简介
SUMOs（与泛素相关的小修饰物）是约100个氨基酸的蛋白质，在翻译后与其他蛋白质共价结合(约翰逊，2004年；Kerscher等人，2006年). 虽然无脊椎动物表达一种SUMO，但脊椎动物表达三种副产物：SUMO-1、SUMO-2和SUMO-3。人类SUMO-2和SUMO-3的同源性约为96%（统称为SUMO-2/3），而它们与SUMO-1的同源性仅约为45%。所有三种SUMO通过共同的酶级联作用与其他蛋白质共价结合，涉及相同的E1激活酶和E2结合酶(约翰逊，2004年). 此外，通常认为这三种副作用通过相关机制影响修饰蛋白质，包括对蛋白质结构和功能的影响和/或蛋白质-蛋白质或核酸相互作用的变化。然而，一些证据表明，SUMO-2/3具有与SUMO-1不同的蛋白质靶标、信号特性和功能。例如，蛋白质组学研究已经确定了SUMO-1和SUMO-2/3修饰蛋白的不同但部分重叠的亚群(Rosas-Acosta等人，2005年；Vertegaal等人，2006年). 此外，与SUMO-1相比，SUMO-2/3结合优先上调以响应细胞应激，SUMO-2/3在细胞核内的流动性更强(阿耶丁和达索，2004年；Saitoh和Hinchey，2000年). 尽管有这些一般性观察结果，但SUMO-1和SUMO-2/3之间的具体功能差异仍有待确定。
通过生物化学和蛋白质组学方法，200多个蛋白质被鉴定为SUMO-1或SUMO-2/3底物，表明SUMO酸化是与细胞核相关的广泛功能的调节器(Seeler和Dejean，2003年). 遗传学研究特别确定了SUMO化在有丝分裂过程中调节染色体分离和进展的作用。在酵母和果蝇中，SUMO化对有丝分裂染色体凝聚、姐妹染色单体内聚、动粒功能和有丝分裂纺锤体伸长至关重要(瓦茨，2007). 虽然可以推测在不同的阶段有多种不同的蛋白被SUMO化以调节这些不同的有丝分裂事件，但相关的SUMO底物却很少被鉴定出来。已知底物包括拓扑异构酶II、Pds5、Ndc10和Bir1(Azuma等人，2003年；Bachant等人，2002年；Montpetit等人，2006年；Stead等人，2003年). 然而，值得注意的是，很少有研究确定哺乳动物细胞中SUMO化的有丝分裂功能或特定蛋白靶点。
在这里，我们证明SUMO-1和SUMO-2/3与不同蛋白质亚群的结合对于哺乳动物细胞有丝分裂的进展至关重要。由于CENP-E（SUMO-2/3底物和SUMO-2/2聚合物链结合蛋白）与动粒的结合存在缺陷，抑制SUMO化导致细胞在前中期停滞。我们的发现揭示了SUMO-2/3在调节CENP-E与动粒的关联方面的副序列特异性作用，并证明SUMO化与泛素化和磷酸化一样，是有丝分裂的关键调节器。
结果
SUMO-1和SUMO-2/3改造的差动调节
为了鉴定和表征哺乳动物SUMO-2/3的潜在独特功能，我们用人SUMO-2免疫小鼠并制备单克隆抗体（mAbs）。免疫印迹和免疫荧光分析表明，单抗8A2既识别SUMO-2又识别SUMO-3，但不识别SUMO-1(图S1). 先前分离的单克隆抗体21C7(Matunis等人，1996年)，与SUMO-1特异反应(图S1).
利用这些单克隆抗体，我们对HeLa细胞进行了免疫荧光显微镜检查，发现SUMO-1和SUMO-2/3在细胞周期不同阶段的定位存在显著差异(). 为了加强检测，细胞在固定前用洋地黄素渗透。这种处理对细胞在通透性之前固定时观察到的整体定位模式没有影响（数据未显示），但可以更清楚地检测SUMO-1和SUMO-2/3与潜在细胞结构的关联。在这些条件下，SUMO-1在间期细胞核膜的细胞质表面明显存在，而SUMO-2/3则不存在。前期，在浓缩有丝分裂染色体区域几乎没有检测到SUMO-1，但随着细胞进入中期，SUMO-1与有丝分裂纺锤体共定位，如前所述(Joseph等人，2002年；Matunis等人，1996年). 在后期，SUMO-1不再在有丝分裂纺锤体上检测到，而是在纺锤体中区发现。在末期，随着细胞分裂，SUMO-1继续定位于中区，最终定位于卵裂沟。SUMO-1在末期重组时再次出现在核膜上。
SUMO-1和SUMO-2/3结合物在有丝分裂期间定位于不同的亚细胞域，并受到不同的调节。答：。用洋地黄素渗透HeLa细胞，用甲醛固定，并使用SUMO-1或SUMO-2/3特异性单克隆抗体通过免疫荧光共聚焦显微镜进行分析。通过DAPI DNA染色确定指示的细胞周期阶段。Bar等于5µm。B。使用胸苷将HeLa细胞阻滞在S期，或通过胸苷和诺科达唑阻断在有丝分裂中同步，然后从诺科达唑释放指定的时间（小时）。用SDS-PAGE分离细胞裂解产物，并用SUMO-1或SUMO-2/3特异性单克隆抗体进行免疫印迹分析。作为有丝分裂和蛋白质负载的标记物，用抗磷甾酮H3和α-微管蛋白抗体检测裂解产物。
值得注意的是，与SUMO-1相比，SUMO-2/3在有丝分裂期间定位于不同的结构(). 在前期和中期，SUMO-2/3定位于浓缩染色体。随着细胞从中期发展到后期，SUMO-2/3似乎沿着染色体的长度扩散。在后期，SUMO-2/3信号覆盖了浓缩的染色体，随着细胞进入末期和胞质分裂，信号强度增加。
