在线套件将探针ID转换为同源基因符号[45]. 刘易斯发表的miRNA家族及其预测靶基因列表等. [4]已从TargetScan网站（3.1版）下载[27]. 对于小鼠（小鼠基因组430 2.0基因芯片），15682个探针被映射到基因符号，其中3120到3792个探针均为预测的miRNA靶点，并在分析的组织中表达（对于人类，分析了17325个探针和4135-5906个表达靶点）。miRanda预测的其他miRNA靶基因[36,37]从miRBase网站下载[46]. 选择得分和保守性值（P_org）大于平均值的地点进行分析。RNAhybrid算法[39]使用以下参数运行：第页<0.05，能量<-10 kcal/mol，与碱2-7强制结合。

对于每个mRNA表达数据集，编译每个miRNA预测靶向的表达基因及其各自表达水平的列表（计算>1个探针表示的基因的平均值）。只有预测靶点>50的miRNAs被进一步考虑。根据其预测目标基因的平均表达值（根据用于分析数据的主要微阵列归一化算法进行绝对或对数转换）对这些基因进行排序，并在必要时分为上半部分和下半部分。

统计分析

使用三种不同的分析方法比较特定组织中特定miRNA的预测靶点的表达，以及同一组织中miRNA预测靶点所有基因的表达值。为了分析两组排序基因表达值的中位数之间是否存在显著差异，采用非参数单侧Wilcoxon秩和检验。为了验证这一假设，即每组中的基因都来自相同的人群，我们使用了一个单尾Student’st吨-测试（考虑不等方差并使用对数正态化数据）。对于每一个miRNA第页<0.1，我们认为该组织中该miRNA预测靶向的所有基因的表达显著高于或低于所有预测靶基因的平均表达。

为了计算RR值，预测的目标基因按表达值排序，然后按基因的中位数秩或绝对表达值分为两组。对于每个miRNA，低组中靶向的基因数量除以高组中的数量得出RR值。

监控化学品[32]作为绩效的衡量标准。

GC含量和预测靶mRNA 3’UTR长度的计算

鼠标3'UTR数据从Biomart下载[45]. 然后计算GC含量和UTR的长度，以预测被感兴趣的miRNAs组靶向的非冗余基因集。