常染色体显性多囊肾病(ADPKD)的特征是肾小管逐渐被囊肿替代,这导致大约50%的患者在生命的第六个十年内患上终末期肾病1一个具有重要临床意义的尚未回答的问题是,囊肿的发生是一个贯穿个体一生的持续过程,还是仅限于发育和儿童早期的快速生长期。一个相关的问题是PKD1系列是维持成人肾脏肾小管结构所必需的。为了解决这些问题,我们归纳了第1页纯合子对一种丝线菌的灭活作用第1页等位基因三在不同的时间点。出生后第2天(P2),即小鼠皮质肾发生持续的时间,失活导致2周内肾脏明显增大,呈均质囊性(). 皮质边缘缺乏未成熟或发育不良的成分,表明第1页在肾发生过程中,不需要进行最初的命运决定,这与之前对纯合生殖系小鼠的研究一致第1页突变4使用肾单位节段特异性标记物,我们发现囊肿起源于所有肾小管节段(和补充图1a在线)。
失活时间决定肾脏对后天性第1页损失。(一)早期灭活第1页结果肾囊性疾病进展迅速。图示为P19肾脏第1页秒/秒; 他莫昔芬核心+和第1页秒/秒; 他莫昔芬核心−小鼠,其中第1页在P2被灭活。最左边是Cre粗略检查的比较+(左)和Cre−(右)肾脏。P19囊性肾的中间、H&E染色显示所有肾单位的囊性受累。最右侧,P19囊性肾,用近端小管(LTL,绿色)、远端小管(DBA,红色)和细胞核(DAPI,蓝色)标记物染色,显示两种类型的小管都是囊性的。共享特定标记物染色的囊肿在大小上似乎是均匀的,与它们通常的起始时间一致。比例尺,2 mm(左侧和中间);100µm(右侧)。(b、 c(c))成人失活导致迟发性肾囊性疾病。所示为3个月收获肾脏的H&E染色(b)或6个月(c(c))之后第1页6周龄时诱导失活第1页秒/秒; 他莫昔芬核心+老鼠。比例尺,2 mm(左);100µm(右侧)。(d日)诱导3个月后采集的肾脏DNA的Southern印迹分析第1页6周龄失活第1页秒/秒; 他莫昔芬核心+老鼠(第2和第4车道)和第1页秒/秒; 三苯氧胺Cre−老鼠(通道1和3)。这个生态RI 2.2千碱基(kb)带是由Cre介导的缺失产生的新片段三. (e、 (f))胆囊肾的LTL(绿色)和DBA(红色)染色第1页秒/秒; 他莫昔芬核心+老鼠(e(电子))和Ki-67染色的肾脏切片第1页秒/秒; 他莫昔芬核心+(左)和第1页秒/秒; 他莫昔芬核心−鼠标(右)((f))6周龄小鼠Cre诱导后6个月。标尺,50µm(e(电子)); 100微米((f)).
接下来我们确定第1页在6周龄的小鼠中,成人肾脏的失活足以引起囊性疾病(). 与P2失活的结果相反,我们发现这些小鼠的肾脏在失活3个月后第1页尽管我们已经取得了第1页灭活效率>50%(). 然而,在失活6个月后,肾脏出现了严重的囊肿,囊肿来自所有肾单位(和补充图1b). 值得注意的是,在年龄匹配的正常对照样品中,囊性上皮细胞的增殖率(Ki-67染色测量)似乎略高于肾小管上皮细胞的增生率,但差异不显著,可能是因为样本量相对较小(和). 假设年轻和成年小鼠之间的生长速度差异可能是我们观察的原因,我们确定了第1页青春期小鼠(~3周龄)失活。我们实现了第1页该年龄段小鼠的失活情况与成年人相似,我们也获得了与成年人相同的结果。在灭活约5个月后,接受治疗的小鼠肾脏才出现囊性变化(数据未显示)。这些结果证实了第1页基因对于维持成人组织中正常的肾小管结构是必不可少的,但值得注意的是,它揭示了早期与晚期疾病进展的差异第1页灭活。
表1
(a) 成人囊性肾与非囊性肾 |
---|
|
---|
诱导Cre+(囊性) | 诱发Cre−/未诱导(非结晶) |
---|
2.73% (3,414/124,967) | 1.62% (1,479/91,497) |
2.21% (2,224/100,741) | 2.56% (2,260/88,130) |
4.53% (15,318/337,963) | 1.26% (2,468/195,181) |
| 1.85% (2,743/148,276) |
| 1.87% (3,390/181,199) |
(b) Cre肾脏+和Cre−P12和P14诱导的小鼠 |
---|
|
---|
第12页Cre+ | 第12页Cre− | 第14页Cre+ | 第14页Cre− |
---|
2.75% (3,837/139,343) | 2.18% (3,129/143,341) | 2.67% (3,037/113,753) | 3.16% (3,687/116,544) |