为了研究是否可以检测到SUMO-1和SUMO-2/3修饰蛋白在细胞周期中的变化，我们使用同步化细胞的裂解物进行了免疫印迹分析(). SUMO-1和SUMO-2/3修饰蛋白在异步细胞和S期细胞中的分布没有显著差异。相反，在有丝分裂细胞中检测到高分子量SUMO-1修饰蛋白的显著减少。这种减少一直持续到细胞重新进入G1。值得注意的是，SUMO-1修饰的RanGAP1水平在整个细胞周期中保持稳定。诺康唑处理后，高分子量SUMO-2/3修饰蛋白的总丰度也降低。然而，与SUMO-1相比，随着细胞在诺克唑释放后有丝分裂过程中的进展，SUMO-2/3结合物的水平逐渐增加。SUMO-2/3结合物的增加与在后期和末期检测到的染色体SUMO-2/2标记的增加相关(). 总之，这些结果表明，随着细胞在细胞周期中的进展，SUMO-1和SUMO-2/3与不同的蛋白质亚群结合，并且它们与这些蛋白质的结合受到不同的调节。
SUMO-2/3修饰的着丝粒和动粒蛋白
为了进一步研究SUMO-2/3在有丝分裂染色体上的定位，用共聚焦免疫荧光显微镜分析细胞，使用SUMO-2-3和CENP-B（着丝粒异染色质标记物）特异性抗体(库克等人，1990年) (). CENP-B染色显示为连接配对姐妹染色单体着丝粒的棒状信号，与SUMO-2/3定位显著重叠。细胞也被CENP-C抗体联合标记(Saitoh等人，1992年)显示为与SUMO-2/3信号部分重叠的成对病灶，表明SUMO-2/2与内动粒板部分并列().
SUMO-2/3修饰蛋白不同于拓扑异构酶IIα，定位于有丝分裂染色体的着丝粒和内动粒板。答：。用洋地黄素渗透HeLa细胞并用甲醛固定。用SUMO-2/3单克隆抗体和CENP-B或CENP-C抗体标记细胞，并用免疫荧光共聚焦显微镜进行分析。Bar等于10µm。B。用SDS-PAGE分离纯化的有丝分裂染色体，并用SUMO-2/3、SUMO-1和拓扑异构酶IIα（Topo IIα）特异性单克隆抗体进行免疫印迹分析。C、。HTETOP细胞在不含四环素（−Tet）的情况下培养，以允许拓扑异构酶IIα表达，或在存在四环素的情况下抑制表达。用洋地黄素渗透细胞，用甲醛固定，并使用拓扑异构酶IIα或SUMO-2/3特异性单克隆抗体通过免疫荧光显微镜进行分析。巴等于10µm。
为了表征与有丝分裂染色体相关的SUMOylated蛋白的分布，从结肠炎细胞中纯化染色体，并通过免疫印迹分析相关蛋白(). 针对SUMO-2/3的抗体显示出一个高分子质量共轭物阶梯（>120kDa）。未检测到未结合的SUMO-2/3（未显示），表明游离单体SUMO-2/2与有丝分裂染色体无关。与SUMO-2/3相比，使用SUMO-1抗体仅检测到与修饰的RanGAP1相对应的单个主带。
拓扑异构酶IIα是主要的SUMO-2/3修饰蛋白，与爪蟾卵提取物中形成的有丝分裂染色体相关(Azuma等人，2003年). 因此，用抗拓扑异构酶IIα的抗体探测HeLa细胞的前中期染色体制剂(). 拓扑异构酶IIα抗体与约160 kDa的蛋白质反应，该蛋白质与未修饰拓扑异构酶IIα的预测分子量相关，但与指示SUMO化的更高分子量带无关。我们还分析了HTETOP细胞中有丝分裂染色体的SUMO-2/3标记，其中拓扑异构酶IIα基因的表达由四环素反应启动子控制(Carpenter和Porter，2004年). 在没有拓扑异构酶IIα表达的情况下，我们观察到着丝粒和有丝分裂染色体的强烈SUMO-2/3标记，类似于表达拓扑异构酶IIα的细胞中的标记(). 这些发现与拓扑异构酶IIα在中期到后期转变时仅被SUMO-2/3短暂修饰一致(Azuma等人，2003年)并证明与拓扑异构酶IIα不同的其他SUMO-2/3修饰蛋白与哺乳动物细胞中的有丝分裂染色体相关。
抑制SUMO酸化阻碍细胞周期进展
基于它们在有丝分裂期间的定位，我们试图研究SUMO-1和SUMO-2/3修饰如何控制哺乳动物细胞中的染色体分离。大多数SUMO底物的修饰是动态的，修饰蛋白的水平由结合和异肽酶介导的去结合的相对速率决定(约翰逊，2004年). 因此，我们测试了SUMO特异性异肽酶的过度表达是否可以抑制培养细胞中SUMO化蛋白的积累。用GFP标记的SENP2瞬时转染细胞，SENP2是一种SUMO特异性异肽酶，通常与核孔复合体相关(Hang和Dasso，2002年；Zhang等人，2002年)，并通过免疫印迹分析测定对SUMO-1和SUMO-2/3修饰蛋白的影响(). 在未转染细胞中，检测到高分子量SUMO-1和SUMO-2/3结合物。相反，GFP-SENP2转染细胞中没有高分子量SUMO-1和SUMO-2/3结合物，表明SENP2过度表达抑制了SUMO化蛋白的积累。值得注意的是，SUMO-1修饰的RanGAP1不受SENP-2过度表达的影响，可能是由于与Nup358的保护性相互作用(Zhang等人，2002年).
