美国国家科学院院刊。1997年10月14日；94(21): 11345–11350.
Akt蛋白激酶介素3依赖性生存
*麻省理工学院生物系，马萨诸塞州剑桥市68-380，邮编02139；†马萨诸塞州波士顿Louis Pasteur大道77号哈佛医学院Beth Israel医院和细胞生物学系信号转导科，邮编02115；和§加拿大蒙特利尔PQ H3A 2B4蒙特利尔3801大学麦吉尔大学蒙特利尔神经病学研究所神经病学和神经外科
David Baltimore撰稿
摘要
已知造血细胞的白细胞介素3（IL-3）依赖性生存依赖于多种信号通路的活性，包括导致磷脂酰肌醇3-激酶（PI 3-激酶）激活的途径，而蛋白激酶Akt是PI 3-激酶的直接靶点。我们发现Akt激酶活性由细胞因子IL-3快速诱导，这表明Akt在造血细胞中的PI3-激酶依赖信号传导中发挥作用。Akt显性阴性突变体特异性阻断IL-3激活Akt，干扰IL-3依赖性增殖。Akt或致癌v-Akt的过度表达可保护32D细胞免受IL-3戒断诱导的凋亡。Akt显性阴性突变体的表达加速了IL-3戒断后的细胞凋亡，表明细胞因子IL-3介导的细胞生存需要功能性Akt信号通路。因此，Akt似乎是该系统中抗凋亡信号的重要介导者。
未成熟骨髓祖细胞的发育受增殖和凋亡之间的微妙平衡控制，并受细胞因子的可用性控制体内（有关审查，请参阅参考。1). 许多细胞因子不仅刺激细胞生长，而且是细胞生存所必需的。因此，明确细胞内细胞因子功能的确切机制对于理解造血至关重要（综述见参考文献。1).
细胞因子白细胞介素3（IL-3）和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）通过一个共同的信号亚单位βc受体发挥其生存和增殖功能(2). 通过IL-3和GM-CSF调节存活的信号转导事件部分由细胞溶质酪氨酸激酶（即Lyn）和随后的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活介导(2–6). 足以维持IL-3和GM-CSF依赖生存的βc受体区域诱导MAPK激活(2,三). 在缺乏IL-3的情况下，IL-3依赖性祖细胞迅速发生凋亡，但Bcl-2的表达可以支持IL-3退出后的生存(7,8).
IL-3和GM-CSF激活的另一个信号分子是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-激酶）(4,9,10). PI 3-激酶与几种细胞类型的存活调节有关（综述见参考文献。11). PI3-激酶也与IL-3依赖性生存有关，βc受体上对IL-3/GM-CSF依赖性生存重要的区域对于PI3-激酶的激活是必要的(2). 此外，刺激PI 3-激酶活性的Ras激活突变体(12)能够补充对GM-CSF反应中生存缺陷的突变βc受体(2). 最近已确定PI 3-激酶的几个下游靶点，包括p70核糖体蛋白S6激酶(13)，几种蛋白激酶C亚型（综述见参考文献。14)，和丝氨酸/苏氨酸激酶Akt(15–17).
Akt（也称为Racα或PKBα），也通过其与蛋白激酶A和C的同源性进行鉴定，是v-阿克特致癌基因(18–20). PI3-激酶产物直接刺激Akt的蛋白激酶活性在体外(15,21,22). 在细胞中，Akt被刺激细胞中PI 3-激酶活性的因子激活，如凝血酶、血小板衍生生长因子和胰岛素（有关综述，请参阅参考文献。11). 在细胞应激条件下，Akt也通过不涉及PI 3-激酶的途径被激活(23). Akt的N末端调控域包含一个Pleckstrin同源域（PH），该域对Akt激活很重要（有关审查，请参阅参考文献。11). 磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸直接结合到Akt PH结构域以刺激Akt蛋白激酶活性(15,22,24). Akt的完全激活还需要丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化(25).
使用Akt和致癌v-Akt的过度表达实验，以及使用干扰其在细胞中功能的Akt突变体，强调了Akt在几个细胞系统中的重要性（有关综述，请参阅参考文献。11). Akt能够支持生存因子剥夺后初级小脑颗粒细胞的存活(26). 活化的Akt还能防止成纤维细胞和上皮细胞暴露于紫外线辐射后诱导的凋亡(27)，在c的条件表达式之后-myc公司在成纤维细胞系中(28,29)以及MDCK上皮细胞从其细胞外基质中分离后（失巢）(30). 然而，对Akt在造血细胞中的功能知之甚少，尽管-阿克特最初被鉴定为AKR小鼠T细胞淋巴瘤诱导逆转录病毒中的一个转导癌基因(31). 最近的一项研究检测了活化形式的Akt预防由表达IL-2受体的BAF/3细胞中IL-2的撤回引起的细胞死亡的能力(32).
