分子细胞蛋白质组学。2008年6月；7(6): 1067–1076.
培养初级神经元中氨基酸的稳定同位素标记
脑源性神经营养因子依赖性磷酸酪氨酸相关信号转导的应用*S⃞ ,‡ ,‡§ ,‡ ,‡§和‡¶‖
丹尼尔·斯佩尔曼
从¶药理学系，§细胞生物学、生理学和神经科学、精神病学系‡纽约大学医学院Skirball生物分子医学研究所Kimmel生物与医学中心，纽约10016
凯特琳·戴哈德
从¶药理学系，§细胞生物学、生理学和神经科学、精神病学系‡纽约大学医学院Skirball生物分子医学研究所Kimmel生物与医学中心，纽约10016
Costel C.Darie公司
从¶药理学系，§细胞生物学、生理学和神经科学、精神病学系‡纽约大学医学院Skirball生物分子医学研究所Kimmel生物与医学中心，纽约10016
摩西五世·赵
从¶药理学系，§细胞生物学、生理学和神经科学、精神病学系‡纽约大学医学院Skirball生物分子医学研究所Kimmel生物与医学中心，纽约10016
托马斯·纽伯特
从¶药理学系，§细胞生物学、生理学和神经科学、精神病学系‡纽约大学医学院Skirball生物分子医学研究所Kimmel生物与医学中心，纽约，纽约10016
从¶药理学系，§细胞生物学、生理学和神经科学、精神病学系‡纽约大学医学院Skirball生物分子医学研究所Kimmel生物与医学中心，纽约10016
2007年8月15日收到；2008年1月28日修订
- 补充资料
补充数据
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摘要
培养的初级神经元是研究神经元功能的良好模型在体外在这里，我们证明了细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）可以应用于分化的非分裂细胞类型，如原代神经元，并且我们应用这项技术评估神经元磷酸酪氨酸蛋白组的变化，以响应脑源性神经营养因子（BDNF）的刺激，神经连接发育和调节的重要分子。我们发现，与BDNF处理的样品和对照样品相比，磷酸酪氨酸免疫沉淀中有13个蛋白质的SILAC比率高于1.50或低于0.67，另外18个蛋白质的比率高于1.25或低于0.80。这些蛋白质包括TrkB，BDNF的受体酪氨酸激酶，以及其他如肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物和信号转导适配器分子，这些蛋白质是已知的调节受体酪氨酸蛋白激酶细胞内运输的蛋白质。这些结果表明，原代神经元细胞培养和SILAC的结合可以成为研究神经元分子和细胞动力学蛋白质组的有力工具。
原代培养通常是指从活生物体中获得并在培养中保持的分化细胞(1). 分离胚胎神经细胞培养是研究人员用来创建更相似模型系统的许多原代培养系统之一体内生物学、细胞组成和复杂性比永生细胞系(2). 与完整的器官或切片培养相比，分离的原代神经元细胞培养是一种简化模型，可以评估特定细胞类型的特征，如细胞形态、能量代谢、信号转导和神经递质释放(2–4).
结合质谱分析，SILAC1可以是表征细胞信号和蛋白质相互作用的有效手段(5–7). 在SILAC实验中，代表不同生物条件的细胞生长在补充了“轻”或“重”同位素氨基酸的培养基中。将标记的氨基酸代谢并入一个群体细胞的所有蛋白质中，然后以相同比例组合差异标记的样品，可以根据相应差异标记肽的强度对每个样品中的蛋白质进行量化。在相同的质谱实验中，可以进行MS/MS以获得蛋白质鉴定的序列信息（有关综述，请参阅参考文献。7).