SENP2过度表达抑制SUMO化并导致前中期阻滞。答：。转染GFP-SENP2的HeLa细胞在转染48小时后通过流式细胞仪纯化，用SUMO-1或SUMO-2/3特异性单克隆抗体进行免疫印迹分析裂解产物。将等量的未转染细胞作为对照进行分析。B。转染后48小时，用洋地黄素渗透Myc标记的SENP2和对照转染的HeLa细胞，并用甲醛固定。细胞被抗Myc抗体和SUMO-2/3或SUMO-1特异性单克隆抗体双重标记。箭头表示纺锤体两极的未对齐染色体对。钢筋等于10µm。C、。通过DAPI染色和荧光显微镜（Pro=前期和中期；Met=中期；Ana/Tel=后期和末期）。绘制的值是平均值加上至少3个实验的标准偏差（SD）。
为了研究SENP2过度表达对SUMO-1和SUMO-2/3定位的影响，转染后进行免疫荧光显微镜观察(). 对SUMO-2/3特异性抗体的分析显示，在SENP2过表达细胞中，SUMO-2-3与有丝分裂染色体的关联性丢失，与免疫印迹观察到的SUMO-2/3-修饰蛋白的丢失一致。相反，在SENP2过表达细胞和对照细胞中，SUMO-1染色几乎相同。SUMO-1和RanGAP1均定位于主轴(和S2J公司)表明RanGAP1是与纺锤体相关的主要SUMO-1修饰蛋白。
接下来我们研究了抑制SUMO化是否会影响染色体分离和/或细胞周期进展。用myc标记的SENP2转染细胞，通过DAPI染色和荧光显微镜测定有丝分裂各阶段细胞的比例(). 值得注意的是，转染后24至48小时，有丝分裂细胞显著增加。在48小时时，约25%的SENP2过表达细胞在前中期停滞。DAPI染色显示染色体聚集有缺陷，大量染色体对未能在中期板对齐，并集中在纺锤极(). 有丝分裂后期或后期未检测到转染细胞，后期前中期阻滞细胞的百分比下降。时间推移显微镜显示，滞留细胞无法退出有丝分裂并发生凋亡（未显示）。
抑制SUMO化影响CENP-E定位
SENP2过表达细胞中观察到的染色体聚集缺陷可能是由于动粒组装和/或功能缺陷所致。因此，我们通过免疫荧光显微镜研究了SENP2过度表达对个体着丝粒和动粒相关蛋白定位的影响。着丝粒相关蛋白Aurora B、CENP-B和Survivin的定位不受SENP-2过度表达的影响(,S2A和B). 类似地，动粒相关蛋白Hec1、CENP-C、CENP-F、Nup107和Nup96都正确地定位在SENP-2过度表达的细胞中(,S2C–F型). SENP2过表达细胞中唯一明显定位错误的蛋白质是外动粒相关蛋白CENP-E(). 在对照前期细胞中，在配对姐妹染色单体的动粒中检测到CENP-E。相反，在SENP-2过表达细胞的动粒中未检测到CENP-E。免疫印迹分析和使用蛋白酶体抑制剂克服SENP2诱导的前中期阻滞的尝试表明，CENP-E在动粒的丢失不是由于降解，而是由于动粒定位缺陷(图S3).