在此，我们表明，细胞因子IL-3可以快速诱导Akt活性，IL-3对Akt的激活依赖于PI3-激酶的活性。我们的结果表明，Akt在IL-3依赖细胞的PI-3激酶信号传导中起着中心作用。在缺乏IL-3的情况下，Akt和v-Akt的表达显著阻止了IL-3依赖细胞的凋亡，表明Akt激酶在细胞生存中起着重要作用。此外，Akt显性阴性突变体的表达干扰了IL-3对Akt的激活并促进了细胞凋亡。我们未能观察到Akt过度表达细胞中Bcl-2表达的诱导。Akt在IL-3依赖细胞存活中的作用可以解释v-Akt在造血细胞中的转化潜能。
材料和方法
细胞系、表达构建和转染。
32D细胞保存在含有10%胎牛血清（FCS）和10%WEHI-3条件培养基的RPMI培养基1640中(33). 参考文献中描述了pSV中的人类Bcl-2。7先前描述了逆转录病毒载体pLXSN和pLXSN中的v-akt(34). 血凝素（HA）表位标记的HA-Akt、HA-Akt-（K179M）和HA-Akt/（PH）表达结构是通过从pJ3Ω转移预先存在的结构产生的(15,35)进入逆转录病毒载体pBabe(36). 通过用欣dIII和巴姆HI，钝化并插入斯纳通过钝端结扎获得pBabe的BI位点。所有构建体均通过序列分析进行验证。
通过转染32D细胞生成表达各种Akt结构的细胞。在2μg/ml嘌呤霉素（Sigma）中选择大量培养32D细胞。为了产生v-akt表达细胞，32D细胞要么用pLXSN中的v-akt电穿孔，要么感染逆转录病毒包装线BOSC-23中pLXSN中的v-akt瞬时表达产生的逆转录病毒(37). 在400μg/ml G418（GIBCO/BRL）中选择大规模培养v-akt表达细胞。
细胞增殖和存活分析。
细胞增殖由[三H] 如前所述的胸苷摄取(33). 通过使用台盼蓝排除法计数活细胞来确定细胞存活率(38). 简单地说，用含有10%FCS和抗生素的RPMI清洗携带对照载体的32D细胞和表达v-akt、HA-akt、HA-Akbt（K179M）、HA-Ak（PH）和/或Bcl-2的细胞，以去除IL-3。对于[三H] 胸腺嘧啶核苷摄取实验，1×10培养5细胞生长在不同浓度（0.01%至10%）的WEHI-3条件培养基的24孔板中。48小时后，1μCi[三H] 将胸腺嘧啶核苷添加到每个孔中6小时。通过液体闪烁计数估计合并的放射性。在生存分析中，IL-3缺失细胞以2×10的密度接种5每毫升含10%FCS的RPMI。为了确定DNA损伤试剂对细胞存活的影响，将不同浓度的足叶乙甙（Sigma）添加到含有10%FCS和WEHI-3条件培养基的RPMI培养基中。随后，通过台盼蓝排除法测定活细胞与死细胞的比率。
免疫印迹、免疫沉淀和免疫复合物激酶分析。
转染有对照载体和各种Akt结构的32D细胞培养物在含有10%FCS的RPMI中经过短暂洗涤后，IL-3被耗尽。细胞在相同的培养基中饥饿30分钟，然后转移到无血清的RPMI。在所示位置以100 nM添加Wortmanin（Sigma）。电池（5×106)30分钟后，在RPMI 1640培养基中用1–2 ng/ml重组IL-3（R&D Systems或PeproTech，Boston）刺激30分钟，并通过添加等量的2×Nonide P-40裂解缓冲液（40 mM Tris HCl，pH 8.0/274 mM NaCl/20%甘油/2%Nonide P40/2 mM苯甲基磺酰氯氟化物/4μg/ml抑肽酶/4μg/ml亮白素）进行裂解。使用Akt-CT抗体从细胞裂解物中免疫沉淀内源性Akt(15). 使用单克隆抗HA抗体（Boehringer）免疫沉淀HA-epitope标记的Akt构建物。Akt活性由在体外以组蛋白H2B为底物的激酶分析(15). 免疫复合物激酶检测通过12.5%交联SDS/PAGE显示，并印在硝酸纤维素上。在暴露于磷成像仪（Bio-Rad）和x射线胶片后，用抗Akt-CT探针探测印迹，以确保蛋白质载量相等。
为了观察转染HA-Akt[PH]的细胞中的Akt N末端，使用Akt-NT抗体进行免疫印迹(21). 为了检测MAPK的磷酸化状态，通过交联7.5%SDS/PAGE将全细胞裂解物溶解并转移到硝化纤维素膜上。使用抗ERK（Santa Cruz Biotechnology）进行免疫印迹。
结果
