趋化因子是一个小的促炎细胞因子超家族，参与多种免疫反应，包括过敏、炎症、感染、组织损伤、心血管疾病和恶性组织生长(王等, 1998). 尤其是在实体肿瘤中，最近的研究主要集中在α-或CXC-趋化因子亚家族。
CXCL12（=SDF-1）基因定位于染色体10q11.1，这与聚集在第4染色体上的其他已知CXC趋化因子的大多数基因形成对比。CXCL12的普遍表达与5′-侧翼区域中TATA-less和GC-rich序列的存在一致，正如在所谓的“看家基因”中经常发现的那样(白水等, 1995). 最近的研究表明，CXCL12在快速分裂的成纤维细胞和肝细胞中的表达显著降低(江等, 1994)、癌前结肠腺瘤、肝细胞癌(志富田等, 1997)以及各种恶性细胞系(贝格姆等, 1996,1999). 与CXCL12不同，CXCR4在不同来源的恶性细胞中的表达是异质的。而据报道，肝细胞癌患者的死亡率显著下降(贝格姆等, 1999)多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、子宫癌以及伯基特淋巴瘤发病率增加(塞加尔等，1998年a;伦佩尔等, 2000)，在结肠癌、食道癌和胃癌中未发现其调节(密特拉等, 1999)或在不同的肿瘤细胞系中(德温内尔等, 1999;默多克等, 1999).
在本研究中，我们在四个原代人肾癌细胞系、10个新采集的人类肿瘤样本和相应的正常肾组织中寻找了趋化因子受体的表达。此外，我们已经通过cDNA阵列方法确定了CXCL12/CXCR4信号传导诱导的关键分子变化。这里报道的基因变化可能为研究导致肿瘤进展的发育途径提供新的见解，也可能有助于设计新的治疗干预方法。
材料和方法
患者
所有患者在进入研究前均获得书面知情同意书。在肿瘤性肾切除术后立即采集10例患者的肾细胞癌（RCC）和邻近正常肾组织样本。所有患者均患有透明细胞型肾细胞癌，并于2001年1月至6月在布伦瑞克国立克林尼库姆医院接受治疗。由于患者6表现为一个巨大的肿瘤，肉眼看来由两个不同细胞类型的区域组成，因此采集了两个样本。患者10患有一个小肿瘤，在手术前的12个月内，肿瘤大小没有增加，宏观上看起来像良性肿瘤。患者特征总结于.
细胞系
人类肾癌细胞系A-498、CAKI-1、CAKI-2和HA-7（德国DSMZ Braunschweig）在添加10%热灭活胎牛血清（FBS；比利时Bio Whittaker Europe）的RPMI培养基中生长，2 mM（M）L-谷氨酰胺（英国苏格兰Gibco BRL），10 U ml−1青霉素和10毫克毫升−1链霉素（西格玛，德国）；细胞保存在95%空气/5%CO中237°C时。
RT–PCR
手术后立即处理肿瘤和肾脏组织样本。根据制造商的说明，使用TriRegent（美国MRC-Research）提取总RNA，并使用M-MLV逆转录酶（英国苏格兰Gibco）和Oligo dT引物（英国苏格兰Gibco）在42°C下逆转录35分钟。通过添加40μl Tris-EDTA（TE）缓冲液（pH=8）并在90°C下加热灭活8分钟来停止反应。以下引物（MWG Biotech，Ebersberg，Germany）用于随后的PCR：CXCR1（有义：5′CCT TGG GGG TGG TGG AT 3′；反义：5′AGG GCT GCT TGT CTC GTT C3′）、CXCR2（有义：5′TGC CTC ACC CCT TGC CAT AA 3′；反义：5′GCC AGC CTG ATT TTC TTT CTT TTG 3′）、CXCR3（有义：5′GTG GCC GAG AAA GCA GGG TAG ACG 3′；反义：5′CAG GCG CAA GAG CAG CAT CCA CAT 3′）、CXCR4（意义：5′GCC TTA TCC TGC CTG GTA TTG TC 3′；反义：5'GCG AAG AAA GCC AGG ATG AT 3′），CXCR5（意义：5'CGG AAA GAA GCT CGA AGG CAC AGT 3′；反义：5'CTC CGT TGG CAA GGG CAG AAG TAG 3′）；CXCL12α（意义：5′ACT GGG TTT GTG ATT GCC TCT GAA 3′；反义：5′GGA ACC TGA ACC CCT GCT GTG 3′）。