将原代神经元培养和SILAC（原代神经元SILAC）相结合的优点是显著的，因为这种方法可以将已建立的生化和细胞生物学实验扩展到蛋白质组学规模，这些实验经常用于解决神经科学问题。在“标准”SILAC实验中，在五次或五次以上的细胞分裂中对细胞进行标记，可以确保即使是非常稳定的蛋白质也能几乎完全（97%或更多）掺入标记的氨基酸(8,9). 为了确保SILAC可以应用于非分裂神经元，因为非分裂神经元没有分裂细胞所享受的标记稀释效应的优势，我们跟踪了单个蛋白质的标记掺入水平，并表明大多数蛋白质确实实现了显著水平的稳定同位素标记。在这里，我们展示了该方法的首次应用，并使用它评估了从胚胎大鼠皮层和海马制备的分离神经元培养物中BDNF依赖的磷酸酪氨酸相关信号事件。
BDNF是蛋白质生长因子神经营养素家族的成员。这些蛋白质作为生存因子发挥作用，确保哺乳动物神经系统发育过程中存活神经元与适当靶点之间的匹配(10). 它们还调节神经功能的许多其他方面，如细胞命运决定、轴突生长、树突修剪、长期增强、突触可塑性以及对正常神经功能至关重要的蛋白质的表达，如神经递质和离子通道(10–13). BDNF依赖性磷酸化酪氨酸相关信号事件主要通过TrkB受体酪氨酸激酶传递(14). 为了评估BDNF依赖的磷酸化酪氨酸相关信号事件，我们对来自BDNF处理和控制神经元的联合裂解物的Tyr（P）IP进行了LC-MS/MS分析(). 这些实验鉴定了13种差异免疫沉淀蛋白（SILAC比率高于1.5或低于0.67）和18种潜在变化蛋白（SILA比率高于1.25和低于0.80），表明酪氨酸磷酸化状态或与酪氨酸磷酸蛋白相关的BDNF依赖性变化。丰度不断变化的蛋白质包括许多已知的和潜在的新途径参与者。我们通过Western blot时间进程实验验证了其中六种蛋白质的SILAC结果。通过生物化学和细胞生物学方法进一步研究了BDNF刺激后Tyr（P）IP中丰度增加的两种蛋白质，Hrs和STAM。结果表明Hrs/STAM介导的RTK降解分选通路在神经元中起作用。
原发性神经元SILAC实验设计。在DIV 18时取出胚胎，解剖其大脑，并切除皮层和/或海马。然后将神经元分离并置于对照或标记培养基中，并允许加入标记10天。然后用配体处理细胞15分钟，并与来自同一解剖的未处理对照细胞1:1混合，然后进行Tyr（P）IP。通过SDS-PAGE对Tyr（P）IP洗脱液进行分级，并用凝胶中的胰蛋白酶进行消化，然后用LC-MS/MS分析胰蛋白酶消化液，以识别和量化这些存在的蛋白质。
实验程序
细胞培养和代谢标记-
皮质和海马细胞培养物的制备已在前面描述过(15,16)（有关详细信息，请参阅补充实验程序部分）。细胞在补充有B27（Invitrogen）和0.5 m米 我-谷氨酰胺（Invitrogen）或不含我-精氨酸和我-赖氨酸（Specialty Media，Philipsburg，NJ）13C同位素氨基酸（马萨诸塞州安多弗市剑桥同位素实验室）或同位素正常氨基酸（Sigma-Aldrich）。每3天刷新一次培养基，方法是将每个培养板上的培养液量减半，并用新鲜培养基替换。
BDNF刺激、细胞溶解和免疫沉淀-
细胞培养10天后在体外将BDNF（新泽西州落基山市PeproTech）以25 ng/ml的浓度添加到神经元培养物中，持续2、5、15（用于SILAC实验）、30和45分钟，用冰镇PBS清洗细胞，并立即将其置于含有1.0%Nonide P-40（Sigma-Aldrich）的冰镇裂解缓冲液中，150 m米氯化钠，20米米三氯化氢，pH 8，0.2 m米EDTA，2米米纳三VO（旁白）4，2米米NaF和蛋白酶抑制剂（完整片剂，罗氏应用科学）。Tyr（P）IP实验的裂解液要么直接与琼脂糖结合的抗磷酸酪氨酸抗体pY99结合（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）首先将20μl/ml用于4°C下过夜培养或SILAC实验的溶出液与20μl的小球混合在1:1的刺激：控制总蛋白比率中（基于Bradford分析），然后用溶出缓冲液将小球洗涤四次。免疫沉淀蛋白在Laemmli SDS-PAGE还原缓冲液（Bio-Rad）中煮沸5分钟后洗脱。在评估稳定同位素标记氨基酸掺入的单独实验中，海马神经元在标记培养基中生长28天，全细胞裂解物（上述裂解条件）与2×Laemmli还原缓冲液结合。
SDS-PAGE和In-gel色氨酸消化-