抑制SUMO化可阻断CENP-E与动粒的关联，并导致纺锤体检查点的持续激活。用Myc-tagged SENP2或空载体转染HeLa细胞。转染48小时后，用多聚甲醛固定细胞并用Triton X-100渗透，然后用DAPI和指示的抗体标记后用免疫荧光显微镜进行分析。钢筋等于10µm。答：。抗Myc和Aurora B抗体分析。B。抗Myc和Hec1抗体分析。C、。抗Myc和CENP-E抗体分析。D。用抗Myc和BubR1抗体进行分析。
CENP-E动粒定位的缺陷与SENP2过度表达细胞中的染色体聚集缺陷一致，因为CENP_E的缺失或抑制也会导致细胞在未对齐染色体对的前中期停滞(McEwen等人，2001年). 为了进一步建立SENP2过度表达和CENP-E定位错误之间的联系，我们检测了纺锤体检查点蛋白BubR1、Mad2和Bub1的定位(,S2G–I系列). 这些检查点蛋白独立于CENP-E与动粒相互作用。然而，它们不是从在缺乏功能性CENP_E的细胞中积累的未对齐染色体对的动粒中释放出来的(McEwen等人，2001年). 在对照前期细胞中，在所有配对姐妹染色单体的动粒中检测到BubR1、Mad2和Bub1。在SENP2过表达细胞中，BubR1、Mad2和Bub1信号在中期平板上排列的染色体的动粒上较弱或检测不到。然而，在纺锤极的未对齐染色体上检测到所有三种蛋白质的强信号。这些结果与CENP-E的缺失一致，CENP/E是影响SENP2过表达细胞的主要动粒缺陷。
为了证实CENP-E的错误定位与SUMO化的抑制直接相关，我们使用小干扰RNA来抑制必需的SUMO E2结合酶Ubc9的表达。耗尽Ubc9细胞导致高分子量SUMO-1和SUMO-2/3结合物显著减少，最显著的是，导致细胞周期阻滞，其性质与SENP2过度表达细胞中观察到的阻滞相同(图S4). 值得注意的是，与SENP2过表达细胞一样，观察到的染色体聚集缺陷与CENP-E的定位错误相关。这些发现表明，抑制SUMO化导致染色体聚集缺陷，并由于CENP-E.的定位错误而持续激活纺锤体检查点。
CENP-E和SUMO-2/3聚合物链之间的基本相互作用
几个机制可以解释将CENP-E靶向动粒时SUMO化的要求。我们试图通过首先确定CENP-E是否为SUMO底物来研究可能的机制。为了简化分析，我们将重点放在CENP-E（氨基酸1958-2701，称为尾结构域）的约700个氨基酸羧基末端片段上，这对动粒定位是必要的和充分的(Chan等人，1998年). 在存在和不存在编码SENP2的质粒的情况下，将编码FLAG标记的CENP-E尾结构域的质粒瞬时转染到细胞中(). 在没有SENP2过度表达的情况下，CENP-E尾结构域定位于动粒，如与CENP-B共同定位所示。相比之下，与内源性CENP/E类似，在SENP2过表达细胞中，尾结构域对动粒的定位受到抑制。
CENP-E尾部结构域在动粒上的定位与其SUMO-2/3修饰相关。答：。将编码FLAG标记的CENP-E尾结构域的质粒单独或与编码Myc-tagged SENP2的质粒一起转染HeLa细胞。转染48小时后用多聚甲醛固定细胞，用Triton X-100渗透，用DAPI、抗FLAG和CENP-B抗体标记后用免疫荧光显微镜进行分析。Bar等于10µm。B。用空质粒（对照）转染293个细胞，仅转染FLAG标记的CENP-E尾结构域的质粒编码，或转染FLAG-标记的CENP-E尾区域的质粒编码以及Myc-标记的SENP2的质粒编码。在1%Empigen BB存在下对FLAG标记的CENP-E尾结构域进行免疫纯化，并使用所示的FLAG、SUMO-1或SUMO-2/3特异性抗体进行免疫印迹分析。
为了确定CENP-E尾结构域是否是SUMO化的底物，用编码FLAG标记尾结构域的质粒或与编码SENP2的质粒一起瞬时转染细胞。在破坏蛋白质相互作用的条件下进行免疫纯化，并通过免疫印迹分析分析纯化的蛋白质(和5安). 从转染或不转染SENP2的细胞中免疫纯化等量的FLAG标记的CENP-E尾结构域，大多数全长蛋白根据其未经修饰的80kDa形式迁移（低于80kDa的蛋白可能代表降解产物）。用SUMO-1特异性抗体进行免疫印迹后，未检测到CENP-E尾部结构域的高分子量形式。相反，用SUMO-2/3特异性抗体进行免疫印迹后，观察到在95kDa和凝胶顶部之间迁移的高分子质量带呈阶梯状。在共表达SENP2的细胞中未检测到这种CENP-E结合物阶梯，这表明CENP-E-尾结构域的SUMO-2/3修饰与其定位于动粒之间存在相关性。CENP-E尾部结构域的SUMO化在体外得到验证(图S7). 为了绘制CENP-E中SUMO-2/3修饰位点的图谱，我们对存在于一致SUMO化位点中的尾结构域中的8个赖氨酸残基进行了突变。然而，该突变尾结构域在体内的表达表明，它既被SUMO-2/3修饰，又以动粒为靶点(图S6). 由于尾部结构域包含87个额外的赖氨酸残基，并且似乎在多个位点进行了修饰，因此我们寻求了另一种方法来研究SUMO-2/3修饰与CENP-E动粒靶向性之间的关系。
最近的研究强调了共价SUMO化和非共价SUMO结合在PML核体靶向蛋白中的重要性(Lin等人，2006年；沈等，2006). CENP-E尾部结构域的分析揭示了一个与其他SUMO结合蛋白中发现的保守SUMO相互作用基序（SIM）密切匹配的序列基序() (Hecker等人，2006年). 为了研究该基序是否介导与SUMO的相互作用，使用野生型CENP-E尾结构域和SIM中两个共有疏水残基突变的突变体进行了体外结合分析(). 在单体SUMO-1或SUMO-2的结合测定中，未检测到相互作用。由于SUMO-1和SUMO-2/3也可能作为聚合物存在于体内，因此我们对聚合物链进行了结合分析。引人注目的是，野生型CENP-E尾结构域特异性结合到SUMO-2聚合物链上，这种相互作用因SIM突变而显著减少（>8倍）。基于体内和体外分析，SIM突变对CENP-E尾部结构域的共价SUMO化没有影响(图S5B和S7).