为了确定Akt是否参与IL-3依赖性生存途径，我们测试了髓系祖细胞系32D中的IL-3是否激活Akt。在32D细胞中添加IL-3后，免疫沉淀Akt对组蛋白H2B的活性在1分钟内增加了3倍（图。A类). 基于PI 3-激酶抑制剂沃特曼的抑制作用，IL-3对Akt的激活是PI 3-激酶依赖性的（图。A类). 为了进一步研究Akt的活化，我们建立了稳定的32D细胞系，表达HA标记的野生型Akt（HA-Akt）和激酶活性Akt，并在ATP结合位点[HA-Akt（K179M）]发生点突变(15). 两种蛋白质都得到了表达（图。B类). 根据抗HA免疫沉淀物中的组蛋白H2B激酶活性判断，32D细胞中的IL-3刺激HA-Akt的蛋白激酶活性约3-4倍，而不是HA-Akt（K179M）（图。B类). 因此，在IL-3刺激后观察到的组蛋白H2B激酶活性可以用HA标记的蛋白质来证明，并且需要活性位点，这意味着Akt的直接激活负责抗Akt免疫沉淀中的活性，而不是共同沉淀激酶负责。
Akt被IL-3激活，这取决于PI-3激酶的活性。(A类)如上所述，32D细胞缺乏IL-3，并用1 ng/ml IL-3刺激(材料和方法). 随后，通过使用抗Akt-CT的免疫沉淀物中的组蛋白H2B磷酸化测定Akt的激酶活性。在IL-3刺激前用100 nM沃特曼预处理的细胞的免疫沉淀物中也测定了Akt激酶活性。随后，用抗Akt-CT检测免疫沉淀物，以确保蛋白质载量相等。(B类)表达HA-Akt或HA-Akt（K179M）的32D细胞缺乏IL-3，并用2 ng/ml IL-3刺激不同时间。在刺激前后用单克隆抗HA免疫沉淀HA-Akt和HA-Akt（K179M）蛋白，并用在体外激酶。下部面板显示免疫沉淀物的抗Akt-CT免疫印迹。
激酶活性Akt可阻断冈田酸诱导的糖原合成酶激酶-3抑制(39). 此外，最近的研究结果表明，激酶活性Akt和缺乏激酶结构域的Akt突变体阻断小脑颗粒细胞的存活，表明这些突变体在Akt依赖性生存途径中的主要负作用(26). 为了测试Akt调节域的过度表达是否也会干扰内源性Akt的IL-3依赖性激活，我们测量了表达Akt N末端的细胞中内源性Akt的活性，其中包括PH域但缺少激酶域[HA-Akt（PH）]。在IL-3刺激后，对照细胞和表达HA-Akt（PH）的细胞被裂解，内源性Akt被免疫沉淀(15). HA-Akt（PH）的表达使饥饿细胞和用IL-3刺激的细胞中内源性Akt的活性降低到对照细胞中观察到的活性的20%以下（图。). 尽管对Akt活性的抑制并不完全，但我们的结果表明，HA-Akt（PH）通过降低其活性并阻断其被IL-3激活的能力，在Akt生存途径中起主导性阴性突变体的作用。为了测试HA-Akt（PH）信号传导阻滞是否对Akt特异，我们还测试了迁移率变化（图。)以及32D细胞中IL-3激活的MAPK活性（数据未显示）。与之前的研究一致，向饥饿的32D细胞中添加IL-3导致MAPK在5分钟内移动，表明这些激酶的激活（图。). IL-3对MAPK的激活不受HA-Akt（PH）表达的影响，表明HA-Akt-（PH）对Akt信号的抑制作用是Akt通路特有的。这一结果还表明，MAPK的IL-3依赖性激活不需要Akt。
IL-3对内源性Akt的激活被Akt N末端的表达所抑制。内源性Akt激酶活性由IL-3（1 ng/ml）刺激的32D细胞抗Akt-CT免疫沉淀物中的组蛋白H2B磷酸化测定。在单独转染pBabe载体的细胞以及转染pBabe中HA-Akt（PH）的细胞的免疫沉淀物中检测Akt活性。用抗Akt-CT和抗Akt-NT印迹全细胞裂解产物，分别测定Akt和Akt-N末端的表达。同时，在7.5%SDS/PAGE中电泳后，通过全细胞裂解物的抗Erk免疫印迹测定MAPK迁移率变化。
在表达不同形式Akt或致癌v-Akt的32D细胞中研究了Akt在IL-3依赖性生物反应中的作用。在低剂量而非高剂量的IL-3下，观察到与v-akt或HA-akt表达一致的IL-3依赖性DNA合成的持续促进（图。 A类和B类). 此外，Akt的显性阴性突变体在高IL-3和低IL-3下都抑制DNA合成（图。 A类和B类). 这些结果表明Akt可能参与增殖反应，尽管很难将增殖和存活分开。
表达Akt结构的细胞增殖。表达不同Akt结构的32D细胞在不同IL-3水平下的增殖用[三H] 胸腺嘧啶核苷摄取试验（参见材料和方法). 误差条表示四个实验的标准误差。(左侧) [三H] 在pLXSN中单独转染载体或v-akt的细胞中测定胸腺嘧啶核苷的摄取。(对) [三H] 在单独转染pBabe和pBabe中的HA-Akt或HA-Akt（K179M）的细胞中也测量了胸腺嘧啶核苷的摄取。