用核糖体蛋白S9（RPS9）-基因的引物检测mRNA完整性和反转录（意义：5′CGC-AGG-AGA-CGG-TGG-AAG-C 3′；反义：5′-CGA-AGG-GTC-TCC-GCG-GGG-TCA-CAT 3′），这是一个常见的“看家基因”。按照制造商的说明，使用Promega Taq聚合酶（美国Promega）进行PCR。循环条件：94°C时5分钟，94°C下30次循环30秒，54°C（CXCR1+2）或58°C时30秒，72°C时30s，最后在72°C下10分钟。PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行解析，并通过溴化乙锭染色进行可视化。通过限制性内切酶消化确定扩增产物的特异性。
实时RT-PCR
为了量化CXCR4-、CXCL12α-和RPS9-mRNA水平，我们建立了实时RT-PCR分析。为此，我们根据制造商的说明使用了GeneAmp®5700热循环器和Taq-Man®通用混合母液（Perkin Elmer），包括SYBR®-Green PCR核心试剂。引物和循环温度与用于常规RT–PCR的引物和循环温度相同。所有实验至少进行了两次。如有要求，可从相应作者处获得详细说明。
流式细胞术
非酶法从烧瓶中取出A-498细胞，清洗，并在10时重新悬浮6 细胞ml−1在冰冷水洗涤缓冲液（含0.5%FBS的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，用10μg ml培养−1R-藻红蛋白标记的小鼠抗人CXCR4抗体（12G5；美国圣地亚哥PharMinen）在4°C下保持90分钟。使用FACScalibur流式细胞仪（美国Becton Dickinson）对细胞进行分析。
钙动员试验
A-498细胞生长在8室玻璃盖片上（美国Lab Tek Brand Products公司），并装载2μM（M）fura-2/AM（美国分子探针公司）在37°C下放置45分钟。将盖玻片转移到无FBS的缓冲液中，在加入2μg ml后测量单个细胞中的呋喃-2-特异荧光−1rhCXCL12α（美国研发系统公司），使用共焦显微镜（德国BIO-Rad），外荧光×40物镜。在340和380 nm激发下测量510 nm的发射荧光。数据由340 nm处的荧光强度除以380 nm的比值表示。为了建立上皮细胞的完整性，还使用缓激肽（德国西格玛）作为对照兴奋剂测量细胞内钙。
免疫组织化学
按照标准方法，将透明细胞肾癌和邻近正常肾组织的福尔马林固定和石蜡包埋存档标本在二甲苯中脱蜡。对于抗原回收，使用微波炉进行热预处理（柠檬酸盐缓冲液，pH=6.2；20 min，600 W）。用3%H封闭内源性过氧化物酶后2O（运行）2将Avidin-biotin-Blocking-Kit（Vector Laboratories，CA，USA）的内源性生物素和多克隆山羊抗人CXCR-4（fusin，克隆A-17；Santa Cruz Biotechnology，CA，US）抗血清（1:500）在4°C下培养过夜。在TRIS缓冲盐水中彻底清洗后，孵育生物素化的次级兔抗草酸抗体（1:250，60分钟）。生物素通过优化的碱性磷酸酶结合链霉亲和素-生物素复合物（NEN Life Science，MA，USA）检测。固红用作底物，血红素用于复染。
CXCL12α/CXCR4信号的分子特征