使用10%Tris-HCl凝胶（Bio-Rad）通过SDS-PAGE分离所有样品。用考马斯亮蓝（Bio-Rad）对凝胶进行染色，并将凝胶层水平切割成23个切片，用于Tyr（P）IP洗脱液和14个切片，以测量标签在裂解液中的结合。将切除的凝胶带切成小块，并在25m内去除污渍米碳酸氢铵，50%乙腈；乙腈脱水；并干燥。用10 ng/μl胰蛋白酶溶液在25 m内使凝胶片复水米碳酸氢铵并在37°C下培养过夜。用5%甲酸和50%乙腈提取两次肽，然后用乙腈进行最终提取(17). 将提取物混合，通过真空离心干燥，并在5μl 0.1%甲酸和2%乙腈中重新配制，用于HPLC样品注射。
质谱和蛋白质鉴定-
使用纳米流LC-MS/MS对胰蛋白酶凝胶内消化产生的肽混合物进行分析。使用与Q-TOF Micro和Q-TOF1质谱仪直接耦合的CapLC（Waters，Milford，MA）HPLC系统，以之前描述的相同方式对标签效率实验中的样品进行分析（英国曼彻斯特Micromass） (18). 为了分析BDNF诱导的磷酸酪氨酸蛋白质组变化，使用直接耦合到Q-TOF Premier质谱仪（Micromass）的纳米ACQUITY超高效液相色谱系统（Waters）进行实验。使用ProteinLynxGlobalServer 2.2软件（Waters）处理原始质谱数据。使用Mascot软件（英国伦敦矩阵科学2.1版）鉴定蛋白质，并使用蛋白质中心（丹麦欧登塞Proxeon）解析蛋白质（详细描述请参阅补充实验程序）。
标签合并和SILAC比率的量化-
在原始LC-MS/MS文件中跟踪标记和非标记肽对的MS光谱，并手动计算单个蛋白质的标记掺入百分比，以进行标记效率实验（补充方程式1）。使用开源软件MSQuant（由Peter Mortensen和Matthias Mann（SourceForge，Inc.）善意提供）进行实验性Tyr（P）IP SILAC比率量化。作为实现适当量化的额外措施，手动计算在多个条带和重复实验中观察到的蛋白质的加权平均比率（补充方程式2）。作为测量Tyr（P）IP中识别的蛋白质的标记掺入的对照，对仅在标记培养基中生长并以上述相同方式用BDNF刺激的细胞进行平行实验。使用MSQuant计算具有可观察到的未标记成分的肽信号的蛋白质的比率。对小于10:1的比率（我们数据中MSQuant的动态范围极限）进行标记效率校正。
Western Blot分析-
细胞培养、细胞处理和免疫沉淀与上述相同。沉淀蛋白通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上。在pH 7.5、含5%BSA或脱脂奶的0.05%吐温20（Fisher）（TBS-T）的Tris缓冲盐水中封闭膜；与相应的一级抗体（pY99，1:5000；Trk C-14，1:500；PLCγE-12，1:500，Shp2 N-16，1:500）孵育，小时(19)、STAM(20)（两份礼物均来自Harald Stenmark博士）和Nck2，1:500（Sigma））以及辣根过氧化物酶结合二级抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）1:7500；并用ECL（Pierce）检测。
免疫荧光和共焦显微镜-
细胞在4°C的PBS中的4%多聚甲醛中固定15分钟；用0.1%Triton X-100在PBS中透化2分钟；用TBS清洗，0.25%鱼皮明胶；用2%牛血清白蛋白、10%正常山羊血清、0.25%鱼皮明胶在TBS中封闭30min；然后与相关抗体（抗-Hrs，1:300；抗EEA1（BD Biosciences），1:500；二级抗体，1:500）在室温下在封闭溶液中保持30分钟。细胞后固定5分钟，清洗，并在4°C下与AlexaFluor555结合活化的酪氨酸磷酸化TrkB（pTrkB）抗体（抗体标记试剂盒，分子探针/Invitrogen）孵育过夜。细胞用PBS清洗三次，安装在Mowiol中，并使用配备40×Plan Neofluor数字孔径1.3差分干涉对比油浸物镜的LSM 510激光扫描共聚焦显微镜成像（均为纽约州桑伍德市卡尔蔡司显微成像公司）。使用LSM 510软件和美国国立卫生研究院ImageJ对图像进行处理。
HA-Hrs瞬时转染-
用0.5μg HA-Hrs质粒（Francis Lee博士赠送的礼物）和0.5μl Lipofectamine 2000（Invitrogen）在Neurobasic培养基中每盖玻片转染DIV 8的海马神经元45分钟，并在一夜之间转移回其原始培养基。然后将细胞饥饿于最低必需培养基（Invitrogen）、0.37%葡萄糖（Invit罗gen）和100μ米MK801（西格玛）5小时；用25 ng/ml BDNF刺激指定时间；固定的；玷污的；并如上所述进行成像。