1.79% (1,001/55,864) | 2.17% (2,054/94,480) | 2.75% (3,140/114,241) | 2.46% (3,104/126,138) |
2.91% (2,256/77,485) | 2.67% (3,126/117,041) | 3.97% (3,860/97,255) | |
| | 2.37% (2,974/125,411) | |
(c) 野生型幼鼠肾脏 |
---|
|
---|
第14页 | 第16页 | 第19页 |
---|
42.44% (23,996/54,543) | 8.6% (7,339/85,282) | 7.31% (7,119/97,393) |
38.79% (21,901/54,459) | 9.07% (6,260/69,010) | 7.52% (5,516/73,326) |
| 14.8% (8,799/59,396) | 9.87% (6,361/64,446) |
为了确定早期和晚期激活表型之间差异的关键时间间隔,并确定导致这些差异的因素,我们使用与P2诱导相同的方案在P2和P21之间的不同时间点诱导失活(补充表1在线)。全部诱发第1页秒/秒P12或更小的小鼠在3周内出现严重的囊性疾病,而所有对照小鼠在同一时间点均未出现囊性疾病(和数据未显示)。值得注意的是,在P14至P21岁诱导的小鼠,其肾脏在诱导3个月后的大体和显微镜检查显示正常(和未显示的数据),可重复出现晚发性囊性疾病(即在Cre诱导后6个月发病;未显示数据),与在晚年诱导Cre表达的小鼠中看到的相同(). 相反,在P14和P21之间诱导的小鼠的肝脏在早期和后期都是囊性的。P13诱导导致一种中间表型;所有小鼠均在3周内出现肾囊肿,但与P12诱导的小鼠相比,肾囊肿的数量可变且减少。
P12和P14之间对快速发病的囊性疾病的敏感性减弱。(一)肾脏第1页秒/秒; 他莫昔芬核心+P12诱导的小鼠在3周内呈囊性(左),而P14诱导的小鼠3个月后保持正常(右)。比例尺,2 mm(b)肾脏β-半乳糖苷酶染色罗斯26R小鼠在P12(左)和P14(右)诱导后5天,表明样品具有相似的Cre介导的诱导模式和诱导率。比例尺,2 mm(c(c))肾脏DNA的Southern印迹第1页秒/秒; 他莫昔芬核心+小鼠在P12和P14诱导后5天收获。(d日)Ki67标准截面第1页秒/秒; 他莫昔芬核心+(左)和第1页秒/秒; 他莫昔芬核心−(右)第12页诱导3周后的肾脏。比例尺,200µm。(e(电子))Ki67未导入的染色切片第1页秒/秒; 他莫昔芬核心−;罗斯26R+在第12页至第19页采集肾脏。未诱导的肾脏也获得了类似的结果第1页秒/秒; 他莫昔芬核心+;罗斯26R+小鼠(数据未显示)。比例尺,100µm。
在我们寻找不同时间响应的可能解释中第1页失活,我们排除了基于基因失活模式或频率差异的琐碎解释。为了证实我们灭活方案的有效性,我们检测了Cre重组酶介导的罗斯26R在P12和P14进行报告基因转基因,发现无论激活发生在P12还是P14,染色都是相似的(). 在P12和P14对Cre诱导小鼠肾脏样本进行的Southern blotting分析表明,我们获得了类似频率的第1页这两个年龄段的缺失(). 总之,这些研究确定了一个关键的两天间隔,确定了肾脏对第1页灭活。
细胞增殖和凋亡增加以前被描述为ADPKD发病机制中的主要过程5–7因此,我们对P7–P12诱导的窝鼠对照和囊性小鼠标本进行染色,以获取这些过程的标记物(Ki-67、磷酸化组蛋白-3和caspase-3)。与已发表的文献相反,我们发现对照组和囊性小鼠的细胞增殖率几乎没有差异(). 对照肾和囊性肾小管和囊肿内壁的上皮细胞Ki-67和磷酸组蛋白-3染色相似,但囊性样本中染色增强的小而广泛分散的区域除外(和补充图2a在线)。凋亡仅限于野生型肾脏的肾乳头,而囊性标本中也有少量髓质和皮质细胞发生凋亡(补充图2b). 然后我们检查了未诱导的P12–P19中增殖或凋亡率的差异第1页秒/秒小鼠可能解释了对第1页损失。我们发现Ki-67和磷酸化组蛋白-3在P12和P14样本中的表达相似,但与在P16和P19样本中观察到的表达显著不同(,和补充图3a在线),而caspase-3染色在所有时间点都相似(补充图3b).