A-498细胞生长在两个75厘米2烧瓶汇合。随后，将新鲜培养基加入两个烧瓶中，在一个烧瓶中与0.5μg/ml混合−1rhCXCL12α。细胞分别在37°C下培养6 h和18 h，并立即用于总RNA分离。1176个基因在rhCXCL12α刺激下的差异表达与使用人类癌症1.2阵列（德国Clontech）通过cDNA阵列分析对未刺激的A-498细胞进行研究。样品制备如前所述(艾森和布朗，1999年). 简单地说，总RNA使用三试剂LS提取两次，中间使用DNAse I消化步骤。分别使用来自刺激培养物和非刺激培养物的3.5μg总RNA作为模板，用于特异性合成32P-放射性标记cDNA探针，根据制造商的建议（德国Clontech），但RT-酶被Superscript II（英国苏格兰吉布科）取代。随后，将cDNA探针并排杂交到相同的基因阵列膜上（克隆泰克公司Atlas Human Cancer 1.2阵列上固定的cDNA和对照的完整列表可以在http://www.clontech.com). 在杂交和广泛清洗后，将膜暴露在荧光成像屏上（日本富士）。使用Fuji Bas 2500 16位图像分析系统检测放射性。使用Array-Vision软件（加拿大成像研究5.1版）测量每个基因的光斑密度，以及许多质量控制参数（与Array-Vision手册进行比较）。结果在两个独立的阵列分析中得到证实，结果一致。为了比较两个阵列之间的密度值，将每个基因的表达水平归一化为每个样本测量的所有基因的总和。
结果
CXCR和CXCL12αmRNA表达
采用RT-PCR方法检测四种肾癌细胞株（A-498、CAKI-1、CAKI-2和HA-7）中趋化因子受体CXCR1-5的mRNA表达水平。CXCR4是所有肿瘤细胞（尤其是A-498肿瘤细胞）中唯一持续表达的受体（数据未显示）。
为了量化CXCR4和CXCL12α的表达水平，我们使用了实时RT-PCR分析。对所有四个细胞系以及10个原发性人类肿瘤样本和邻近正常肾组织进行CXCR4和CXCL12α以及RPS9-mRNA表达检测。后者被用作独立的“管家”。CXCR4 mRNA在A-498细胞中特别表达；A-498、CAKI-1、CAKI-2和HA-7细胞系的CXCR4/RPS9表达率分别为0.98、0.002、0.003和0.006(). 另一方面，CXCL12α在任何细胞系中几乎不表达（CXCL12 al/RPS9的表达比率在0.016–0.005之间；)，证实了常规RT-PCR的结果。
使用实时RT-PCR表达CXCR4和CXCL12αmRNA。10例RCC患者的四种RCC细胞系（A-498、CAKI-1、CAKI-2和HA-7）、肿瘤（T）和邻近正常非恶性组织（N）中的mRNA表达被证明是RPS9 mRNA表达的校正比率。CXCR4和CXCL12α的中位T/N比率分别为29.6（范围2.3-85.2）和0.36（范围0.1-2.3），表明恶性肾组织中的受体显著上调，而其配体的表达低于相应的正常肾组织。
在10例肾细胞癌患者的肿瘤和相应肾组织中，通过实时RT-PCR计算并校正RPS9（（CXCR4/RPS9）的CXCR4和CXCL12α基因表达的肿瘤/肾比率分布肿瘤/（CXCR4/RPS9）正常肾脏和（CXCL12α/RPS9）肿瘤/（CXCL12α/RPS9）正常肾脏分别），为每个患者提供和CXCR4的肿瘤/肾脏比率中位数分别为29.6（范围2.3–85.2），CXCL12α的肿瘤/肾比率中位数为0.36（范围0.1–2.3），与相应的正常肾组织相比，恶性肾组织中CXCR4表达显著上调，而其配体CXCL12。
CXCR4表面表达
使用小鼠抗人CXCR4和匹配的IgG2a同型控制抗体，通过FACS分析所有四种RCC细胞系，评估CXCR4细胞表面的表达。测定FACS阳性细胞百分比和相对平均荧光强度（MFI）。CAKI-2和HA-7细胞CXCR4阴性，而7%的CAKI-1细胞（Δrelative MFI，1.4）和56%的A-498细胞（△relative MPI，25.9）CXCR4阳性，这与我们的RT-PCR结果一致().