先前的研究表明，IL-3的退出可诱导IL-3依赖型32D细胞的凋亡(7). 将32D细胞转换为无IL-3的生长介质后，出现了以凋亡为特征的DNA梯状排列（数据未显示）。在IL-3诱导IL-3依赖细胞凋亡的情况下，用PI 3-激酶抑制剂LY294002处理细胞(10)提示PI3-激酶可能在IL-3依赖性细胞存活中发挥重要作用。为了测试Akt是否能介导生存，我们研究了表达各种Akt结构的细胞。大量培养的表达载体或v-akt的细胞缺乏IL-3，并使用台盼蓝染料排斥试验监测细胞存活5天以上(38). 对于表达载体对照的细胞，在16小时内发生大量凋亡（约50%死亡细胞），到72小时时，几乎所有细胞都死亡（图。A类). 人类Bcl-2的表达部分阻止了32D细胞的凋亡，与先前的研究一致(7). 组成性激活akt激酶致癌v-akt的表达(15)也部分阻断了细胞死亡，尽管效果不如Bcl-2。在IL-3退出24小时后，与35%的对照细胞相比，>50%的v-akt表达细胞存活（图。A类). 72小时时，99%的对照细胞死亡；相反，约20%的v-akt表达细胞在5天后仍能存活，表明v-akt具有显著的保护作用（数据未显示）。然而，该方案可能低估了v-akt的保护作用，因为使用了G418抗性细胞池，并且v-akt的蛋白质表达水平几乎比内源性akt低10倍（数据未显示）。
过度表达的Akt和致癌v-Akt可阻止IL-3戒断诱导的细胞凋亡。通过台盼蓝排除试验测定细胞的活力。给出了IL-3退出后不同时间存活细胞的百分比。(A类)仅用载体转染的对照细胞和表达Bcl-2或v-akt的细胞饥饿IL-3 24小时，然后检测台盼蓝排斥反应。误差条表示四个实验的标准误差。(B类)单独转染pBabe的细胞和表达HA-Akt、HA-Akt（PH）、HA-Akt（K179M）或Bcl-2的细胞在24小时内缺乏IL-3，随后通过台盼蓝染料排除试验进行分析。表达Bcl-2和野生型HA-Akt或激酶缺乏型HA-Akt（K179M）的细胞在IL-3耗竭24小时后的存活率也进行了评估。误差条表示三个实验的标准误差。
为了进一步检测Akt提高细胞存活率的能力，用pBabe载体或表达HA-Akt、HA-Akt（K179M）或HA-Akt-（PH）的构建物转染细胞池。HA-Akt的过度表达显著减弱了IL-3耗竭引起的细胞凋亡。在IL-3饥饿24小时时，60%以上的HA-Akt表达细胞仍然存活，但不到20%的对照细胞存活（图。B类). 此时Akt的保护水平接近Bcl-2表达的水平（图。B类). Akt显性阴性突变体加速了IL-3耗竭诱导的细胞死亡：表达HA-Akt（PH）的细胞不到8%，表达HA-Akt（K179M）的细胞只有1%在24小时后存活。因此，Akt既可以在没有IL-3的情况下介导细胞存活，又是IL-3介导生存所必需的。与组成性激活的v-Akt相比，Akt的存活功能是短暂的：在IL-3耗竭48小时时，95%表达HA-Akt的细胞也已死亡（数据未显示）。
因为Akt和Bcl-2都能保护32D细胞免受凋亡，我们测试了Akt-和Bcl-2-介导的生存途径是否重叠。首先，我们研究了Akt表达对Bcl-2依赖性细胞存活的影响。表达人Bcl-2和小鼠Akt的32D细胞是通过联合转染Bcl-2、HA-Akt或其突变体表达的构建物产生的。Bcl-2在所有细胞中的表达量相似（数据未显示）。在表达Bcl-2的细胞中，Akt及其突变体的表达以及IL-3对Akt和HA-Akt的激活不受影响（数据未显示）。然而，HA-Akt和Bcl-2的表达降低了32D细胞的存活率，并将其降低到仅表达HA-Akts后观察到的保护水平（图。B类). 显性阴性HA-Akt（K179M）对Bcl-2介导的存活率没有显著影响（图。B类).
Akt也可能通过减少DNA修复诱导的细胞凋亡发挥作用。为了测试v-akt是否能够保护32D细胞免受DNA损伤试剂诱导的凋亡，我们将对照细胞和表达Bcl-2或v-akt的细胞暴露在生长介质中的DNA损伤试剂足叶乙甙中16小时。研究表明，足叶乙甙通过抑制拓扑异构酶II诱导其他IL-3依赖细胞系（包括BAF/3细胞）凋亡(40). 用染料排除法测定的细胞死亡是由依托泊苷浓度的增加引起的，v-akt的表达有效地阻止了依托泊甙诱导的细胞凋亡（图。). Bcl-2在阻断依托泊苷诱导的凋亡方面更有效（图。).
v-akt保护细胞免受DNA损伤试剂足叶乙甙诱导的凋亡。将足叶乙甙添加到含IL-3的培养基中16小时后，估计存活细胞的百分比。误差条表示两个实验之间的差异。
讨论
Akt在多个信号系统中作为PI 3-激酶的下游靶点发挥作用：这包括激活来源于活化受体酪氨酸激酶的信号通路中的Akt(15,16,41)和G蛋白偶联受体系统，如凝血酶受体(21). 在这里，我们报道Akt被激活是细胞因子刺激细胞的结果，这与最近的研究一致(32). Akt的IL-3依赖性激活可能由PI3-激酶的激活介导，因为PI3-激酶抑制剂沃特曼（wortmannin）阻断了Akt对IL-3的激活。先前的研究表明，Akt的活性直接由与Akt PH结构域结合的PI 3-激酶产物调节(21,22,24). Akt的磷酸化对其活化很重要，主要的磷酸化位点苏氨酸308和丝氨酸473已被鉴定(25). 因此，Akt的IL-3依赖性激活可能由脂质结合和磷酸化事件控制。此外，32D细胞中的Akt信号通路可能与导致MAPK激活的通路不同，因为Akt的显性阴性突变体抑制内源性Akt激活而不阻断MAPK激活。
