美国国家科学院院刊。2008年3月25日；105(12): 4745–4750.
慢性缺氧期间PHD过度激活“脱敏”HIFα并保护细胞免受坏死
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阿曼丁·吉诺维斯
*法国尼斯安托万·拉卡萨涅中心尼斯大学UnitéMixte de Recherche 6543国立科学研究中心信号、发育生物学和癌症研究所，邮编06189；和
Karine伊尔克
*法国尼斯安托万·拉卡萨涅中心尼斯大学UnitéMixte de Recherche 6543国立科学研究中心信号、发育生物学和癌症研究所，邮编06189；和
努里亚·马西亚斯
†西班牙德里奥48160号比兹凯亚科技园生物科学合作研究中心801A号楼细胞生物学和干细胞室
雅克·鲍伊斯（Jacques Pouysségur）
*法国尼斯安托万·拉卡萨涅中心尼斯大学UnitéMixte de Recherche 6543国立科学研究中心信号、发育生物学和癌症研究所，邮编06189；和
埃德恩·贝拉
*法国尼斯安托万·拉卡萨涅中心尼斯大学UnitéMixte de Recherche 6543国立科学研究中心信号、发育生物学和癌症研究所，邮编06189；和
†西班牙德里奥48160号比兹凯亚科技园801A栋生物科学合作研究中心细胞生物学和干细胞部门
*法国尼斯安托万·拉卡萨涅中心尼斯大学UnitéMixte de Recherche 6543国立科学研究中心信号、发育生物学和癌症研究所，邮编06189；和
†西班牙德里奥48160号比兹凯亚科技园生物科学合作研究中心801A号楼细胞生物学和干细胞室
由英国伦敦大学萨尔瓦多·蒙卡达编辑，2008年2月8日批准
作者贡献：A.G.和E.B.设计的研究；A.G.、K.I.、N.M.和E.B.进行了研究；A.G.、J.P.和E.B.分析数据；A.G.和E.B.撰写了这篇论文。
摘要
细胞对氧（O）变化的适应2)可用性由O的两个子家族控制2-依赖酶：缺氧诱导因子（HIF）-脯氨酸和天冬酰胺羟化酶[脯氨酸羟化酶域（PHD）和抑制因子HIF（FIH）]。这些氧传感器调节HIF的活性，HIF是O2平衡。在氧合良好的细胞中，PHD使HIFα亚单位羟基化，从而将其作为蛋白酶体降解的靶点。相反，急性缺氧抑制PHD，导致HIFα稳定。然而，这里我们显示慢性缺氧诱导HIF1/2α“脱敏”在赛璐珞中和小鼠。基于这种普遍的适应机制，我们证明慢性缺氧不仅会增加PHD的数量，而且会过度激活三种PHD亚型。这种过度激活似乎是由细胞内O增加介导的2线粒体呼吸抑制导致的可用性。通过使用在赛璐珞中和体内siRNA，我们发现PHD是触发HIFα脱敏的关键酶，这是保护细胞免受坏死细胞死亡所需的反馈机制，从而使其适应慢性缺氧。因此，PHD作为双酶，其失活和随后的过度激活分别是细胞在急性或慢性缺氧中生存所必需的。
关键词：细胞存活，氧感应
转录复合物低氧诱导因子（HIF）在维持氧（O2)体内平衡对细胞生存至关重要(1). HIF在O中受到严格控制2-三种HIFα亚基之一（HIF1α、HIF2α和HIF3α）的羟化依赖方式(2,三). 在氧合良好的细胞（常氧）中，两个脯氨酸残基的羟基化（P402和P564在人HIF1α）中，HIF-脯氨酰羟化酶[prolyl羟化酶域（PHDs）]允许von Hippel-Lindau蛋白（pVHL）E3-连接酶复合物进行特异性识别和多泛素化，导致蛋白酶体降解(4). 此外，天冬酰胺残基（N803通过抑制HIF（FIH）的因子阻止辅激活子p300/CBP的结合，从而阻断HIF转录活性(5). 相反，限制O2可用性，通过放松HIFα羟基化，导致HIFα稳定和激活HIF转录复合物。与FIH一样，PHD属于铁和2-氧戊二酸依赖型双加氧酶的超级家族，通过使用O2作为共底物，为它们的O提供分子基础2-传感功能(6). 在哺乳动物细胞中，已鉴定出三种PHD亚型（PHD1、PHD2和PHD3），并显示为羟基化HIF1α在赛璐珞中取决于它们的相对丰度(7). 然而，我们报告PHD2具有主导作用，因为正是这种速率限制酶在常压氧下设定了HIF1α的低稳态水平(8).