结果
神经蛋白质的标记-
对来自海马神经元培养物的几种蛋白质进行了为期一个月的跟踪，以了解稳定同位素标记氨基酸的掺入效率。14天后，从全细胞裂解物中鉴定出的所有蛋白质都显示出显著（大于80%）的标签掺入水平在体外(). 该分析仅限于含有至少一种肽的蛋白质，这些肽可以在10个时间点中的9个点进行跟踪（补充表1）。这些结果表明，来自分化的非分裂细胞群（如培养的初级神经元）的蛋白质可以在培养中用氨基酸标记。在早期时间点（5天或更短时间），蛋白质表现出许多独特的标记结合特征，反映了蛋白质合成、周转和降解的不同组合，并证明初级神经元SILAC可用于观察此类现象。
神经元蛋白的标记掺入百分比。在多个时间点（1小时和1、2、3、4、5、7、14、21和28天）评估神经细胞全细胞裂解物中的蛋白质的标记掺入。圈子（•）代表观察到的标记掺入百分比最低的蛋白质，钻石(♦) 代表最高，以及正方形(▪) 用表示平均值误差线指示每个时间点所有测量的S.D。这个线是标签合并平均百分比的对数最佳拟合。1周后，所有定量蛋白质的标记率均大于70%在体外2周内>80%。
BDNF依赖的Tyr（P）IP蛋白丰度变化-
我们使用SILAC来研究皮层/海马神经元原代培养中BDNF刺激引发的细胞内信号事件。我们进行了一项初步实验（每种条件下1亿个神经元）和两项大规模复制实验（每一种条件下2亿个神经元。重复之间的标记条件颠倒，以排除SILAC标记产生任何差异的可能性。使用吉祥物搜索引擎识别蛋白质，使用MSQuant定量，必要时纠正标记不完整。根据反向序列的点击次数/总点击次数，我们总共鉴定了187个蛋白质，假阳性率为0.5%（补充表2）。在这些蛋白质中，有158种被认为是Tyr（P）IP特异性的，包括仅由一个肽序列识别但处于两种标记状态的蛋白质（肽的两种同位素形式）。二十种蛋白质可能是外源性污染物，如角蛋白亚型、IgG和白蛋白，但未见报道。仅由一种独特肽识别的蛋白质也被排除在外。我们获得了135种蛋白质的定量数据，其中65%的蛋白质具有标记效率测量值。在校正了同位素标记不完全掺入这些不分裂神经元中的单个蛋白质后，13种蛋白质的蛋白质丰度比（刺激状态：对照状态）高于1.50或低于0.67，另外18种蛋白质的平均标准差超过三个(即.3×0.08=0.24）从所有定量蛋白质的平均比率（1.01）(). 从重复实验中获得的比率的平均相对S.D.为0.21，表明实验之间的一致性很好。BDNF治疗后，在Tyr（P）IP中显示不同丰度的蛋白质包括已知的BDNF受体、TrkB（受刺激与对照的比率为6.82）和其他蛋白质，如Hrs和STAM（比率分别为3.87和3.41）。这些结果表明，初级神经元SILAC可以成为神经元细胞内信号蛋白组学研究的有力工具。
T型能够的我
BDNF处理15分钟后来自原代神经元培养物的Tyr（P）IP中丰度变化的蛋白质
斜体化蛋白质和虚线之间的比率（比率从1.50到1.25和0.60到0.65）被视为临界/潜在变化因素。符号“ex”代表已知的外源蛋白。
Western Blot验证-
为了进一步证实我们通过MS观察到的SILAC比率根据抗体的可用性选择进行Western blot分析。在使用BDNF治疗0、2、5、15或30分钟后，对来自与SILAC实验所用相同解剖的皮层/海马神经元培养物的裂解液进行使用pY99抗体的Western blot和IP以及用于先前已知和潜在新BDNF信号参与者的Westernblot。所选蛋白质包括已知的BDNF信号参与者、TrkB受体、PLCγ和Nck2，以及三种新的效应器Hrs、STAM和黏着斑激酶。如所示使用Tyr（P）和Trk抗体对Tyr。这些结果与之前的观察结果一致，即在BDNF治疗后TrkB受体和PLCγ迅速激活(11–13). 这些印迹还表明，在配体处理后，酪氨酸磷酸化蛋白水平增加，蛋白质负载量相等，Trk受体水平一致(). 为了产生具有平行Tyr（P）IP的凝胶泳道的一致负载，在每个时间点进行四次重复的Tyr（P）IP，合并洗脱液，并将相同的材料用于所有印迹。作为额外的负荷控制，对免疫沉淀抗体的IgG轻链的信号强度进行监测，以确定该条带的免疫反应性，即使用抗鼠二级抗体的。蛋白质印迹强度与所有监测蛋白的SILAC比率一致，为SILAC定量提供了额外证据().