与PI-3激酶在几种不同的组织培养系统中是一种生存因子以及Akt是PI-3激酶的直接靶点一致（综述见参考文献。11)，我们在此证明Akt也能促进IL-3戒断后的生存。Akt及其致癌形式v-Akt的表达阻止了IL-3撤除引起的细胞凋亡（图。). 虽然Akt和v-Akt在IL-3饥饿后立即保护细胞免受凋亡方面同样有效，但只有v-Akt表现出长期抗凋亡作用（图。A类). 这种差异与两种分子活性的差异一致：细胞质Akt在PI 3-激酶和磷酸化的刺激下瞬时激活，而v-Akt通过定位于质膜而组成性激活(15). 我们使用显性和阴性形式的Akt进行的研究强调了Akt对细胞生存的重要性。显性负性HA-Akt（PH）和HA-Akt（K179M）的表达加速了32D细胞的凋亡（图。). 在IL-3存在的情况下，显性阴性Akt也部分抑制了IL-3依赖性增殖（图。). 最近，通过使用我们的一组显性-阴性突变体，Akt被证明对初级小脑神经元依赖IGF-1的存活至关重要(26). 这些数据与我们目前的调查结果吻合。结合其他近期工作(27–29,32)他们提示Akt具有一般的抗凋亡功能。因此，在PI-3激酶的各种靶点中，Akt可能是PI-3激酶生存功能的主要介导者。
我们的结果表明，Akt使用的细胞存活机制似乎与Bcl-2无关。Akt和Bcl-2未能协同保护细胞免受凋亡。此外，HA-Akt的过表达将Bcl-2介导的保护水平降低到单独表达HA-Akt后观察到的水平。更重要的是，Bcl-2显性阴性Akt的表达并没有影响Bcl-2依赖性生存。尽管这些结果并不排除Bcl-2或Akt下游的其他家族成员，但它们表明Akt在Bcl-2依赖性生存中不起作用。此外，我们未能观察到HA-Akt过度表达细胞中Bcl-2迁移模式的变化，这表明Bcl-2磷酸化（数据未显示），这对其抗凋亡功能很重要(42). 最近的一篇论文表明，Akt通过一种机制阻止IL-2退出后的细胞凋亡，该机制被认为会导致c-myc公司和Bcl-2(32). Bad，Bcl-2家族成员，在IL-3刺激后迅速磷酸化(43)，可通过与Bcl-2异二聚作用减弱Bcl-2活性（综述见参考文献。44和45). 研究Akt是否介导IL-3依赖性Bad磷酸化是一件有趣的事情。迄今为止，只有糖原合成酶激酶-3被确定为Akt的直接下游靶点(39)，糖原合成酶激酶-3是否通过磷酸化大肠腺瘤性息肉病基因产物APC调节细胞增殖的作用尚待确定(46)对Akt介导的生存很重要。
我们的数据表明，Akt可能作为PI3-激酶的下游效应器，在IL-3依赖细胞的存活中起着重要作用。因此，Akt与其他信号分子（如MAPK）的区别在于其快速激活（本报告），而与p70核糖体蛋白S6激酶的区别在于它在细胞生存中的作用(26,29). 致癌v-akt的表达也阻止了DNA损伤剂足叶乙甙诱导的细胞凋亡（图。). 这可能与那些以增强与Akt和v-Akt密切相关的人类原癌基因AKT2的表达为特征的人类癌症形式的治疗有关（蛋白质水平上的90%相似性）(47,48).
调节D3-磷酸化磷脂酰肌醇比率的磷酸酶的发现(49–54)进一步增加了对PI 3-激酶下游信号级联的理解的复杂性。最近的研究表明磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸5-磷酸酶SH2-含肌醇磷酸酶（SHIP）与活化的IL-3受体相关(55,56). 有趣的是，SHIP似乎抵消了PI3-激酶的保护功能(2)和Akt（本报告）通过诱导IL-3依赖性细胞系统中的凋亡来促进IL-3依赖的生存(57). 这可能是由于SHIP能够向IL-3依赖性信号复合物招募负调控分子。
致谢
我们感谢M.Boudreau、H.Chang、R.Friedrich、A.Kazlauskas、R.Khosravi-Far、G.Thomas和X.Yang对手稿的批判性阅读。这项工作得到了公共卫生服务拨款CA51962（D.B.）和GM41890（L.C.C.）以及加拿大国家癌症研究所（D.R.K.）的支持。Z.S.是欧文顿学院奖学金的获得者。T.F.F.是加拿大国家癌症研究所K.M.Hunter癌症研究奖学金的获得者，该奖学金由Terry Fox Run提供资金支持。