根据我们之前的工作，我们试图寻找长期缺氧期间HIFα的调节。与急性缺氧相反，我们观察到慢性缺氧不能在迄今为止分析的任何细胞系统中积累HIF1α或HIF2α。HIFα蛋白因羟基化、泛素化和通过蛋白酶体的靶向性而降解，这表明在长期缺氧条件下，PHD仍然活跃。在这里，我们强调了慢性缺氧应激期间三种PHD亚型的意外过度激活。通过使用呼吸缺陷细胞系，我们发现慢性缺氧增强了O2博士可用性。由于缺氧也会增加PHD蛋白库，这两种事件都会导致PHD过度激活，从而降低我们在慢性缺氧时观察到的HIFα水平。此外，在长期缺氧的小鼠中也检测到PHD酶的过度激活，我们通过使用siRNA方法证实了它们对HIFα“脱敏”的贡献体内最后，与急性缺氧时细胞适应所需的快速HIFα稳定相比，我们发现慢性缺氧应激时HIFα脱敏对细胞生存至关重要。
结果
慢性缺氧期间HIFα蛋白下降。
我们之前的研究表明，在常压下，PHD2的沉默促进HIF1α的稳定。然而，其长期沉默不足以稳定HIF1α(8). 因此，我们试图确定慢性缺氧期间HIFα的调节。如所示一，1%O时缺氧24h后诱导HIF1和HIF2α蛋白积累，24h至7d后强烈脱敏（蛋白丢失）。我们观察到HIF1/2α脱敏仍发生在3%O2而在剧烈缺氧（0.1%O2;b条). 为了进一步分析长期诱导的HIFα脱敏是否与任何细胞环境有关，我们研究了一组人类细胞。首先，我们测试了永生细胞系，如CAL51（乳腺癌）、HT1080（纤维肉瘤）和LS174（结肠癌）。其次，我们评估了人皮肤成纤维细胞（NHFs）和人表皮角质形成细胞（NHKs）的原代培养。以类似于HeLa细胞（宫颈腺癌）的方式，在1%O时，HIFα蛋白水平从急性（4小时）降至慢性缺氧（3-7天）2在迄今为止测试的所有细胞系统中(c（c）和数据未显示）。
慢性缺氧时HIFα蛋白水平下降。细胞在缺氧条件下培养不同时间，并通过Western blotting分析HIF1α、HIF2α和β-肌动蛋白（负荷控制）的水平。(一)1%O下的HeLa细胞2. (b条)3%和0.1%O条件下的HeLa细胞2. (c（c）)1%O下的HT1080和NHF电池2.
慢性缺氧诱导HIFα蛋白降解依赖于羟化-pVHL-蛋白酶体途径。
由于HIFα蛋白的减少可能是由mRNA和/或蛋白稳定性的改变引起的，因此我们分析了急性或慢性缺氧细胞中HIFαmRNA的水平。如所示一HeLa细胞的mRNA水平在持续缺氧期间没有变化。因此，我们测试了蛋白质降解率的最终提高。通过蛋白质印迹分析，我们观察到蛋白酶体抑制在暴露于缺氧5天的细胞中诱导HIF1/2α蛋白的大量积累，就像在对照细胞中发生的那样（数据未显示）。基于真正的HIFα降解途径，我们测试了慢性缺氧期间pVHL是否是针对两种亚型进行降解的E3连接酶。我们将pVHL缺陷细胞系RCC4暴露在1%氧的缺氧条件下24小时至4天，寻找HIFα蛋白。在这些细胞中，HIFα水平从未下降，而在稳定克隆RCC4-pVHL（其中pVHL被重新引入的RCC4）中，在1%氧浓度下1天后HIFα显著下降2(b条). 最后，我们研究了HIFα蛋白羟基化作为允许pVHL结合的信号，并且我们观察到添加羟化酶抑制剂二甲基草酰甘氨酸（DMOG）可以恢复缺氧应激期间HIFα的积累(c（c）). 因此，HIF1α结构在两个脯氨酸残基（Pro402和专业564)慢性缺氧后保持稳定(d日). 因此，在慢性缺氧期间，HIFα水平下降是因为蛋白质不稳定性增加。事实上，HIFα蛋白似乎被羟基化、泛素化，并通过蛋白酶体靶向，这表明PHD在缺氧条件下仍然“活跃”。