Western blot验证。从SILAC实验所用的同一解剖中提取的皮层/海马神经元培养物，用BDNF处理不同时间。一对全细胞裂解物进行pY99和Trk-Western印迹。b条，pY99IP的裂解物，如一然后是已知和潜在新TrkB信号参与者的特异性蛋白印迹。在BDNF刺激15分钟后测量来自受刺激细胞和未受刺激细胞的Tyr（P）IP的SILAC比率，以进行比较。FAK（传真），粘着斑激酶；Hc公司、重链；第页，磷酸酪氨酸。
BDNF依赖性Hrs-STAM相互作用、Hrs-酪氨酸磷酸化以及内膜囊泡中磷酸化TrkB和Hrs的共定标-
如上所述用BDNF处理不同时间（对照和2、5、15和30分钟）的神经元全细胞裂解物用于Hrs IPs，然后进行蛋白质印迹以检测Hrs和STAM。这些印迹显示Hrs和STAM之间的相互作用依赖于BDNF的增加(). 在BDNF治疗后，观察到Hrs-IP中STAM的免疫反应性增加，以及Hrs-IP上清液中STAM信号的耗竭。Hrs-IP的PY Western blotting也表明，在BDNF治疗后，Hrs被酪氨酸磷酸化(). 使用二维蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳和Hrs-Western印迹的其他实验也表明，BDNF处理后，Hrs移动到一个大于400-kDa的大复合物中（补充图1）。免疫荧光和共聚焦显微镜显示，BDNF处理15分钟后，Trk和Hrs定位于离散的囊泡样点状物，其中许多包含这两种蛋白(). 在细胞体和神经元过程中似乎都发生了共放大作用（白色箭头). 额外的染色显示这些蛋白与EEA1共定位，表明在BDNF处理15分钟后，Trk和Hrs可以在早期内体中共定位().