为了解释P14–P16间隔期间肾脏增殖率突然整体下降的原因,我们对P11、P12、P14和P15对照小鼠的肾脏样本进行了微阵列分析。我们发现P11和P12或P14和P15之间差异表达的基因很少。相反,早期(P11和P12)和晚期(P14和P15)样本的表达模式有明显变化(和补充表2在线),包括827个基因,其表达在这两个阶段之间存在显著差异(P(P)< 0.001); 与P11的平均表达相比,其中51只在至少一只动物中增加≥100%,21只在至少1只动物中减少≥75%(补充表3在线)。按基因本体分类对结果进行分组8,我们发现大多数基因在生理过程中具有功能性作用,特别是在转运和催化活性中(补充表4在线)。生物信息学启动子分析顺式-元素显示富集至少一个参与肾脏发育的启动子(豌豆3;补充表5在线)9这些数据表明,在这个时间范围内,有一个重要的发展转换被激活。
肾脏增殖速率的突然制动点与基因表达的显著变化相似。(一)微阵列数据的多维标度分析(MDS)显示,样本分为两组,分别为P11+P12(P11和P12)和P14+P15(P14和P15)肾脏。(b)维恩图显示,与其他可能的组相比,P11+P12和P14+P15之间变化的基因子集要大得多(飞行数据记录器-调整后的P(P)< 1 × 10−3). (c(c))基因热图图(n个= 827,补充表2)P11+P12和P14+P15组之间的差异,表明两组之间存在明显的转换(黄色,P11的表达高于平均值;红色,P11表达低于平均值)。(d日)具有以下特征的基因在每个时间点的平均表达水平的折叠变化图飞行数据记录器-调整后的P(P)< 1 × 10−3与P11的平均表达相比,至少一个样本中的表达发生了两倍的变化(n个= 72,补充表3).
先前的研究已经令人信服地证明,细胞数量的增加必须解释人类ADPKD宏观囊肿表面积增加的原因10这种结果归因于肾囊性上皮细胞的高增殖率5,6,11,12,许多正在研究的治疗方法都是针对这个过程的5,13,14。我们的数据对该模型提出了挑战。使用两个独立的标记物和一个半自动系统对50张以上图像/标本中的大量细胞核进行计数,我们发现成人型囊性疾病标本的增殖率并不明显高于年龄匹配的对照肾标本。此外,我们发现正常P16肾脏的增殖率是成人肾脏的几倍,但其失活第1页在这个早期点,成年小鼠也出现了同样缓慢的PKD发作。这些结果表明,生长调节缺陷可能不是由失去第1页细胞增殖与囊肿形成之间可能存在间接关系。
我们的数据与之前发布的数据不同,有几个潜在的原因。首先,当大多数人类组织研究使用增殖核细胞抗原时,我们使用磷酸组蛋白-3和Ki-67作为增殖标记物。后者可能不太可靠,并可能导致对增殖率的过高估计15第二,抗体来源、样品制备和细胞计数方法的差异也可能是因素。还应注意的是,大多数对人体样本的研究都必须使用晚期材料,在这种材料中,慢性肾衰竭的副作用可能会叠加。后天性囊性疾病被认为是一种癌前病变,其增殖潜能增加。我们的研究无法解决的另一种可能性是,扩散实际上是以突发方式发生的,而不是以随机的方式发生的。如果囊肿中的增殖确实发生在周期性爆发中,那么之前的研究可能碰巧捕捉到了偶然发生增殖爆发的囊肿,而我们的研究则没有。最后,我们注意到,在长时间内保持的增殖率的微小增加可能是人类囊性肾逐渐增大的原因11然而,这一过程不太可能解释在我们的晚发模型中突然出现的囊肿形成。
早期囊性疾病的高增殖率与疾病进程有何联系?一种可能性是,高增殖率仅仅是器官发育状态的标志,而后者主要负责增强对第1页灭活。与此模型一致,P12到P14的基因表达谱的发育变化先于增殖率的变化,并且与快速和缓慢发病的囊性疾病之间的差异相关性更好。或者,扩散可以在适当的情况下起到促进剂的作用。最近的报告表明PKD可能是肾脏内平面极性异常的结果16,17在斑马鱼中,平面细胞极性信号在神经形成期间耦合细胞分裂和形态发生18经历增殖的成神经细胞暂时失去其平面定向,但随着子细胞重新融入神经上皮而重建。值得注意的是,细胞周期抑制剂的治疗挽救了缺乏Vangl2的斑马鱼的神经管缺陷,Vangl2是平面细胞极性信号传导的保守成分18我们推测肾上皮细胞在肾发育过程中可能经历类似的过程第1页多囊蛋白-1基因产物可能在细胞分裂后帮助细胞重新定向中发挥作用。该模型也有助于解释抗增殖剂在囊性疾病啮齿动物模型中的益处,即使在这些模型中增殖率没有升高。
通过证明第1页在成人组织中可能会导致肾囊肿,我们为观察到的人类一生中获得新囊肿提供了一种机制上的解释。与最近在其他ADPKD模型中报告的结果相反19,20,我们还发现所有肾单位片段都有相同的囊肿形成倾向,这与以前对人体样本的研究结果一致11,21–23总之,这些数据表明来自近端小管的囊肿可能占囊肿总负荷的很大一部分。这可能对任何活动仅限于来自远端肾单位的囊肿的治疗有意义19.