缩写
| 伊利诺伊州 | 白细胞介素 |
| PI 3-激酶 | 磷脂酰肌醇3-激酶 |
| GM-CSF公司 | 粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子 |
| MAPK公司 | 丝裂原活化蛋白激酶 |
| 酸碱度 | Pleckstrin同源结构域 |
| 未来作战系统 | 胎牛血清 |
| 哈 | 血凝素 |
参考文献
1汤普森C B。科学。1995;267:1456–1462.[公共医学][谷歌学者] 2Kinoshita T、Yokota T、Arai K-i、Miyajima A。EMBO J。1995年；14:266–275. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Corey S、Eguinoa A、Puyana-Theall K、Bolen J B、Cantley L、Mollinedo F、Jackson T R、Hawkins P T、Stephens L R。EMBO J。1993;12:2681–2690. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Anderson S M，Jorgensen B。免疫学杂志。1995;155:1660–1670.[公共医学][谷歌学者] 6Torigoe T、O’Connor R、Santoli D、Reed J C。鲜血。1992;80:617–624.[公共医学][谷歌学者] 7Nunez G、London L、Hockenbery D、Alexander M、McKern J P、Korsmeyer S J。免疫学杂志。1990年；144:3602–3610.[公共医学][谷歌学者] 8Vaux D L、Cory S、Adams J M。自然（伦敦）1988;335:440–442.[公共医学][谷歌学者] 9Gold M R、Duronio V、Saxena S P、Schrader J W、Aebersold R。生物化学杂志。1994;269：5403–5412。[公共医学][谷歌学者] 10Scheid M P、Lauener R W、Duronio V。生物化学J。1995;312:159–162. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Franke T F、Kaplan D R、Cantley L C。单元格。1997;88:435–437.[公共医学][谷歌学者] 12Rodriguez-Viciana P、Warne P H、Dhand R、Vanhaesebroeck B、Gout I、Fry M J、Waterfield M D、Downward J。自然（伦敦）1994;370:527–532.[公共医学][谷歌学者] 13Chung J、Grammer T C、Lemon K P、Kazlauska A、Blenis J。自然（伦敦）1994;370:71–75.[公共医学][谷歌学者] 14Carpenter C L，Cantley L C。当前操作细胞生物学。1996;8:153–158.[公共医学][谷歌学者] 15Franke T F、Yang S-I、Chan T O、Datta K、Kazlauskas A、Morrison D K、Kaplan D R、Tsichlis P N。单元格。1995;81：727–736。[公共医学][谷歌学者] 16汉堡包B M T，Coffer P J。自然（伦敦）1995;376:599–602.[公共医学][谷歌学者] 17Kohn A D、Takeuchi F、Roth R A。生物化学杂志。1996;271:21920–21926.[公共医学][谷歌学者] 18Bellacosa A、Franke T F、Gonzales-Portal M E、Datta K、Taguchi T、Gardner J、Cheng J Q、Testa J R、Tsichlis P N。致癌物。1993;8:745–754.[公共医学][谷歌学者] 19Coffer P J，Woodgett J R。欧洲生物化学杂志。1991;201：475–481。[公共医学][谷歌学者] 20Jones P F、Jakubowicz T、Pitossi F J、Maurer F、Hemmings B A。美国国家科学院程序。1991;88:4171–4175. