《公共科学图书馆·综合》。2008; 3（4）：e2005。
Cre-Activated病毒基因表达对小鼠脑内特定神经元类型的高分辨标记和功能调控
Rachel O.L.Wong，编辑器
美国纽约州冷泉港冷泉港实验室
美利坚合众国华盛顿大学
构思并设计了实验：ZH SK。执行了实验：SK。分析了数据：SK.贡献的试剂/材料/分析工具：SK.撰写了论文：ZH SK。
收稿日期：2008年2月17日；2008年3月7日接受。
这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了适当的信任。
- 补充资料
图S1：STOP2提供条件表达式。（a） 注射AAV载体的Pv-cre小鼠的外荧光图像，该载体包含短Neo-2xpA STOP盒（LS2L）和人类RenillaGFP基因（AAV-LS2L-hrGFP，C.Saper的礼物）。（b–c）以3∶1的比例联合注射AAV-LS2L-hrGFP（b）和通用AAV-RFP（c）的野生型对照小鼠的共焦图像。（d） 注射AAV-LS2L-hrGFP的PV-cre小鼠新皮质篮子中间神经元中GFP和小白箭头的共定标（白色箭头）；标尺，20微米。最右侧，高分辨率的篮状细胞轴突图像，其在锥体细胞胞体（用NeuN免疫荧光标记）周围具有PV+中间神经元特征的“篮状”末端分支和突起（黄色箭头）；标尺，5微米。（3.73 MB畅通节能法）
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图S2：Pv-cre:：Z/EG小鼠中GFP的低水平表达。使用1秒曝光时间的年轻成年Pv-cre:：Z/EG小鼠的荧光图像（比)和一个压缩的查找表。使用与中相同的采集参数，单元格（箭头）不可见轴突和树突分支都不容易看到，尽管偶尔会注意到靠近胞体的树突分支主干（箭头所示）。比例尺，100微米。（0.45 MB畅通节能法）
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图S3：注射后60天。使用与中相同的参数和查找表注射AAV-LS1L-GFP的年轻成年Pv-cre小鼠的图像；标尺，100微米。（0.38百万TIF）
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电影S1：z系列堆栈，其中已被占用。（1.10 MB MOV）
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电影S2：z系列堆栈，从中已被占用。（4.61 MB MOV）
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电影S3：单元格的三维旋转如所示.（1.36 MB MOV）
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电影S4：z系列堆栈，从中已被占用。（1.65 MB MOV）
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摘要
我们描述了一种方法，该方法将Cre-rebusise-knockin小鼠和病毒介导的基因转移结合起来，对小鼠大脑中的特定神经元类型进行遗传标记和功能操作。我们在Cre/loxP重组介导的转录翻译STOP盒去除后，构建了表达GFP、dsRedExpress或通道视紫红质（ChR2）的腺相关病毒（AAV）。荧光标记足以显示体内具有突触分辨率的神经元结构，而ChR2的表达允许神经元放电的光激活。在一周的时间里，对一类特殊的新皮质神经元，即含有小白蛋白（Pv）的快速尖峰GABA能中间神经元的结构动力学进行了监测。我们发现，尽管大多数Pv轴突波顿在年轻人中是稳定的，但在7天内，轴突轴上的波顿增减率分别为10.10%和9.47%。我们的结果表明，Pv抑制回路维持了青春期后大脑皮层结构再布线的潜力。随着越来越多的Cre敲除小鼠的产生，并且由于病毒转染可以在特定的发育阶段传递到特定的大脑区域，该策略代表了一种通用方法，可以系统地可视化小鼠大脑中不同类型细胞的结构并操纵其功能。
介绍
