参考（2）P黑腹果蝇哺乳动物p62的同源物是成人大脑中形成蛋白质聚集体所必需的

摘要

介绍

哺乳动物多泛素结合蛋白p62是一种多功能支架蛋白，具有多种细胞功能(Wooten等人，2006年; 有关审查，请参阅Moscat等人，2007年). 单身黑腹果蝇p62同源，不符合Sigma P(参考（2）P/CG10360)，最初在sigma病毒增殖修饰词的屏幕上进行表征(Carré-Mlouka等人，2007年)和具有相似功能的图案(Avila等人，2002年;Carré-Mlouka等人，2007年). 已证明参考（2）P与果蝇属非典型PKC并参与Toll信号通路(Avila等人，2002年;Goto等人，2003年).

含泛素的蛋白质聚集体是人类神经退行性疾病的最典型特征之一，小鼠模型表明，自噬对防止其积聚至关重要（综述见Rubinsztein，2006年). 已知哺乳动物p62蛋白与最常见的神经退行性疾病中发现的神经聚集物和包涵体密切相关(Zatloukal等人，2002年)并已证明能结合自噬蛋白Atg8/LC3，但其在聚集物形成和/或清除中的生理作用尚未阐明(Bjorkoy等人，2005年;Pankiv等人，2007年).

在本文中，我们提出D.黑腹果蝇p62同源参考（2）P是正常老化过程中形成的蛋白质聚集体的主要成分D.黑腹果蝇成人大脑。参考（2）P也是自噬缺陷的苍蝇、蛋白酶体功能受损的苍蝇和D.黑腹果蝇人类神经退行性疾病模型。重要的是，Ref（2）P的多重聚合（通过其Phox和Bem1p[PB1]域）和结合泛素化蛋白质（通过其泛素相关[UBA]域）的能力是在成人大脑中体内形成蛋白质聚集体所需的必要功能。

结果和讨论

Ref（2）P在大肠杆菌中的表达模式和定位D.黑腹果蝇组织未知。为了探讨Ref（2）P蛋白的亚细胞定位及其参与蛋白质聚集体的形成，我们使用免疫荧光共聚焦显微镜来确定其在成人中的表达模式D.黑腹果蝇神经元。在用抗ref（2）P和抗泛素抗体染色的年轻野生型成人大脑（2天大）中，在大脑的任何区域都未检测到ref（2(n个= 45;图1A). 相比之下，8周龄的苍蝇在成人大脑的神经膜和皮层区域都显示出大量的Ref（2）P-和泛素阳性结构(n个= 30;图1、B和C)主要在中脑和视叶的皮层区域检测到双阳性结构(图1，B–D). 这种染色模式与偶尔出现的自荧光结构不同，据报道，这些自荧光结构积聚在老年大脑中（图S1、A和B，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200711108/DC1). Western blot分析表明，老苍蝇的Ref（2）P蛋白水平高于幼苍蝇(图1 E). 此外，对洗涤剂分馏蛋白的西方分析表明，在老苍蝇中，Ref（2）P和不溶性泛素化蛋白有显著积累(图1 F). 为了进一步分析Ref（2）P阳性结构的性质，我们使用了电子显微镜和旧野生型超薄冰冻切片的免疫金标记D.黑腹果蝇成人大脑(n个= 5). 参考（2）P定位于直径从50 nm到1μm的电子致密物质中，这些物质是否被限制膜包围(图2，A–D). 偶尔，参考（2）P似乎参与了围绕聚集丝状物质的壳状结构(图2、E和F). 总的来说，这些数据表明，成人大脑中Ref（2）P蛋白的水平随着年龄的增长而增加，Ref（2P）是正常衰老过程中积累的蛋白质聚集体的一个组成部分D.黑腹果蝇大脑。

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图1。

参考文献（2）P在野生型苍蝇成年大脑中的定位和表达。（A） 一只年轻（2天大）野生型苍蝇成年大脑的共焦显微照片。Ref（2）P和泛素的阳性染色不明显。（B–D）一只老（8周龄）野生型苍蝇成年大脑的共焦显微照片。参考文献（2）P积累在蛋白质聚集体中，通常与泛素共定位（箭头）。C中的白色矩形表示D.（E和F）Western blot分析中显示的区域，该分析使用抗ref（2）P和抗泛素抗体探测野生型年轻和老年成虫头部的总细胞裂解物（E）和不溶性蛋白质部分（F。wt，野生型。棒材：（A–C）100μm；（D） 10微米。

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图2。

参考文献（2）P在正常老化期间定位于老苍蝇的蛋白质聚集体中。（A–D）古老野生型苍蝇成年大脑的电子显微照片。参考文献（2）P定位于直径从50 nm到1μm的电子致密结构中，这些结构被限制膜包围（箭头）或不包围（箭头方向）。（E和F）老苍蝇野生型大脑的电子显微照片表明，Ref（2）P在聚集的丝状物质周围形成贝壳状结构（箭头）。棒材：（A–C）50 nm；（D） 100纳米；（E和F）200纳米。