CENP-E与动粒的结合依赖于与SUMO-2/3聚合物链的非共价结合。答：。CENP-E尾域中假定SIM与PML和Daxx中已知SIM的序列比对。将位于位置2307和2308的两个异亮氨酸残基突变为赖氨酸，以生成SIM突变CENP-E尾结构域。B。野生型（WT）和SIM突变体CENP-E尾结构域在体外表达[35S] 蛋氨酸，并与含有GST、SUMO-1、SUMO-2、SUMO-1-聚合物链或SUMO-2聚合物链的谷胱甘肽sepharose珠培养。结合蛋白通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。输入代表每次结合分析中使用的总蛋白质的50%。通过磷光图像分析定量相对结合活性。SIM突变体的相对结合活性被标准化为WT的相对结合活性。误差条指示来自3个实验的SD。C、。用FLAG标记的野生型（WT）和SIM突变体CENP-E尾结构域构建物转染HeLa细胞，转染48小时后用免疫荧光显微镜进行分析。细胞被抗FLAG和CENP-B抗体双重标记。所示为表达野生型和SIM突变CENP-E尾结构域的前期细胞。Bar等于10µm。D。用抗FLAG抗体的免疫荧光显微镜分析晚期和有丝分裂后表达FLAG标记的SIM突变体CENP-E尾结构域的细胞（左两个面板）。用抗CENP-E抗体在未转染的细胞中检测到内源性CENP-E的中体定位（右两个面板）。用DAPI检测DNA。Bar等于10µm。E.公司。用FLAG标记的野生型（WT）和SIM突变的CENP-E尾结构域构建物转染HeLa细胞48小时后制备细胞裂解物，并用抗FLAG和微管蛋白抗体进行免疫印迹分析。F、。用FLAG标记的野生型（WT）（n≥105细胞）或SIM突变型（n≥273细胞）CENP-E尾结构域转染48小时后，通过DAPI染色和荧光显微镜（Pro=前期和中期；Met=中期；Ana/Tel=后期和末期；Multi-Nuc=多核细胞）。绘制的值是3个实验的平均值加SD。
为了确定CENP-E和聚合物SUMO-2/3之间的非共价相互作用是否对CENP_E定位很重要，用编码FLAG标记的野生型和SIM突变CENP-E尾结构域的质粒转染细胞，并用免疫荧光显微镜进行分析(). 野生型CENP-E尾结构域定位于大多数有丝分裂细胞（>90%，n=51）的动粒，并由于内源性全长CENP_E移位而导致前中期阻滞(Chan等人，1998年). 相反，尽管表达水平与野生型蛋白相似，但转染SIM突变尾结构域的大多数细胞（>88%，n=51）没有检测到动粒定位。此外，SIM突变体的表达没有导致有丝分裂停滞，这与动粒定位效率低下一致。在有丝分裂后期，在纺锤体中区和中体检测到SIM突变体CENP-E尾结构域，可能影响胞质分裂并导致多核细胞增多。SIM突变体定位于内源性CENP-E的中体镜像定位()表明蛋白质被正确折叠。我们还检查了包含SIM突变的全长CENP-E的定位，发现与突变的尾结构域一样，它未能正确定位到动粒(图8S).