慢性缺氧依赖羟化-pVHL-蛋白酶体途径促进HIFα蛋白降解。(一)1%O条件下HeLa细胞的缺氧动力学2用RT-PCR分析HIF-1α、HIF-2α和36B4 mRNA水平。(b条)RCC4细胞（pVHL缺乏）或稳定克隆RCC4-pVHL（过度表达pVHL）在常氧（20%O）下培养2)或缺氧（1%O2)在不同的时间段。(c（c）)HeLa细胞在常压（20%O）下培养2)或缺氧条件（1%O2)在裂解前4小时或5天以及4小时内，在有或无DMOG（1 mM）的条件下培养细胞。通过Western blotting分析HIF1α、HIF2α和β-肌动蛋白（负荷控制）的水平。(d日)293个细胞在常压氧（20%O2)或缺氧（1%O2)在不同时间段和裂解前48小时，用HIF1αWT或DM构建物转染细胞。使用Myc-tag抗体通过Western blotting分析HIF1α水平。
慢性缺氧过度激活三个PHD。
为了评估慢性缺氧期间PHD的活性，我们进行了在体外pVHL捕获分析。HeLa细胞暴露于1%O的缺氧条件下2持续4小时至7天。GST-HIF1α构建物与细胞裂解物孵育，然后与放射性标记的pVHL蛋白孵育。由于pVHL仅在相关脯氨酸残基先前被PHD羟基化时才与HIFα结合在体外-翻译的[35S] pVHL到GST-HIF1α被认为是PHD活性的可靠测量(a插图). 与常压相比，1%O在24小时内2，博士似乎过度活跃(一，车道3）。此外，从第1天到第7天，该测定强调了PHD的更强和渐进的激活(一). 重组GST-HIF1αP402A突变体构建物确实观察到了PHD激活，但P564A或P402/564A没有观察到，这意味着P564羟基化是绝对必要的，并且限制了HIF1α羟基化（数据未显示）。由于PHD活性可能由这些蛋白质库的增加引起，我们量化了缺氧上调的PHD2和PHD3亚型的水平。正如预期的那样，这两种蛋白质都是在缺氧条件下诱导的，但24小时后达到最大诱导值，随后几天蛋白质不再增加(b条). 这一结果强烈表明，除了PHD蛋白数量增加外，慢性缺氧也会过度激活这些酶。
慢性缺氧过度激活三个PHD。(一)显示1%O时HeLa细胞缺氧动力学期间PHD活性的放射自显影2. (插入) [35S] pVHL输入（I）和pVHL结合使用P402/564A突变体（DM）或WT GST-HIF1α结构。(b条)Western blot分析显示缺氧动力学期间PHD2和PHD3蛋白水平。(c（c）)为了评估每种PHD亚型的特异性贡献，在提取前48小时，用所示的siRNA转染细胞。通过Western blotting分析HIF1α、HIF2α和β-肌动蛋白的水平。
我们使用siRNA方法研究了每个PHD亚型对HIFα降解途径的特定贡献。在1%O的缺氧动力学期间2在两个不同的时间点（根据我们的PHD活性测定，在第1天和第3天），PHD亚型单独或联合无效。c（c）显示在第一天，与我们之前的工作一致(8)，只有PHD2消声导致HIF1α稳定（车道3）。对于HIF2α，除了PHD2，我们观察到PHD1的轻微贡献(c（c），车道2和3）。令人惊讶的是，在第3天，PHD2和PHD3沉默都挽救了HIFα蛋白的积累(c（c），车道3和4）。此外，PHD的协同作用表明，PHD1与其他亚型一起作用于HIFα调节(c（c），车道5、6和8）。我们的结论是，与常压缺氧相比，在慢性缺氧期间，三种PHD有助于HIFα降解。
慢性缺氧增加O2PHD的可用性。
黑根等。(9)表明NO和其他线粒体呼吸化学抑制剂阻止缺氧诱导的HIF1α稳定。事实上，因为线粒体呼吸泵送大部分细胞内O2，其抑制增加细胞内O2可利用性。此外，PDK1（丙酮酸脱氢酶激酶）是HIF1依赖的基因产物，最近被报道为缺氧时线粒体活性的天然抑制剂(10,11). 基于这些结果，因为我们观察到HIFα脱敏在剧烈缺氧条件下（0.1%氧自由基）不会发生2;b条)，我们假设慢性缺氧通过抑制线粒体活性增加细胞内O2可利用性。我们进一步决定使用GSK3细胞，一种呼吸缺陷细胞系(12). 事实上，我们假设在GSK3细胞中，O2由于线粒体抑制的组成性抑制，不能重新分布，我们可以防止PHDs的再激活，从而防止慢性缺氧诱导的HIFα脱敏。根据我们的假设，我们观察到，与对照细胞不同，在GSK3细胞中，急性缺氧后积累的HIF1α蛋白在慢性缺氧期间没有降解(). 因此，我们得出结论，慢性缺氧通过抑制线粒体呼吸，逐渐增加O2PHD的可用性，导致其过度激活，从而触发HIFα脱敏。