我们还发现肾上皮对后天性肾功能丧失的反应第1页由器官的发育状态决定。这些数据表明第1页这可能解释了早期严重ADPKD患者亚群的存在。与年龄较大的小鼠相比,非常年轻的小鼠对失活的反应显著不同,这也表明两组中的不同途径可能发生改变,这对潜在治疗的临床前测试具有重要意义。大多数已发表的PKD小鼠模型用于测试治疗方法,包括ADPKD的治疗方法,发病速度相对较快5,13,19鉴于成年期获得性疾病的进展速度差异很大,尚不清楚用于快速进展的方法在成年模型中是否同样有效。囊性疾病的逐渐发病和人类囊性疾病相对缓慢的进展表明,迟发模型,如本研究中确定的模型,可能更能预测人类疾病的适当治疗。
乍一看,肾脏的发育状态与其对药物作用的敏感性之间的关系第1页这种缺失似乎与囊肿形成的“成熟停滞”假说相一致24该模型表明,囊肿是发育过程受阻的结果,由于正常发育程序或细胞损伤后的再生程序受阻,囊肿将细胞锁定在未成熟状态。虽然我们的研究并不是为了测试这个假设,但我们注意到我们的数据中有几个方面似乎与模型不一致。例如,我们发现完全分化的成熟肾小管上皮在发育程序完成后很长时间内都会发生囊性变化。在这种情况下,囊肿不能是成熟阻滞的结果。虽然我们不能排除“去分化”对后天性第1页在囊肿形成之前,没有肾损伤的迹象,囊肿在整个器官突然同时形成。在出生后3周内形成囊肿的情况下,我们注意到,增殖率在囊性样本中正常下降,这似乎是不完全成熟状态的一个很好的标志。我们从这些数据中得出结论,肾细胞特别容易丧失第1页在发展的背景下,但我们没有数据表明他们在第1页灭活。为了更彻底地检验这个假设,还需要进行进一步的研究。
我们的数据还挑战了一个描述第1页基因产物作为肾上皮细胞初级纤毛上的流量传感器,作为维持小管形态的手段25在成人肾脏中。我们发现很难理解为什么改变一个高度动态的过程(如流动感应)需要几个月才能产生可观察的表型。我们的结论得到了最近一项研究的支持,该研究检查了两个致纤毛原基因在成年人中诱发的系统性丢失的后果(Tg737型和Kif3a型)26与我们观察到的情况类似第1页,作者发现囊肿形成的动力学取决于任一基因失活的时间。鉴于原发性纤毛被认为是负责肾脏动态流量传感的机械敏感细胞器,他们得出结论,成人肾脏流量传感的丧失可能不是晚发性囊性疾病囊肿形成的主要原因。然而,我们的研究和之前的研究都不能排除纤毛基血流感应在肾脏发育过程中的作用,因为纤毛基流感应在肾脏失活后形成囊肿的速度很快第1页,Tg737型和Kif3a型在未成熟的器官中。纤毛和第1页在发育中的肾脏可能不同于它们在成人器官中的各自功能,从而解释了囊肿丢失后形成的不同速率。我们也不能排除初级纤毛在成人器官中作为流量传感器的作用,如果纤毛信号在维持管状形态方面具有强直作用而不是动态作用。另一种可能性是第1页初级纤毛在建立和维持平面细胞极性方面很重要,而平面细胞的极性与随时间变化的机械感觉无关,但它们丢失的发育环境解释了不同的表型结果。需要进一步研究来区分这些可能性。
最后,这些研究还确定了一个以前未被认识的肾脏生长制动点,该制动点对应于基因表达的显著变化。普遍分布于肾脏的高增殖率在整个器官的~P15突然下降。这些观察结果表明,可能存在一个发育转换,标志着终末期肾成熟过程的结束。