流式细胞仪分析CXCR4在A-498、CAKI-1、CAKI-2和HA-7 RCC细胞系上的表达。细胞系CAKI-2和HA-7不表达该受体。相反，CAKI-1对CXCR4 mAb 12G5呈弱阳性染色，A-498呈强阳性染色。
此外，我们用免疫组织化学方法证实了透明细胞肾癌中CXCR4在蛋白水平上的差异表达。与邻近的非恶性肾组织相比，我们能够证明CXCR4抗原在恶性组织中有异质但持续可检测的表达().
一例分化良好至中度的透明细胞肾癌的免疫组织化学染色（生物素-链霉亲和素法），与相邻正常肾组织（N）相比，恶性组织（T）中CXCR4的细胞质表达几乎呈弥漫性。
CXCR4功能正常
为了确定检测到的CXCR4蛋白是否具有功能，我们分析了其在rhCXCL12α刺激后诱导细胞内钙水平变化的能力。对几个细胞进行的同步共聚焦显微镜分析显示，a-498细胞对rhCXCL12α刺激的反应具有异质性。而2μg ml−1rhCXCL12α使a-498细胞中相当一部分细胞内的钙迅速而强烈地增加，其他细胞对刺激没有反应。相比之下，100 nmol缓激肽治疗诱导了所有a-498细胞中钙水平的短暂大幅升高().
钙2+A-498细胞对rhCXCL12α的反应通量。使用共焦显微镜，我们检测到a-498细胞对rhCXCL12α刺激的异质反应模式。用2μg ml刺激时−1rhCXCL12α导致部分a-498细胞（例如标有箭头的细胞）内的细胞内钙迅速而强劲地增加，其他细胞对刺激没有反应（例如标有星形的细胞）。相反，用100 nmol缓激肽刺激所有a-498细胞时，瞬时钙显著增加。图的上部=单个细胞的显微镜；图的下半部分=细胞内Ca2+fura-2染色显示通量；箭头，…rhCXCL12α响应A-498细胞；*-rhCXCL12α无反应A-498细胞。
rhCXCL12α刺激引起的分子变化
为了进一步分析CXCL12α/CXCR4信号传导诱导的分子变化，通过cDNA阵列分析研究了1176个基因在rhCXCL12α刺激下的差异表达。因此，将A-498肾癌细胞与rhCXCL12α一起或不与rhCXCL12α一起孵育6小时。使用1.4的背景阈值和1.9的最小表达率（刺激与发现31个基因受rhCXCL12α显著影响，可分为五大类：参与CXCR4信号转导途径的基因、转录因子、翻译和细胞周期调节因子、促凋亡基因以及PAI-1、白细胞介素、，组织蛋白酶L前体、神经调节蛋白和ECK().
表2
cDNA表达阵列实验结果。自然/非刺激和rhCXCL12α刺激的A-498肾癌细胞基因表达的比较
此外，我们使用第二个阵列实验来测试刺激18小时后rhCXCL12α对a-498肾癌细胞的影响。有趣的是，CD82是唯一保持上调的分子（因子+2.2），而转录因子c-六月，6小时后上调，18小时后下调（系数-1.9；数据未显示）。
讨论
肾细胞癌，尤其是转移时，仍然是临床医生管理和治疗的一个令人沮丧的肿瘤。它在外观上是异质的，表现出不同的组织学和功能特征，包括细胞增殖、新生血管生成、坏死和免疫反应的调节。尽管大多数RCC表现出宿主免疫细胞（主要是单核细胞系）的显著浸润，但免疫系统未能建立足够的抗肿瘤活性，不可避免地导致肿瘤进展和死亡。
众所周知，趋化因子及其受体在白细胞运输和归巢过程中发挥着重要作用，尤其是在炎症、感染、组织损伤、细胞损伤和恶性肿瘤生长的部位。最近的证据表明，这些蛋白还可以调节非白细胞功能，如血管生成/血管抑制、细胞迁移、凋亡细胞死亡的激活和增殖(王等, 1998). 因此，我们研究了CXC-趋化因子受体在原代RCC培养物和肾癌上的表达，并与正常肾组织进行了比较，检测了肾癌中CXCL12/CXCR4信号通路的改变。
CXCR4是迄今为止仅鉴定出单一配体CXCL12的少数趋化因子受体之一。这种趋化因子在骨髓基质细胞以及包括脑、心、肺、肾、胸腺、脾和肝在内的各种器官中组成性表达，并被认为在免疫监视、B细胞祖细胞增殖、B细胞迁移和单核细胞趋化性中发挥作用，静止T淋巴细胞与原始造血细胞(长崎等, 1994;乔等, 2000).