细胞内O2PHD过度激活需要重新分配。1%O时CCL39和GSK3细胞的缺氧动力学2如图所示。通过Western blotting分析HIF1α和β-肌动蛋白水平。
慢性低氧诱导的HIFα脱敏保护细胞免受坏死。
阐明细胞内O的生理相关性2慢性缺氧期间的再分布，我们将GSK3细胞暴露于急性或慢性1%O2低氧和通过测定透性（台盼蓝阳性）细胞的百分比来测量细胞死亡。如所示a左侧在慢性缺氧中，GSK3细胞（缺乏HIFα脱敏）与完全能降解HIFα的对照细胞相比，细胞死亡急剧增加。事实上，几乎100%的GSK3细胞在7天后死亡，这表明HIFα降解对细胞在慢性缺氧中的生存至关重要。
慢性低氧诱导的HIFα脱敏保护细胞免受坏死。在1%氧浓度下缺氧培养的细胞中测量细胞死亡2用台盼蓝掺入法测定不同时间。(一)CCL39和GSK3电池(左侧)或转染siRNA靶向三种PHD亚型或一个无关序列的HeLa细胞(赖特)5天，在常压（N）或缺氧条件下培养不同时间段（4小时、3天或5天）。(b条)GSK3细胞(左侧)和HeLa细胞转染一(赖特)其中HIFα表达被沉默。细胞缺氧孵育16小时后开始siHIFα转染，每天进行，直到实验结束第3天和第5天。在N和H（4小时）条件下，siHIFα在最后24小时内转染。
为了支持我们的假设并确认PHD的作用，我们在HeLa细胞中进行了缺氧动力学，并通过沉默PHD来强迫持续的HIF1/2α表达。正如我们所料，慢性缺氧期间PHD沉默介导的HIFα稳定导致大量细胞死亡(a右侧). 为了明确证明HIFα亚单位介导了这一过程，我们在慢性缺氧时同时将PHD和HIFα子单位（HIF1α和HIF2α）联合起来。有趣的是，HIFα亚单位的沉默完全阻断了PHD沉默介导的细胞死亡(b右侧). 当我们在慢性缺氧时沉默GSK3细胞中HIF1α的表达时，也得到了类似的结果(b左侧). 因此，我们得出结论，慢性低氧介导的PHD过度激活诱导的HIFα脱敏是防止细胞死亡所必需的。
为了描述这种细胞死亡，我们通过流式细胞术分析了亚G1碘化丙啶（PI）群体染色。我们测量了慢性缺氧后GSK3细胞或PHD无效细胞中凋亡细胞数量的轻微且无显著性增加(和数据未显示）。此外，Western blot分析显示，在慢性缺氧过程中，凋亡标记物聚ADP-核糖聚合酶（PARP）没有断裂，LC3脂质氧化也不参与自噬过程(和数据未显示）。综上所述，我们得出结论，在慢性缺氧期间，需要HIFα脱敏来防止细胞大规模死亡，这种死亡在很大程度上独立于凋亡和/或自噬途径。此外，作为一种反馈生存机制，慢性低氧诱导的PHD过度激活通过确保HIFα脱敏，使细胞免于坏死。
慢性低氧诱导的细胞死亡独立于凋亡和/或自噬途径。细胞在缺氧（1%O2)在不同的时间段。(一)流式细胞术测定亚G1CCL39和GSK3细胞中的PI阳性群体。(b条)通过GSK3提取物上的Western blotting分析PARP和LC3蛋白。Staurosporin（1μM）用作凋亡细胞死亡激活剂。营养保存细胞被用作自噬的阳性对照。
小鼠通过过度激活PHD来脱敏HIFα来适应慢性缺氧。