发现与SUMO-2/3聚合物链的非共价相互作用对CENP-E定位至关重要，这促使我们识别其他经SUMO-2-3共价修饰的动粒相关蛋白。我们专门研究了SUMO-2/3是否可以修饰BubR1和/或Nuf2，因为两者都与CENP-E动粒靶向有关(Chan等人，1998年；Liu等人，2007年). 用编码FLAG标记的BubR1或Nuf2的质粒瞬时转染细胞，并使用FLAG特异性抗体进行免疫纯化。免疫印迹分析表明，BubR1和Nuf2都被SUMO-2/3修饰，但没有被SUMO-1修饰(). 值得注意的是，SENP2过度表达抑制了SUMO-2/3对BubR1和Nuf2的修饰。因此，CENP-E和SUMO-2/3聚合物链（结合到可能包括BubR1和Nuf2的动粒相关蛋白）之间的非共价相互作用对于CENP-E-定位和在动粒中的功能至关重要。
BubR1和Nuf2在体内被SUMO-2/3特异性修饰，这表明CENP-E对动粒的SUMO-2/3-依赖性靶向模型。答：。将空质粒（对照）、FLAG-标记的BubR1质粒单独或FLAG-标签的BubR1和Myc-标签的SENP2质粒一起转染293细胞。根据指示，用FLAG、SUMO-1或SUMO-2/3特异性抗体对FLAG标记的BubR1进行免疫纯化和免疫印迹分析。B。按照BubR1的描述分析Nuf2的SUMO化。C、。SUMO-2/3修饰和聚合物链结合在调节CENP-E与动粒结合中的作用的拟议模型。CENP-E被描述为羧基末端尾部结构域内含有SUMO-2/3聚合物链相互作用基序（缺口）的二聚体。动粒/着丝粒被描述为具有相关蛋白质，包括BubR1和Nuf2，以及共价SUMO-2/3修饰位点（绿色条）。动粒上SUMO酸化和去SUMO化的相对水平决定了CENP-E结合的稳定性。虽然未描述，但CENP-E也可以通过SUMO-2/3聚合物链进行共价修饰。CENP-E的SUMO化可通过介导与动粒上其他含SIM蛋白的蛋白质的相互作用进一步促进动粒关联。
讨论
通过使用内源性蛋白抗体研究哺乳动物细胞中SUMO-1和SUMO-2/3修饰的性质和功能，我们发现SUMO-1与SUMO-2/2结合到独特的蛋白质亚群，是不同的调节和控制细胞周期进程的不同方面。SUMO化的整体抑制揭示了SUMO-2/3修饰在调节CENP-E与动粒的相互作用，从而调节中期板染色体的排列方面具有重要的副序列特异性作用。SUMO化的这一功能和其他基本功能，包括将RanGAP1靶向有丝分裂纺锤体的SUMO-1依赖性功能(Joseph等人，2002年)和SUMO-2/3对拓扑异构酶II活性的调控(Azuma等人，2003年)表明多种不同因子的SUMO化通过有丝分裂调节进展。因此，SUMO化与泛素化和磷酸化一样，是一个关键的有丝分裂调节器。
通过SUMO-1和SUMO-2/3的独特信号
我们观察到SUMO-1和SUMO-2/3在间期和有丝分裂细胞中定位于不同的亚细胞结构，表明它们与独特的蛋白质亚群结合并调节独特的细胞功能。进一步支持这一结论，我们还发现SUMO-1和SUMO-2/3的结合和去结合随着细胞周期的变化而受到不同的调节。理解蛋白质是如何被SUMO-1或SUMO-2/3选择性修饰的，以及它们的修饰是如何通过细胞周期进行时间调控的，这是未来的重要问题。
它们独特的蛋白质靶点和差异调节也表明SUMO-1和SUMO-2/3是指定不同命运的不同信号。这些命运是什么，如何定义，也是重要的问题。与泛素化类似，SUMO-1和SUMO-2/3可以通过调节与不同下游结合伙伴的相互作用来指定不同的命运(Pickart和Fushman，2004年). 支持这一点的是，已鉴定出具有副logue特异性结合亲和力的SUMO结合蛋白(Hecker等人，2006年). 此外，单体和聚合物SUMO副产物可能代表不同的信号。与此一致，我们发现CENP-E包含一个SUMO相互作用基序，该基序特异性结合SUMO-2/3聚合物链。
SUMO-2/3调节CENP-E动粒结合
CENP-E是一种与有丝分裂染色体的外着丝粒板和纤维冠相关的plus-end定向微管运动蛋白(Cooke等人，1997年；Wood等人，1997年；Yao等人，1997年). 通过连接动粒和纺锤体微管，CENP-E在中期板的染色体排列和沉默有丝分裂检查点方面发挥作用。几个与动粒相关的蛋白直接与CENP-E相互作用，包括BubR1、CENP-F和Nuf2，并可能介导CENP-E-与动粒的关联(Chan等人，1998年；Liu等人，2007年). 然而，值得注意的是，CENP-E与动粒的联系是动态的。尽管CENP-E在前期和中期集中于动粒，但它也与纺锤体微管有关(Cooke等人，1997年；Yao等人，1997年). 此外，CENP-E在动粒的相对浓度随微管结合而变化，因此相对于滞后动粒，领先动粒具有更多的CENP/E(Yao等人，1997年). 最显著的是，CENP-E的大部分在后期和末期从动粒重新分布到纺锤体中带和中体(Cooke等人，1997年；Yao等人，1997年). 因此，一种或多种机制调节CENP-E与动粒关联的稳定性。