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Franke T F、Kaplan D R、Cantley L C、Toker A。科学。1997;275:665–668.[公共医学][谷歌学者] 22Klippel A、Kavanaugh W M、Pot D、Williams L T。摩尔细胞生物学。1997;17:338–344. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Konishi H、Matsuzaki H、Tanaka M、Ono Y、Tokunaga C、Kuroda S I、Kikkawa U。美国国家科学院程序。1996;93:7639–7643. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Frech M、Andjelkovic M、Ingley E、Reddy K K、Falck J R、Hemmings B A。生物化学杂志。1997;272:8474–8481.[公共医学][谷歌学者] 25Alessi D R、Andjelkovic M、Caudwell B、Cron P、Morrice N、Cohen P、Hemmings B A。EMBO J。1996;15:6541–6551. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Dudek H、Datta S R、Franke T F、Birnbaum M J、Yao R、Cooper G M、Segal R A、Kaplan D R、Greenberg M E。科学。1997;275:661–665.[公共医学][谷歌学者] 27Kulik G、Klippel A、Weber M J。摩尔细胞生物学。1997;17:1595–1606. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Kennedy S G、Wagner A J、Conzen S D、Jordan J、Bellacosa A、Tsichlis P N、Hay N。基因发育。1997;11:701–713.[公共医学][谷歌学者] 29考夫曼·泽赫（Kauffmann-Zeh A）、罗德里格斯·维奇亚纳（Rodriguez-Viciana P）、乌尔里奇（Ulrich E）、吉尔伯特（Gilbert C）、科弗（Coffer P）、唐沃德（Downward J）、埃文（Evan G）。自然（伦敦）1997;385:544–548.[公共医学][谷歌学者] 30Khwaja A、Rodriguez-Viciana P、Wennström S、Warne P H、Downward J。EMBO J。1997;16:2783–2793. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Staal S P、Hartley J W、Rowe W P。美国国家科学院程序。1977;74:3065–3067. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Ahmed N N、Grimes H L、Bellacosa A、Chan T O、Tsichlis P N。美国国家科学院程序。1997;94:3627–3632. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Koyasu S、Nakauchi H、Kitamura K、Yonehara S、Okumura K，Tada T、Yahara I。免疫学杂志。1985;134:3130–3136.[公共医学][谷歌学者] 34Ahmed N N、Franke T F、Bellacosa A、Datta K、Gonzales-Portal M-E、Taguchi T、Testa J R、Tsichlis P N。致癌物。1993;8:1957–1963.[公共医学][谷歌学者] 35Datta K、Franke T F、Chan T O、Makris A、Tang S-I、Kaplan D R、Morrison D K、Golemis E A、Tsichlis P N。摩尔细胞生物学。1995;15:2304–2310. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Pear W S、Nolan G P、Scott M L、Baltimore D。美国国家科学院程序。