确认我们的结果体内，我们将小鼠暴露于8%O的缺氧环境中26小时（急性）和24小时（慢性）。肾脏HIF1α蛋白水平(一)然后用免疫组织化学方法分析小鼠的大脑和胸腺（数据未显示）。我们观察到缺氧6小时的小鼠组织中HIF1α增加，但24小时组没有增加。然而，当这些小鼠在更剧烈的缺氧（6%O2)，我们观察到HIF1α蛋白的重新积累(一). 因此，我们假设小鼠作为细胞，通过增加HIF1α降解速率来“适应”慢性缺氧。为了测试我们在小鼠组织中观察到的HIF1α脱敏是否由PHD过度激活引起，我们进行了pVHL捕获分析。b条表明缺氧6h后，PHD与对照组相比活性降低。然而，在慢性缺氧24小时后，检测显示羟化酶重新激活。此外，放射自显影显示pVHL结合较少，反映了额外和更严重缺氧暴露的小鼠中PHD活性的新降低（在6%O下2小时2). 这些结果表明HIF1α的表达与PHD活性的抑制之间存在着完美的相关性体内最后，为了证实PHD在这一机制中的意义，我们使用了siRNA方法体内在低氧暴露前向小鼠注射针对三个PHD或一个无关序列的siRNA，并分析HIF1α蛋白表达(c（c）). 正如之前在对照组中观察到的那样，在8%O的条件下24小时后，我们没有检测到HIF1α蛋白2在注射siRNAs沉默三种PHD亚型的小鼠中，我们观察到HIF1α蛋白与去铁胺（DFO）处理的动物相似，具有明显的稳定性(c（c）). 这些数据加强了我们的在赛璐珞中实验表明，在急性缺氧期间积累HIFα蛋白的小鼠也通过过度激活PHD来脱敏HIFα来适应慢性缺氧。
小鼠通过激活PHDs使HIFα脱敏来适应慢性缺氧。(一)BL6小鼠暴露于或不暴露于8%O的缺氧2持续6或24小时或达到8%O2+6%O下2小时2用免疫组织化学方法分析肾脏HIF-1α染色24 h。(b条)pVHL捕获试验是用暴露于下述实验条件下的小鼠脑提取物进行的一. (c（c）)BL6小鼠在暴露于8%O的缺氧条件下之前，注射靶向三种PHD亚型或一个无关序列的siRNAs 7天2对照组小鼠也注射DFO（1200 mg/kg）作为阳性对照。采用免疫组织化学方法检测肾脏HIF1α蛋白水平。
讨论
O之间的完美平衡2组织中的交付和需求（O2体内平衡）对生存至关重要。当O2平衡被破坏，有机体已经发展出适应机制来恢复平衡并摆脱危险。转录因子HIF是这些机制的核心，涉及多种生理病理过程，如癌症或缺血。
HIFα亚基受O的严密调控2.当O2受到限制，HIFα亚单位的高周转率允许其快速稳定和活化。然而，我们发现慢性低氧应激会降低HIFα蛋白的敏感性。我们的结果与之前的报告一致，即HIF1α蛋白随着缺氧时间延长而消失(13)并将此调控途径延伸至HIF2α。事实上，与之前的数据相比(14,15)，HIF2α的行为似乎与HIF1α的行为非常接近。此外，我们证明HIF1/2α在大范围O2级别和单元类型(以及未显示的数据），支持慢性缺氧期间HIFα脱敏是一种普遍的适应机制。
HIFαmRNA的分析没有显示急性或慢性缺氧的任何变化，排除了之前描述的反义HIF1α的可能贡献(16). 然而，正如Stiehl最近报道的那样，我们表明真正的羟基化-泛素化-蛋白酶体途径介导HIFα蛋白的减少等。(13). 此外，我们证明，尽管总体氧水平较低，但在慢性缺氧过程中，PHD会意外地逐渐过度激活2可用性(一). P（P）564仍然是第一个羟基化残基，脯氨酸的突变导致P的完全丧失402羟基化（数据未显示）。此外，siRNA实验表明，与常压相比，这三种PHD亚型有助于HIFα降解，从而有助于在慢性缺氧期间建立HIFα脱敏机制(c（c）). 然而，这些结果指出了每种PHD亚型对HIF1α和/或HIF2α亲和力的差异，这些差异需要进一步澄清。
PHD2和PHD3的积累至少可以部分解释PHD总活性的增加。然而，PHD2和PHD3分析显示，缺氧1天后，这些蛋白质库中的蛋白质没有额外增加(b条)，表明其他机制协同提供我们所证明的PHD逐渐过度激活。在这里，我们试图阐明潜在的调控途径。
除O外2，这些酶需要2-氧戊二酸和亚铁才能充分发挥活性(17,18). 杰拉尔德等。(19)表明ROS的产生通过干扰Fe（II）的可用性，可以调节PHD活性，从而调节HIFα的稳定性。因此，我们测量了整个缺氧动力学过程中的活性氧生成。然而，使用细胞渗透分子CM-H2DCFDA对活性氧生成进行量化并未显示任何变化（数据未显示）。