增强Hrs-STAM相互作用和Hrs磷酸化。 一Western blot检测BDNF处理的皮层/海马神经元培养物的Hrs和STAM。这些结果表明，Hrs和STAM之间的相关性呈BDNF依赖性增加。b条，通过Hrs IP洗脱液的Tyr（P）Western blotting监测BDNF依赖的Hrs磷酸化。第页，磷酸酪氨酸。
Hrs和pTrkB的共定标。神经元培养物的免疫荧光和共焦显微镜显示，BDNF治疗15分钟后，Hrs和pTrkB在囊泡结构中共同定位(一). 这种共定位可以在两个细胞体中观察到(顶部面板)和神经突起(底部面板).白色箭头指出共同本地化的实例。b条BDNF处理15分钟后，额外的免疫荧光显示Hrs、pTrkB和EEA1（早期内体的标记物）共同定位。白色箭头在放大的图像中(右下面板)指出三重共定位的位置。
Hrs过度表达扰乱Trk降解-
用表达HA-Hrs的构建物转染海马神经元（DIV 8）。转染后第1天，细胞饥饿5 h，然后BDNF处理4 h。固定神经元并染色HA和总Trk(). 转染和未转染的图像细胞出现在同一张载玻片上，并带有单独的载玻片用于对照和BDNF模拟条件。饥饿后4小时的BDNF处理导致未转染对照细胞中Trk受体的下调(,面板用“−”指定符号). 过表达HA-Hrs的细胞（转染）具有较高水平的Trk(面板用“+”指定符号)表明BDNF处理后的受体降解被HA-Hrs的过度表达所破坏。
Hrs的过度表达。瞬时转染HA-Hrs的神经元培养物的免疫荧光和共焦显微镜(+面板)或不（−面板)已执行。之后对饥饿的细胞进行成像(左两行属于面板)或不带(右两行属于面板)BDNF处理4小时。转染和未转染的图像细胞出现在同一张载玻片上，并带有单独的载玻片用于对照和BDNF模拟条件。总Trk染色减少(红色)BDNF处理4小时后，可在对照细胞中观察到(4小时BDNF−面板). HA-Hrs的过度表达(绿色)导致Trk降解中断(4小时BDNF+面板).驾驶员信息中心差分干涉对比度。
讨论
据我们所知，在这里我们描述了SILAC首次应用于非分裂原代细胞培养（如我们在研究中使用的原代神经元）中细胞信号的表征。初级神经元细胞模型系统在神经科学中已经使用了几十年，因此与大量已建立的实验范式兼容。将这些范式与基于SILAC的方法相结合，可以提供比传统的蛋白质对蛋白质评估更广泛的细胞功能视图。与之前描述的基于细胞系的SILAC实验相比，该方法在评估神经细胞事件方面具有一些优势。最重要的是，它提供了一个更紧密地代表适当体内细胞内环境，这是评估信号转导事件的关键因素。据观察，许多RTK通过共享路径传输信号，但产生不同的生物输出。这可能归因于反应（可用下游成分）的细胞特异性上下文限制，或特定细胞内位点的信号蛋白定位，或受体激活产生的信号的特定组合(21–23). 这一想法加强了在适当的细胞环境中评估下游事件的必要性，并使研究人员在解释来自永生化细胞系的数据时认识到这一点，这些细胞系可能比原始组织更能代表癌细胞。
我们的结果也消除了人们普遍接受的观点，即SILAC实验仅限于划分细胞培养系统，因为需要5到6个群体加倍才能实现足够的标记。确实可以高效地标记非分裂、分化的细胞群，如初级神经元(). 初级神经元的特性，如实质性发育；神经突起生长，需要大量新的蛋白质合成；和相对长期的生存在体外对标记它们的能力做出了重大贡献。然而，其他具有类似性质的原代细胞也将成为SILAC实验的候选细胞。我们还发现，可以在相对较短的时间内（1小时至5天）监测SILAC标签在标记介质中的掺入率（数据未显示）。通过这些测量，蛋白质半衰期已经在其他系统的蛋白质组尺度上进行了计算(24,25). 这种方法可能有助于解决理解神经元功能的基本问题，例如突触处的活动依赖性蛋白质周转。
我们使用原代神经元SILAC研究BDNF刺激分离培养的皮层/海马神经元所产生的神经元信号转导。用BDNF刺激后，13个蛋白质的SILAC比率大于1.50或小于0.67，另外18个蛋白质的Tyr（P）IP比率大于1.25或小于0.80()包括BDNF信号的一些可能的新参与者。在这组蛋白质中，还有BDNF途径的已知成分，如TrkB(14)、PLCγ、SHP-2、Gab-1、Erk2(10,11,26)，编号2(27)和Fyn(16,28)这增加了我们的信心，我们观察到的其他变化可能与BDNF信号有关。我们还发现了运动蛋白和连接蛋白，以及一些有趣的现象，如特定细胞骨架成分的调节和特定组蛋白亚型的不同调节。我们进行了额外的实验来验证Hrs和STAM的参与，它们代表了之前没有报道过的TrkB的有趣下游效应器。
我们发现BDNF处理后培养神经元的Tyr（P）IP中的Hrs、STAM和网格蛋白重链比率分别为3.87、3.41和1.27。一些研究表明，活化的RTK通过网格蛋白介导的内吞作用从细胞表面去除(29). 受体贩运动态会影响信号输出(30,31)，这是一个对Trk信号传导特别感兴趣的领域，不同的Trk家族成员表现出不同的贩运行为(32). Hrs被认为可以将泛素化受体的浓度与多泡体形成的广泛机制的招募结合起来(33). 事实上，最近有研究表明，泛素化对TrkA和TrkB受体进行不同的调节，以调节神经元的存活(34).