本研究首次评估了CXCL12/CXCR4在肾癌中的表达及其潜在功能，与正常肾组织相比，肾癌中CXCL12α的表达降低。四种受试RCC细胞系均未表达大量CXCL12αmRNA。这可能反映了它们的癌变性质，因为与邻近的非癌组织相比，CXCL12在癌前结肠腺癌中不表达，并且在大多数肝癌和消化道癌中减少(志富田等, 1997;贝格姆等, 1999). CXCL12似乎作为肿瘤抑制基因样分子对抗致癌作用(志富田等, 1997;乔丹等, 1999). 这种作用也可能通过CXCL12α抑制肿瘤生长所需新生血管的能力介导。因此，恶性细胞抑制CXCL12α的生成可能有利于某些肿瘤的生长(摩尔等, 1998)–这是一个从未被反对过的概念(萨尔塞多等, 1999).
CXCR4在广泛的组织中组成性表达，包括淋巴组织、胸腺、大脑、脾脏、胃和小肠(长崎等, 1994). CXCR4的功能尚未完全了解，但它似乎介导了多种功能，包括白细胞发育和贩运、HIV感染、胎儿血管正确化和中枢神经系统发育，以及可能的细胞分裂、肿瘤发生和生长(橘树等, 1998;邹等, 1998;Gabuzda和Wang，1999年).伦佩尔等(2000)在多形性胶质母细胞瘤中观察到CXCR4 mRNA水平的肿瘤级依赖性激增，并且该受体主要在血管生成和退行性、坏死和微囊性变化的区域表达，而不是在快速细胞增殖的区域表达。这些数据得到了其他人的证实，此外，胶质母细胞瘤细胞系中反义CXCR4转录物的表达导致轴突生长和细胞分化；用CXCR4特异性抗体治疗可抑制细胞增殖。因此，可以得出结论，CXCR4是人类胶质母细胞瘤肿瘤增殖所必需的(塞加尔等，1998年a,b条).
在最近的一份出版物中，CXCR4在乳腺癌细胞、恶性乳腺肿瘤以及转移瘤中高度表达。CXCR4信号与肌动蛋白聚合、伪足形成以及随后的趋化性和侵袭性反应有关。另一方面，CXCL12在代表乳腺癌转移第一目的地的器官中表现出最高表达水平，即淋巴结、肺、肝脏和骨髓。中和CXCL12-CXCR4相互作用显著降低小鼠区域淋巴结和肺的转移。因此，乳腺癌转移的最终分布反映了CXCL12在不同器官中的相对丰度(穆勒等, 2001). 由于乳腺癌和肾癌之间的转移模式至少在某种程度上具有可比性，因此CXCR4/CXCL12在肿瘤扩散中的类似机制也可能是活跃的。
在本研究中，我们发现与邻近的正常组织相比，肾癌样本中CXCR4 mRNA的表达上调。在A-498 RCC细胞表面发现了功能性受体。这些发现与以前关于上皮和神经元恶性肿瘤的报告一致，表明CXCR4在去分化细胞和/或血管生成、变性和坏死区域过度表达。所有这些细胞形式经常在肾癌组织中发现。然而，由于A-498而非CAKI-1、CAKI-2或HA-7癌细胞表现出较高的CXCR4 mRNA表达水平，诸如去分化、增殖和血管生成或变性和坏死等条件当然不是唯一和专门负责CXCR4表达的调节。
为了进一步阐明CXCR4介导的信号转导诱导的分子变化，我们使用cDNA表达阵列，并将CXCL12α刺激的A-498细胞（分别持续6和18小时）与未刺激的细胞进行比较。刺激6小时后，发现参与各种细胞过程的31个基因特异性上调或下调。
关于同样参与CXCR4信号传导的常见信号转导途径，有几个分子上调。该组中一个最有趣的分子是CD82（也称为kangai 1，抑癌因子6，KAI1），因为它是CXCL12α刺激6小时（因子2.3）和18小时（因子2.2）后唯一上调的分子。跨膜蛋白CD82与表皮生长因子受体（EGFR）和其他酪氨酸激酶受体直接相关，并加速酪氨酸受体诱导信号的脱敏，与受体内吞率增加相关(奥丁索娃等, 2000). CD82对EGFR信号的减弱解释了其最近被确定为前列腺癌和胰腺癌转移抑制基因的作用(东等, 1995;郭等, 1996). 此外，CD82被描述为单核细胞的激活/分化标记物(勒贝尔-比奈等, 1995). 其他特定调节的信号转导分子如.