黑根等。(9)据报道，NO或化学抑制剂对线粒体呼吸的抑制导致细胞内O2再分布（使用Renilla荧光素酶测量）并防止缺氧诱导的HIF1α稳定。此外，他们还表明线粒体抑制对HIF1α在剧烈缺氧时的稳定性没有影响，正如我们在这里报道的HIF1/2α脱敏(b条). 最近，HIF-依赖性PDK1上调被证明可以介导细胞适应缺氧所需的代谢转换(10,11). 通过诱导该基因，丙酮酸进入三羧酸循环的次数减少，线粒体功能下调。正如帕潘德里欧优雅地证明的那样等。(11)，这种下调导致耗氧量下降，导致氧含量增加2低氧细胞毒素替拉帕明的有效性及其毒性降低(11). 我们推测，在细胞中，不能重新分配细胞内O2，我们可以防止慢性缺氧期间PHD过度激活和HIFα脱敏。我们通过分析呼吸缺陷细胞（GSK3）中HIF1α水平证实了我们的假设。事实上，正如我们推测的那样，在这个突变体中，由于基础的O2基于线粒体呼吸的构成性抑制，缺乏O2再分布完全阻止HIF1α脱敏。这些结果支持了线粒体抑制超出适应缺氧所需的代谢开关的观点。此外，这些数据最小化了PHD2和PHD3蛋白库在HIFα脱敏过程中增加的影响，至少在这个特定模型中是如此，并支持对额外激活机制的需要。
慢性低氧诱导的线粒体呼吸抑制导致O增加2即使在以下情况下，细胞内的可用性似乎很高，并导致PHD过度激活在体外实验揭示K（K）米接近大气O的三个PHD值2水平(20). 看来，在长时间缺氧后，氧含量甚至会轻微增加2可用性允许PHD脱离缺氧设定值。然而，我们没有观察到可比O2三种PHD之间的依赖性，因为PHD3似乎需要更长的暴露时间，这表明同种型特异性调节依赖于额外的辅因子来确保最佳的O2-传感特性。
评估控制HIF转录活性的FIH的状态也很有趣。正如我们为博士们展示的那样，我们可以推测FIH（即使它显示在体外降低K（K）米O的值2与PHD相比）将对慢性低氧诱导的O增加作出反应2并因此与PHD合作以减弱缺氧级联反应。
有趣的是，我们在这里表明，HIFα脱敏对于细胞在慢性缺氧条件下的生存是绝对必要的。事实上，HIFα脱敏细胞是活的，而当HIF1α在缺氧应激期间保持表达时，约100%的GSK3细胞死亡(). 缺氧最初几个小时内，HIF作为一种生存因子，随着缺氧时间的延长，它会成为一种致命因子在赛璐珞中和体内此外，我们发现，在慢性缺氧时，HIFα的强制表达诱导细胞死亡，这主要独立于凋亡和/或自噬途径。事实上，阻止HIFα脱敏会导致坏死导致大量细胞死亡。
总之，我们表明慢性缺氧期间PHD过度激活似乎是触发HIFα脱敏和保护细胞免受坏死细胞死亡的关键适应机制。因此，PHD是细胞生存的双酶。急性缺氧时，PHD失活通过确保HIFα稳定和HIF激活，确保O2平衡。慢性缺氧时，一旦适应机制建立，新的O2体内平衡建立，PHD过度激活，尽管O减少2可用性，保证生存。支持这些数据，我们显示体内小鼠通过抑制PHD适应急性缺氧，从而积累HIF1α，而在慢性缺氧期间，PHD过度激活，从而降解HIF1α。此外，PHD沉默或通过再次减少O来破坏既定平衡，确实会削弱HIF1α脱敏2可利用性。
坏死会导致细胞溶解和炎症。炎症反应刺激增殖和血管生成，但也促进免疫反应。因此，了解坏死如何有助于或相反地抑制肿瘤进展、伤口愈合或缺血性疾病，可能有助于深入了解PHD的适当使用，将其作为对缺氧相关疾病有吸引力的治疗策略。
方法
细胞培养。
赫拉、HT1080、NHF、LS174、CAL51、293、CCL39和GSK3(12)细胞在含有7.5%FBS的DMEM中生长。RCC4细胞和我们生成的稳定克隆RCC4+pVHL在含有10%FBS的DMAM/Ham的F10（1:1）培养基中生长。NHK细胞在添加有我-谷氨酰胺、重组EGF（0.2微克/毫升）和牛垂体提取物（30微克/毫克）。