我们已经确定SUMO-2/3修饰是CENP-E与动粒相互作用的重要调节剂。抑制SUMO化后，SUMO-2/3修饰蛋白在着丝粒和动粒处丢失。同时，检测到CENP-E动粒定位缺陷。我们发现，抑制SUMO化后，CENP-E在动粒处的丢失是由于CENP-E-定位缺陷，而不是降解。我们特别发现，CENP-E和SUMO-2/3聚合物链之间的非共价相互作用对于动粒结合至关重要。基于此，我们提出动粒相关蛋白的共价SUMO化，以及CENP-E和这些修饰蛋白之间的非共价相互作用，调节CENP_E的定位(). 该模型类似于蛋白质与PML核小体组装和相互作用的模型(Lin等人，2006年；沈等，2006). 重要的是，该模型提供了一种机制，通过调节动粒相关蛋白的SUMO酸化和去SUMO化，在CENP-E和动粒之间产生亲和力梯度。值得注意的是，我们发现体内的SUMO-2/3修饰了BubR1和Nuf2蛋白，这两种蛋白参与促进CENP-E和动粒之间的相互作用。因此，BubR1和Nuf2的SUMO化可能与CENP-E定位直接相关。此外，在体外和体内检测到CENP-E尾部结构域本身的SUMO-2/3修饰。未来的工作将确定此修改以及BubR1和Nuf2的修改是否直接规范CENP-E本地化。确定在着丝粒和动粒上调节SUMO酸化和去SUMO化的因子也很有意义。目前尚不清楚SENP2是否正常地在动粒上解偶联蛋白质。
先前的研究发现，抑制SUMO化后染色体分离和/或胞质分裂有缺陷(Hayashi等人，2002年；Nacerddine等人，2005年)，我们是第一个在CENP-E定位中检测到缺陷的公司。这可能反映了CENP-E在不同细胞类型中维持纺锤检查点信号的绝对要求的差异。在小鼠原代成纤维细胞中，CENP-E对纺锤体检查点的激活至关重要，其缺失会导致染色体分离缺陷，而不会导致有丝分裂阻滞(Putkey等人，2002年). 相反，培养的HeLa细胞中CENP-E的缺失或抑制导致纺锤体检查点的持续激活和前中期阻滞(Schaar等人，1997年；Yao等人，2000年).
在酿酒酵母SUMO修饰了至少四种动粒相关蛋白，包括Ndc10、Bir1、Ndc80和Cep1(Montpetit等人，2006年). Ndc10的SUMO化在后期靶向有丝分裂纺锤体。SUMO酰化对Bir1、Ndc80和Cep1的影响尚不清楚。然而，值得注意的是，Ndc80（Hec1）的哺乳动物同源物是含有Nuf2的蛋白质复合物的一部分。还值得注意的是，哺乳动物Bir1同源物（Survivin）与着丝粒的动态关联是通过K63连接的多泛素链修饰来调节的，可能通过与SUMO化类似的机制(Vong等人，2005年). 所以，可逆的泛素化和SUMO化都调节着正常的动粒和着丝粒功能所需的动态蛋白质相互作用。与泛素化一样，SUMO化可能通过修饰多种不同的蛋白质来调节多种有丝分裂事件。要了解SUMO化调节的全系列事件，需要鉴定有丝分裂过程中SUMO-1和SUMO-2/3修饰的全套蛋白质。
方法
抗体
用全长重组人SUMO-2免疫小鼠，产生SUMO-2/3特异性单克隆抗体8A2。按照SUMO-1特异性单克隆抗体21C7的描述进行杂交瘤的生产和筛选(Matunis等人，1996年).
本研究中使用的其他抗体来自以下来源：抗PML，伦敦帝国理工学院保罗·弗里蒙特博士；抗CENP-B（Ra 764）；抗CENP-C（Ra 554），美国国立卫生研究院Ann Pluta博士；反CENP-E（HpX），加州大学圣地亚哥分校Don Cleveland博士；抗Bub1和抗BubR1，Tim Yen博士，富士康；抗MAD2，E.D.Salmon博士，北卡罗来纳大学；CREST人类自身抗体，B.R.Brinkley博士，贝勒医学院；抗Survivin和抗Aurora B，郑义贤博士，华盛顿卡内基研究所；抗泛素，约翰·霍普金斯大学Cecile Pickart博士；抗Myc抗体，细胞信号技术，马萨诸塞州贝弗利；反RanGAP1(Matunis等人，1996年); anti-Hec1和anti-CENP-F，BD Biosciences，加利福尼亚州圣何塞；纽约州普莱西德湖上游抗磷甾酮H3（Ser 10）；抗α-微管蛋白（DM1A），西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州；和抗反异构酶IIα，TopoGEN，Columbus，OH。
细胞培养、同步化和转染
HeLa和293细胞在补充有10%胎牛血清、10 mM HEPES（pH 8.0）和1%青霉素-链霉素的DMEM（Invitrogen，Carlsbad，CA）中保持在37°C。HeLa细胞通过在2 mM胸腺嘧啶核苷存在下培养19小时，从胸腺嘧啶核素中释放3小时，然后在100 ng/ml诺卡唑存在下培养13小时，在有丝分裂中同步化。细胞通过洗涤从诺卡唑块中释放，然后在新鲜培养基中培养指定时间。通过在2 mM胸腺嘧啶核苷存在下培养35小时，用PBS洗涤并在SDS样品缓冲液中赖氨酸，获得S期细胞。如前所述，HTETOP细胞系在存在或不存在四环素的情况下保持和培养(Carpenter和Porter，2004年).