早期生长反应基因EGR1是唯一被rhCXCL12α持续下调的转录因子（6 h因子，−3.9；18小时系数，−2.1）。EGR1在前列腺癌中过度表达，并参与调节前列腺癌发生和发展的不同步骤，包括有丝分裂、侵袭、血管生成和转移(斯瓦伦等, 2000).
AP-1转录因子家族的两个成员，即Fra-1（因子，+4.5）和c-Jun（因子，+2.1），在6小时后显著上调。在rhCXCL12α刺激18小时后，c-Jun水平显著下调（因子，-1.9；数据未显示）。这些改变的c-Jun–Fra-1比率很有趣，因为Fra-1蛋白与不同Jun蛋白异源二聚体形成稳定的低反式激活电位AP-1复合物。因此，Fra-1抑制AP-1活性，AP-1活性被认为是肿瘤促进剂作用的重要介质(吉冈等, 1995).
其他几种转录因子，即融合结合蛋白（FBP）-2、NF-κB p100亚基及其反馈抑制剂i-κBα以及干扰素调节因子（IRF）-1，在治疗6小时后仅表现出短暂的上调，而不是18小时。IRF-1作为干扰素系统的调节因子和调节细胞周期和细胞凋亡的关键转录因子发挥作用。已证明其具有抗增殖和肿瘤抑制功能，特别是通过其IFN-α和IFN-β的转录激活(沃恩等, 1997;嗯等, 2000).
rhCXCL12α对细胞周期调节分子也有一种有趣但短暂的影响（即6小时）。G1期细胞周期蛋白D以及E2F介导的S期基因转录阻断剂、芳香烃受体（AHR）和视网膜母细胞瘤结合蛋白p48（RbAp48）均显著上调。另一方面，rhCXCL12α处理的细胞中cylcin-G1水平较低。细胞周期蛋白-G1的表达在正常细胞的整个细胞周期中受到严格调控，在细胞周期的S期和G2/M期达到峰值，G1期水平较低(雷默等, 1999). 因此，CXCR4信号似乎对a-498细胞具有暂时的细胞周期抑制作用，阻止其从G1期过渡到S期。
这种细胞周期阻滞效应伴随着不同促凋亡分子的再次短暂上调，即前蛋白酶-8、-10和-6、半胱氨酸天冬氨酸酶和带死亡域的RIP适配器（CRADD）。前两个caspase是启动子caspase，通过Fas或TNFR-1等死亡受体和其他刺激物激活，而caspase-6是由凋亡级联激活的执行者caspase。促凋亡分子表达的增加与通过上调的I-κBα通过TNFR诱导的NF-κB中和抗凋亡信号传导相平行(穆斯塔法等, 2000).
总之，在CXCR4表达RCC的情况下，CXCL12-CXCR4通路可能是一个有趣的治疗靶点。转移抑制蛋白（例如CD82）、促凋亡分子（例如procaspases-8、-10和-6、CRADD、I-κBα）和阴性细胞周期调节因子（例如cyclin-D、AHR、IRF-1、RbAp48）的暂时同步上调与参与细胞周期进展和转移的分子的下调平行（例如。EGR1、细胞周期蛋白G1）。因此，CXCL12似乎是一种有希望的分子，可用于RCC联合治疗中肿瘤细胞的存在。然而，还需要进一步的研究来确定对转移和肿瘤进展的潜在生物学和临床影响。