1993;90:8392–8396. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Cross D A E、Alessi D R、Cohen P、Andjelkovic M、Hemmings B A。自然（伦敦）1995;378:785–789.[公共医学][谷歌学者] 40Collins M K、Marvel J、Malde P、Lopez-Rivas A。《实验医学杂志》。1992;176:1043–1051. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42Ito T、Deng X、Carr B、May W S。生物化学杂志。1997;272:11671–11673.[公共医学][谷歌学者] 43查J、原田H、杨E、赛马J、科尔斯迈耶S J。单元格。1996;87:619–628.[公共医学][谷歌学者] 44戈尔斯坦P。科学。1997;275:1081–1082.[公共医学][谷歌学者] 45加耶夫斯基T F，汤普森C B。单元格。1996;87：589–592。[公共医学][谷歌学者] 46佩菲尔·M。科学。1997;272:974–975.[公共医学][谷歌学者] 47Bellacosa A、de Feo D、Godwin A K、Bell D W、Cheng J Q、Altomare D A、Wan M、Dubeau L、Scambia G、Masciullo V、Ferrandina G、Benedetti Panici P、Mancuso S、Neri G、Testa J R。国际癌症杂志。1995;64:280–285.[公共医学][谷歌学者] 48Cheng J Q、Godwin A K、Bellacosa A、Taguchi T、Franke T F、Hamilton T C、Tsichlis P N、Testa J R。美国国家科学院程序。1992;89:9267–9271. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 49Damen J E、Liu L、Rosten P、Humphries R K、Jefferson A B、Majerus P W、Krystal G。美国国家科学院程序。1996;93:1689–1693. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 50Guilherme A、Klarlund J K、Krystal G、Czech M P。生物化学杂志。1996;271:29533–29536.[公共医学][谷歌学者] 51Jackson S P、Schoenwaelder S M、Matzaris M、Brown S、Mitchell C A。EMBO J。1995;14:4490–4500. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 52Kavanaugh W M、Pot D A、Chin S M、Deuter-Reinhard M、Jefferson A B、Norris F A、Masiarz F R、Cousens L S、Majerus P W、Williams L T。当前生物量。1996;6：438–445。[公共医学][谷歌学者] 53McPherson P S、Garcia E P、Slepnev V I、David C、Zhang X、Grabs D、Sossin W S、Bauerfeind R、Nemoto Y、De Camilli P。自然（伦敦）1996;379：353–357。[公共医学][谷歌学者] 54Woscholski R，Waterfield M D，Parker P J。生物化学杂志。1995;270:31001–31007.[公共医学][谷歌学者] 55Liu L、Damen J E、Ware M D、Krystal G。生物化学杂志。1997;272:10998–11001.[公共医学][谷歌学者] 56Liu L、Jefferson A B、Zhang X、Norris F A、Majerus P W、Krystal G。生物化学杂志。1996;271:29729–29733.[公共医学][谷歌学者] 57Liu L、Damen J E、Hughes M R、Babic I、Jirik F R、Krystal G。生物化学杂志。1997;272:8983–8988.[公共医学][谷歌学者] 