为了进行转染，HeLa或293细胞培养至约60-70%的汇合处，并根据制造商的说明（Invitrogen，Carlsbad，CA），使用Lipofectamine-Plus试剂与指定质粒进行转染。使用相同条件和空质粒进行对照。
免疫荧光显微镜
如图所示，使用三种方法制备玻璃盖玻片上培养的HeLa细胞。在第一种方法中，使用PBS中2%的甲醛在室温下固定细胞30分钟，然后在−20°C丙酮中渗透5分钟。在第二种方法中使用20µg/ml洋地黄素（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）在含有20 mM HEPES-KOH（pH 7.3）的缓冲液中渗透细胞，110 mM醋酸钾、2 mM醋酸镁、10 mMN个-乙基马来酰亚胺（NEM）和蛋白酶抑制剂（1mM PMSF、20µg/ml抑肽酶和5µg/ml亮蛋白胨、Antipin和pepstatin A）在室温下持续5分钟。随后在室温下使用2%甲醛在PBS中固定细胞30分钟。在第三种方法中，用3.5%多聚甲醛在PBS中固定细胞7分钟，然后用0.2%Triton X-100在PBS内渗透30分钟。如前所述进行免疫染色(Matunis等人，1996年). 使用UltraVIEW旋转圆盘共焦显微镜和采集软件（马萨诸塞州韦尔斯利Perkin Elmer）采集共焦图像。
染色体纯化
HeLa细胞悬浮培养，并在100 ng/ml的秋水仙素存在下培养16小时，使其在中期前停滞。如前所述纯化有丝分裂染色体(刘易斯和莱姆利，1982年). 在含有0.02%吐温-20，5 mM MgCl的PBS中，用苯甲酸酶®核酸酶（Novagen，La Jolla，CA）消化染色体组分2和蛋白酶抑制剂在30°C下放置10分钟，然后添加SDS样品缓冲液。
流式细胞术
转染GFP-SENP2 24小时后，将HeLa细胞进行胰蛋白酶化，并在无血清的DMEM中重新悬浮。使用MoFlo™高性能细胞分选仪（丹麦格洛斯特鲁普达科）对GFP阳性和阴性细胞进行分选和计数。收集的细胞在SDS样品缓冲液中进行裂解，并通过SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。
免疫净化
转染48小时后，293个细胞在含有20 mM HEPES pH 8.0、150 mM NaCl、2 mM EDTA和2 mM MgCl的缓冲液中通过超声溶解21%Empigen（加州圣地亚哥Calbiochem）、蛋白酶抑制剂和10 mM NEM。细胞裂解物在4°C下以20000×g离心10分钟以澄清，并与抗FLAG珠（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）在4°C下孵育5小时。抗体珠用裂解缓冲液洗涤六次，结合蛋白用SDS样品缓冲液洗脱。免疫纯化蛋白用SDS-PAGE分离，免疫印迹分析。在SDS存在下进行的免疫纯化产生了相同的结果(图S5).
为了免疫纯化BubR1和Nuf2，转染细胞在含有1%SDS、1×RIPA缓冲液（1%Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、300 mM NaCl、20 mM HEPES pH 8.0、2 mM EDTA和2 mM MgCl2)蛋白酶抑制剂和20 mM NEM。将裂解液在95°C下加热10 min，冷却并用1×RIPA缓冲液稀释，以将最终SDS浓度调整为0.1%。使用抗FLAG珠进行免疫纯化。
RNA干扰
用Ubc9 siRNAs转染HeLa细胞(Lin等人，2003年)根据制造商的说明（加利福尼亚州卡尔斯巴德市英维特罗根），使用寡效胺（40 pmol/3.5 cm孔）。一种针对萤火虫荧光素酶的siRNA（科罗拉多州拉斐特Dharmacon）被用作对照。
SUMO结合分析
GST、GST-SUMO-1、GST-SUMO-2、GST-SUMO-1聚合物链和GST-SUMO-2聚合物链固定在谷胱甘肽-淀粉微球上（新泽西州皮斯卡塔韦GE Healthcare）。结合前后的SDS-PAGE验证了蛋白质负载量和稳定性相等（未显示）。野生型和SIM突变体CENP-E尾结构域在兔网织红细胞裂解液中转录和翻译[35S] 蛋氨酸，根据制造商的方案（威斯康星州麦迪逊市Promega）。将翻译的蛋白质与含有固定化蛋白质的珠在结合缓冲液（75 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.05%吐温20）中培养1小时，然后用结合缓冲液将珠洗涤5倍。结合蛋白用SDS样品缓冲液洗脱，并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。使用富士FLA-7000图像阅读器（富士生命科学，斯坦福，CT）定量野生型和SIM突变蛋白的相对SUMO结合活性。
在37℃下，在20µl反应中进行2小时的SUMO聚合物链合成，该反应包含1.0µg Aos1/Uba2、0.8µg Ubc9、1 mM ATP、40 U/ml肌酸激酶、10 mM磷酸肌酸、1.2µg/ml无机焦磷酸酶、20 mM HEPES-KOH（pH 7.3）、110 mM醋酸钾、2 mM醋酸镁、1 mM-DTT和1 mM EGTA。反应包含1.0µg GST-SUMO-1和2.0µg SUMO-1，或1.0µgGST-SUMO-2和2.0μg SUMO-2。