Hrs和STAM形成一种与内胚体膜相关的异二聚体复合物，Hrs在多种生长因子和细胞因子的作用下被酪氨酸磷酸化(35,36). 已显示小时与STAM关联(20,37,38)与Hrs同时进行酪氨酸磷酸化(39). 肝细胞生长因子和表皮生长因子依赖的Hrs磷酸化都需要一个功能性的内吞途径以及活化受体和Hrs在早期内体中的一致定位(39,40). 迄今为止，尚未在神经元中观察到这种降解途径的作用，我们的结果表明TrkB可能参与了类似的过程。BDNF刺激后Tyr（P）IP中Hrs、STAM和网格蛋白重链的观察SILAC比率(和)与一个或多个这些蛋白质对BDNF刺激的反应中酪氨酸磷酸化增加一致。Hrs和STAM似乎以BDNF依赖的方式增加了它们之间的亲和力，联合免疫沉淀证明了这一点()，并且Hrs是酪氨酸磷酸化的，以响应BDNF处理(). BDNF处理后pTrkB与Hrs共定位(). 此外，在EEA1阳性点状细胞中可以观察到这种共定位，这表明早期内体中存在一定比例的共定位pTrkB和Hrs(). Hrs过度表达以类似于Hrs敲除的方式破坏其功能(41–43). 过度表达HA-Hrs的细胞在BDNF处理后Trk水平较高，受体降解减少，这表明Hrs的过度表达对Trk降解有显著的负面影响(). 与TrkA相比，TrkB受体主要是降解途径，而TrkA在刺激后会再循环到细胞表面，这些不同的转运途径与交替的生物反应有关(32). 确定Hrs-STAM复合体在Trk家族成员的这种不同行为中可能扮演什么角色将是很有趣的。我们相信，我们的数据为更彻底地评估神经元细胞内TrkB的贩运提供了坚实的基础。
结论
我们已经证明，可以用稳定的含同位素氨基酸高效标记非分裂、分化的细胞群，例如初级神经元。初级神经元的特性，如实质性发育和相对长期的存活在体外显著提高了标记效率，其他具有类似性质的细胞也有可能用于SILAC实验。我们成功地利用原代神经元SILAC研究了BDNF刺激分离培养的皮层/海马神经元下游的信号转导。在BDNF刺激后，显示Tyr（P）IP中SILAC比率变化的蛋白质包括许多已知和可能的TrkB通路下游新成分。其中一些蛋白质在配体处理后受体下调自身表面定位的明显能力中所起的作用尤其令人感兴趣。我们相信，初级神经元SILAC是在蛋白质组学尺度上评估神经元功能和细胞生物学的有力工具，并将在神经科学研究中发现许多应用。
致谢
我们感谢Harald Stenmark博士捐赠Hrs和STAM抗体，感谢Francis Lee博士捐赠HA-Hrs质粒。我们还感谢Rithwick Rajagopal博士和Mercedes Benya博士在建立初级神经元培养方面提供的专家技术援助，以及Helene Cardasis博士、Guoan Zhang博士和David Fenyo博士的有益讨论。
脚注
出版，MCP论文出版社，2008年2月6日，DOI 10.1074/MCP。M700387-MCP200型
1使用的缩写是：SILAC，细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记；脑源性神经营养因子；免疫沉淀；受体酪氨酸激酶；肝细胞生长因子调节酪氨酸激酶底物；信号转导适配器分子；磷脂酶Cγ；HA、血凝素；DIV，天在体外; pTrkB，活化的，酪氨酸磷酸化的TrkB。
*这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款P30 NS050276（NINDS）和美国国立卫生院共享仪器拨款RR017990（致T.A.N.）的全部或部分支持。这项工作还得到了欧洲分子生物学组织（致K.D.）、纽约大学和国立卫生研究院结构生物学研究生合作项目（致D.S.S.）以及NIH拨款NS21072和HD23315（致M.V.C.）的支持。这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，必须在此标记“广告“根据《美国法典》第18卷第1734节，仅为了表明这一事实。
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参考文献
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