细胞质蛋白质通过自噬途径或更具选择性的泛素-蛋白酶体途径进行转化（有关综述，请参阅尤里米苏和克林斯基2005;Wooten等人，2006年). 在中枢神经系统因移除其中一种而出现自噬缺陷的小鼠中第5天或7，观察到含有泛素的聚集物(Hara等人，2006年;小松等人，2006年). 为了测试Ref（2）P是否参与自噬或蛋白酶体功能障碍时形成的蛋白质聚集体，我们从基因上破坏了这两条途径。因此，我们调查了含有P（P）-元素插入atg8a基因，P{SuPor-P}在g8a^{KG07569公司}.年轻成人大脑的免疫荧光制剂atg8a^{KG07569公司}变种苍蝇(n个=50）在成人大脑的所有区域中，Ref（2）P均呈显著阳性染色。参考（2）P定位于直径为0.5–2μm的聚集体中，其泛素染色阳性(图3，A和B). 用Western blotting检测年轻成人头部的裂解物，结果表明atg8a^{KG07569公司}与年轻野生型苍蝇相比，突变体积累Ref（2）P蛋白(图4C). 对这些聚集体的超微结构分析表明，它们没有被限制膜包围，它们含有类似于固位体形态的无定形颗粒物质。有趣的是，它们被电子密度很小的囊泡包围(图4，A和B). 此外，我们研究了D.黑腹果蝇年轻人的神经元克隆因atg1处自噬所必需的基因(Scott等人，2004年;2007). 年轻人的神经元突变体atg1处以细胞自主的方式特异性积累Ref（2）P-和泛素阳性结构(图4、E和F).

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图3。

参考文献（2）P定位于自噬或蛋白酶体功能受损的果蝇中的蛋白质聚集体。这些聚集体的形成在atg8a/ref（2）P双突变体苍蝇。（A和B）atg8a在成人大脑的所有区域，Ref（2）P和泛素染色呈显著阳性的突变体。如高倍放大的视叶（髓质区；B）所示，参考文献（2）观察到P-和泛素阳性聚集物（箭头所示）。（C） 正常表型在β2和625°C下的显性负温度敏感突变体。（D） 在β2和629°C下的突变体（箭头）。（E和F）双突变体atg8a和参考（2）P缺乏PB1（E）或UBA（F）结构域的功能丧失等位基因不会形成泛素化蛋白聚集体。泛素呈现细胞质染色模式（箭头）。基因型：（A和B）atg8a^{KG07569公司}/Y（Y），（C和D）elavGal4（elavGal）/+;UAS-β6/+;UAS-β2/+，（E）在g8a^{KG07569公司}/Y（Y）;参考（2）P^第二天/参考（2）P^第二天，和（F）atg8a^{KG07569公司}/Y（Y）;参考（2）P^第三天/参考（2）P^第三天.棒材：（A）100μm；（B–F）10μm。

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图4。

参考文献（2）P是自噬缺陷苍蝇中蛋白质聚集体的一种成分D.黑腹果蝇人类神经退行性疾病模型。（A和B）蛋白质聚集体atg8a^{KG07569公司}突变体表现出固位体形态，并对Ref（2）P（A）和泛素（B）进行了阳性标记。蛋白质聚集体被电子致密的小泡包围（箭头）。（C） 野生型和非野生型细胞裂解物的Western blot分析atg8a^{KG07569公司}年轻成人头部中Ref（2）P蛋白水平显著增加atg8a^{KG07569公司}苍蝇。（D，左）参考（2）P蛋白迁移曲线参考（2）P功能丧失等位基因。PB1结构域的Ref（2）P突变蛋白的表观分子质量为85 kD(参考（2）P^第二天/参考文献（2）^播客2)UBA结构域的Ref（2）P突变蛋白的表观分子质量为69 kD(参考（2）P^第三天/参考（2）^播客3). （D，右）对于atg8a和参考（2）P检测泛素。基因型：（1）atg8a^{KG07569公司}/Y（Y）;参考（2）P^第二天/青色, (2)在g8a^{KG07569公司}/Y（Y）;参考（2）P^第二天/参考（2）P^第二天, (3)atg8a^{KG07569公司}/Y（Y）;参考（2）P^第三天/青色、和（4）atg8a^{KG07569公司}/Y（Y）;参考（2）P^第三天/参考（2）P^od3型与相应的控制杂合子相比，双突变体的不溶性泛素化蛋白谱减少参考（2）P（E和F）神经细胞突变atg1处（绿色）累加Ref（2）P-（E）和泛素阳性（F）结构（箭头），而正常周围细胞未显示阳性染色。（G） 幼蝇视叶（髓质区）的共焦显微照片，表达了一种突变形式的人类τ蛋白，显示参考（2）P-和τ阳性聚集体（箭头）。基因型：（E和F）yw/UAS-CD8-GFP,hs-flp（高速燃油泵）;管Gal4/+;atg1处^Δ3D,FRT80/管Gal80,FRT80型、和（G）埃拉夫/+;无人机-E14/+棒：（A）500 nm；（B） 200纳米；（E） 2微米；（F） 5微米；（G） 10微米。