缺氧条件是通过在“臭虫箱”厌氧工作站（Ruskin Technologies）中培养细胞来实现的。氧气浓度用含有5%二氧化碳和平衡氮的气体混合物固定。对于缺氧动力学，细胞在裂解前3天稀疏分裂（实验结束时达到60%的汇合），根据时间在臭虫箱内外，每天更换细胞培养基。细胞提取在臭虫箱中进行，以避免再次氧化。
按照说明进行转染(8). siRNAs购自Eurogentec。已报道无关siRNA和人类HIF1α和PHD的序列(8). 小鼠siPHD序列以相同区域为靶点。靶向HIF2α的siRNA序列（GenBank登录号。NM_001430号)对应于相对于起始密码子的1590-1609区。在Pro上突变的HIF1α表达载体402和专业564[HIF1α双突变体（DM）]是使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）通过突变产生的。
动物研究。
C57BL/6小鼠（8周龄雌性）在厌氧工作站中，在25°C的温度下，在提供混合气体的湿化空气（95%）中接受全身缺氧，使其能够通过逐渐降低氧浓度来适应缺氧环境2从20.9%到8%和92%N2在2小时30分钟的适应时间内，给小鼠随意提供食物和水。在siRNA实验中，通过jetPEI（Polyplus Transfection）每天向小鼠腹腔注射3μg siRNA，持续7天。动物研究方案是根据动物使用的机构指南进行的。每个实验条件使用三只小鼠，实验重复两次。老鼠在虫子盒子里被杀死了。一半的解剖器官被冷冻并储存在−80°C下（以测量PHDs活性），其余的固定在4%的甲醛中。
RT-PCR、Western Blotting和免疫组织化学。
用RNeasy Mini Kit（Qiagen）纯化RNA。RT-PCR的寡核苷酸序列可根据要求提供。
对于Western blot分析，细胞在Laemmli缓冲液中溶解。蛋白质浓度通过Lowry分析测定，50μg细胞提取物通过SDS/PAGE溶解，并电泳转移到PVDF（密理博）或硝化纤维素膜（Amersham Biosciences）上。使用Amersham Biosciences ECL系统显示免疫反应带。
如前所述进行HIF1α免疫组化(21). 免疫组织化学研究使用配备CoolSnap HQ冷却CCD相机（Roeper Scientifique）的徕卡蔡司倒置显微镜（Axiover 200 M，×40物镜）进行分析。
抗体。
已对抗HIF1α进行了表征(22). 在对人PHD2的前15个N-末端氨基酸进行免疫的兔子中培养PHD2抗体（抗血清923）。使用识别β-肌动蛋白（Sigma）、PHD3（Interchim和Novus Biologicals）、HIF2α（Novus biologicales）、Myc（9B11；细胞信号）、PARP（Biomol）和LC3（MBL）的抗体。
pVHL捕获分析。
通过将pcDNA3-HA-HIF1α质粒的0.714-kb BamHI/XmaI PCR片段（对应于人类HIF1α序列的1032-1746个核苷酸）亚克隆到PGEX-6P-3的BamHI/SmaI位点，获得GST-HIF1αWT。GST-HIF1αP402A、P564A和P402AP564A突变体是通过使用QuikChange Site-Directed Mutagenase Kit（Stratagene）诱变GST-HIFα构建物获得的。
pVHL是在体外-使用补充了Redivue的TNT转录/翻译工具包（Promega）进行翻译我- [35S] 蛋氨酸（Amersham Biosciences）生产[35S] pVHL。描述了用于细胞提取物制备和羟基化反应的方案(23). 值得注意的是，缺氧提取物的细胞裂解和羟基化试验是在昆虫箱中进行的。组织羟化试验也采用相同的程序。
细胞死亡与凋亡。
使用台盼蓝染色程序分析细胞死亡(24).
对于PI染色，用PBS洗涤总细胞颗粒一次，最后在冰冷的70%乙醇中固定。凋亡细胞的比例如前所述测定(25).
所有实验重复至少三次（小鼠研究除外），结果相似。显示了典型的免疫染色、斑点和放射自显影。
致谢。
我们感谢R.Buscá博士（尼斯大学医学院）提供NHK和NHF细胞并批判性阅读手稿，感谢A.O.Hueber博士及其团队在死亡实验中的帮助，感谢P.Lenormand博士和E.Vial博士的评论。财政支持来自国家科学研究中心、教育部、技术研究中心、国家癌症控制设备（标签设备）、普罗旺斯-阿尔佩斯-蓝色海岸癌症控制中心和癌症研究协会（3693号补助金）。E.B.由教育部Ciencia拨款SAF2007-64597、ETORTEK研究计划05-07和Bizkaia县Bizkaia-Xede计划提供支持。
脚注
作者声明没有利益冲突。
这篇文章是PNAS直接提交的。
工具书类
1塞门扎GL。当前操作基因开发。1998;8:588–594.[公共医学][谷歌学者] 2Ivan M、Kondo K、Yang H、Kim W、Valiando J、Oh M、Salic A、Asara JM、Lane WS、Kaelin WG.、。，年少者科学。2001;292:464–468.[公共医学][谷歌学者] 三。Jaakkola P、Mole DR、Tian YM、Wilson MI、Gielbert J、Gaskell SJ、Kriegsheim A、Hebestreit HF、Mukherji M、Schofield CJ等人。科学。2001;292:468–472.[公共医学][谷歌学者] 4.Maxwell PH、Wiesener MS、Chang GW、Clifford SC、Vaux EC、Cockman ME、Wykoff CC、Pugh CW、Maher ER、Ratcliffe PJ。自然。1999;399:271–275.[公共医学][谷歌学者] 5Lando D、Peet DJ、Gorman JJ、Whelan DA、Whitelaw ML、Bruick RK。基因发育。2002;16:1466–1471. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Berra E、Ginouves A、Pouyssegur J。EMBO代表。2006;7:41–45. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Appelhoff RJ、Tian YM、Raval RR、Turley H、Harris AL、Pugh CW、Ratcliffe PJ、Gleadle JM。生物化学杂志。2004;279:38458–38465.[公共医学][谷歌学者] 8贝拉·E、贝尼兹里·E、吉努夫斯·A、沃尔马·V、鲁克斯·D、普莱斯古尔·J。EMBO J。2003;22:4082–4090. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Hagen T、Taylor CT、Lam F、Moncada S。科学。2003;302:1975–1978.[公共医学][谷歌学者] 10Kim JW、Tchernyshyov I、Semenza GL、Dang CV。单元格元数据。2006;三:177–185.[公共医学][谷歌学者] 11Papandreou I、Cairns RA、Fontana L、Lim AL、Denko NC。单元格元数据。2006;三:187–197.[公共医学][谷歌学者] 12Pouyssegur J、Franchi A、Pages G。诺华发现交响乐。2001;240:186–196.讨论196–188。[公共医学][谷歌学者] 13Stiehl DP、Wirthner R、Koditz J、Spielmann P、Camenisch G、Wenger RH。生物化学杂志。2006;281:23482–23491.[公共医学][谷歌学者] 14Holmquist-Mengelbier L、Fredlund E、Lofstedt T、Noguera R、Navarro S、Nilsson H、Pietras A、Vallon-Christerson J、Borg A、Gradin K等。癌细胞。2006;10:413–423.[公共医学][谷歌学者] 15Uchida T、Rossignol F、Matthay MA、Mounier R、Couette S、Clottes E、Clerici C。生物化学杂志。2004;279:14871–14878.[公共医学][谷歌学者] 16加利福尼亚州Thrash-Bingham，Tartof KD。美国国家癌症研究所。1999;91:143–151.[公共医学][谷歌学者] 17.斯科菲尔德CJ，拉特克利夫PJ。Nat Rev摩尔细胞生物学。2004;5:343–354.[公共医学][谷歌学者] 18Schofield CJ、Zhang Z。当前操作结构生物。1999;9:722–731.[公共医学][谷歌学者] 19.Gerald D、Berra E、Frapart YM、Chan DA、Giaccia AJ、Mansuy D、Pouyssegur J、Yaniv M、Mechta-Grigoriou F。单元格。2004;118:781–794.[公共医学][谷歌学者] 20Tuckerman JR、Zhao Y、Hewitson KS、Tian YM、Pugh CW、Ratcliffe PJ、Mole DR。FEBS通讯。2004;576:145–150.[公共医学][谷歌学者] 21Trastour C、Benizri E、Ettore F、Ramaioli A、Chamorey E、Pouyssegur J、Berra E。国际癌症杂志。2007;120:1443–1450.[公共医学][谷歌学者] 22Richard DE、Berra E、Gottie E、Roux D、Pouyssegur J。生物化学杂志。1999;274:32631–32637.[公共医学][谷歌学者] 24Forcet C、Ye X、Granger L、Corset V、Shin H、Bredesen DE、Mehlen P。美国国家科学院程序。2001;98:3416–3421. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Cahuzac N、Baum W、Kirkin V、Conchonaud F、Wawrezinieck L、Marguet D、Janssen O、Zornig M、Hueber AO。鲜血。2006;107:2384–2391.[公共医学][谷歌学者] 