Pros26（DTS5）和Prosbeta2（DTS7）是D.黑腹果蝇蛋白酶体的β6和2亚单位(Neuburger等人，2006年). 使用上游激活器序列（UAS）/Gal4系统(布兰德和佩里蒙，1993年)，我们针对成人大脑中Pros26和Prosbeta2的表达，以引起蛋白酶体功能障碍。在25°C（允许温度）下，蛋白酶体功能完整，大脑形态正常(图3 C). 然而，在29°C（限制温度）下，主要在皮层观察到大量聚集物，这些聚集物对Ref（2）P和泛素呈阳性染色(n个= 20;图3 D). 此外，洗涤剂分馏蛋白的Western blot分析表明，29°C下蛋白酶体突变果蝇中Ref（2）P蛋白显著积累（图S1 C）。总的来说，这些数据表明，Ref（2）P定位于自噬缺陷的幼蝇和蛋白酶体功能基因失活的苍蝇的成年大脑中的蛋白质聚集体。

参考文献（2）P蛋白包含三个参与蛋白质-蛋白质相互作用的结构域：PB1、ZZ和UBA。N末端由参与多重聚合的PB1结构域（aa 6–88）组成。ZZ锌指结构域和UBA结构域分别位于aa 121和165以及aa 554和594之间(Carré-Mlouka等人，2007年). 为了解决Ref（2）P在聚集体形成中的作用，我们使用了两个功能缺失等位基因参考（2）P(Wyers等人，1995年). 这个参考（2）P^第二天失去功能的等位基因导致蛋白质缺乏PB1结构域，分子量为85 kD，而野生型蛋白质的分子量为100 kD(图4 D). 在参考（2）P^第三天功能丧失突变，该蛋白缺少UBA结构域，分子量为69 kD(图4 D). 这两个参考（2）P突变似乎对sigma病毒的繁殖能力和男性生育能力没有作用（纯合子男性不育；Wyers等人，1995年). 为了测试这两个功能丧失突变是否影响在没有自噬的情况下成人大脑中蛋白质聚集体的形成，我们决定测试功能丧失的作用参考（2）P突变体atg8a突变遗传背景。重要的是，年轻的双突变体为atg8a^{KG07569公司}和参考（2）P^第二天或atg8a^{KG07569公司}和参考（2）P^第三天与单核细胞相比，成人大脑的细胞皮层中没有蛋白质聚集atg8a^{KG07569公司}变种苍蝇(图3，E–F). 此外，泛素表现为细胞质染色(图3，E–F)双突变体大脑的分离和Western blot分析表明，与对照苍蝇相比，它们的不溶性泛素化蛋白谱减少(atg8a^{KG07569公司}/年;参考（2）P^{第二天或第三天}/青色;图4 D). 这与审查本手稿时发表的一篇论文一致，该论文报道p62的缺失抑制了小鼠自噬缺陷神经元和肝细胞中蛋白质聚集体的形成(Komatsu等人，2007年). 总的来说，这些数据表明一个功能性Ref（2）P蛋白对于体内泛素化蛋白聚集物的形成是必要的atg8a突变遗传背景。此外，它表明PB1和UBA结构域D.黑腹果蝇体内蛋白质聚集体的形成需要参考文献（2）P。

已知p62与最常见的神经退行性疾病中发现的蛋白质聚集体有关(Zatloukal等人，2002年). 为了测试Ref（2）P在神经聚集物形成过程中的功能保守性，我们检测了已知的D.黑腹果蝇人类神经退行性疾病模型(马什和汤普森，2006年). 突变的人类tau蛋白(Fulga等人，2007年)在整个D.黑腹果蝇使用全神经elav-Gal4驱动器的中枢神经系统（图S1 D）。对整个坐骑大脑的免疫荧光显微镜分析显示，成人大脑中存在与tau共定位的Ref（2）P阳性结构(图4 G). 这些数据表明，参考（2）P也可以是D.黑腹果蝇人类神经退行性疾病模型。

蛋白质聚集体的形成是许多神经退行性疾病的主要特征。其形成机制目前正在广泛研究中。在本文中，我们使用了D.黑腹果蝇以成人大脑为模型组织，研究蛋白质聚集体的形成，并表明参考（2）P、D.黑腹果蝇哺乳动物p62的同源物，是D.黑腹果蝇成人大脑。当蛋白酶体和自噬活性降低时，这些聚集物在正常老化过程中形成(Vernace等人，2007年;Simonsen等人，2008年). 这种减少可能导致老苍蝇的机动性降低和随后的死亡。参考（2）P也是自噬缺陷的苍蝇、蛋白酶体功能受损的苍蝇和D.黑腹果蝇人类神经退行性疾病模型。重要的是，Ref（2）P的PB1和UBA结构域对于蛋白质聚集体的形成都是必要的，这表明Ref（2）P的多聚化和结合泛素化蛋白质的能力都是体内形成蛋白质聚集体所需的必要功能。

材料和方法

补充材料

致谢

笔记

本文中使用的缩写：PB1、Phox和Bem1p；UAS，上游激活器序列；UBA，泛素相关。

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