神经回路由不同的细胞类型组成，越来越多的证据表明，每种细胞类型往往表现出刻板的连通性，并执行特殊的功能。因此，为了理解神经元回路的组织和操作，必须能够以高分辨率可视化不同细胞类型的结构和连通性，并精确地操纵特定细胞类型的功能。特别相关的是新皮质中的GABA能抑制回路。GABA能抑制在大脑皮层神经回路操作的各个方面都至关重要，并由不同类型的中间神经元细胞介导。因为不同的细胞类型高度混合，甚至相邻神经元的连接和功能也不同[1]–[3]传统的解剖和生理技术很难穿透这种异质性和复杂性。例如，越来越多的证据表明，GABA能突触在结构上受到感官体验和神经活动的影响[4]–[6]，可能导致神经电路的重大重构。然而，还没有研究对完整大脑中特定类别的皮层抑制神经元和突触的结构动力学进行检查。这种知识上的差距主要是由于皮层GABA能细胞类型的异质性和缺乏高分辨率标记方法。
遗传策略可以大大有助于研究GABA能回路和一般神经回路，因为它们利用了产生和维持神经系统细胞多样性的内在基因调节机制[7]因为不同的细胞类型通常表现出不同的基因表达谱[8]–[10]转录启动子提供了可视化和操纵不同细胞类型的遗传途径。利用细菌人工染色体（BAC）进行基因敲除和转基因；[11])是两种将外源基因引入由内源性基因表达定义的细胞类型的有用技术。特别是，Cre/loxP重组调节基因表达是系统标记和操作特定细胞类型的有效且强大的方法[12]这种二元基因表达策略涉及两种小鼠菌株的组合：一种是在特定细胞类型和/或大脑区域表达Cre重组酶的“驱动”菌株，另一种是能够在Cre/loxP重组时表达感兴趣基因的“指示”菌株。到目前为止，已经生成了越来越多的蜂窝型受限驱动线路[12]然而，该战略目前的实施存在三大不足。首先，任何一个基因的空间和时间表达模式可能不适合于在限制性发育阶段和大脑区域操纵细胞类型。其次，只有少数例外，敲除蛋白或BAC转基因引入的荧光标记的表达水平通常不足以标记精细的神经元结构，如神经元轴突和突触；可用指示线的表达水平低于体内高分辨率成像所需的数量级。第三，小鼠基因工程，尤其是涉及多个菌株时，既耗时又昂贵。
病毒介导的基因传递是标记和操纵哺乳动物大脑神经元的另一种有效策略。由于它们对单个神经元进行多拷贝转染，并使用强大且普遍存在的转录启动子，病毒介导的传递通常可以实现高水平的基因表达，从而对神经元突触等精细结构进行明亮的标记[13]–[15]此外，通过立体定向注射，病毒转染可以针对特定的脑区和发育阶段[16]此外，适用于纵向研究的神经营养病毒已经有了很好的特征，现在可以以低成本高效地进行工程[17]然而，病毒介导的基因递送的一个主要缺点是缺乏细胞类型特异性——目前没有将病毒介导的基因表达长期限制在特定细胞类型的通用策略。在这里，我们描述了一种结合Cre重组敲除小鼠和Cre激活的腺相关病毒载体以实现高水平、稳定和细胞型特异性基因表达的方法。该方法简单、高效，可对体内特定类别的突触进行长期实时成像，并可对神经元尖峰进行光激活。随着越来越多的Cre敲除蛋白和转基因株（Cre-drivers）的建立，该方法代表了系统可视化和操作体内特定细胞类型的一般策略。
使用这种方法标记一类特殊的抑制细胞，即新皮质小白蛋白（Pv）抑制性中间神经元，我们首次能够在体内对Pv抑制性轴突的精细轴突结构和动力学进行长期成像。我们发现，尽管大多数假定的Pv突触前神经束在年轻成年小鼠中是稳定的，但在7天内，轴突轴上的神经束增加和减少的比率分别为10.10%和9.47%。我们的结果表明，Pv抑制回路维持了青春期后大脑皮层结构再布线的潜力。
结果
Cre激活的腺相关病毒载体在新皮质中实现细胞型特异性和高水平基因表达
我们选择研究腺相关病毒（AAV），因为它被认为对神经元无害[18]–[21]易于设计。在这里，我们表明，一种通用血清型2/9 AAV-GFP病毒有效地转染了新皮质的神经元，并通过一个强大且普遍存在的CMV启动子驱动谷氨酸能锥体神经元和GABA能中间神经元中的绿色荧光蛋白（GFP）表达，对CMV公司(和数据未显示）。为了在Cre介导的重组后使GFP表达成为条件，我们在CMV启动子和GFP或红色荧光蛋白（RFP）cDNA之间添加了一个loxP-STOP-loxP（LSL）盒(). STOP是一个包含多聚腺苷化信号的转录和翻译停止盒。我们构建了两个不同版本的STOP（请参见方法详细信息）：Δβgeo-3xpA（S1)是β-半乳糖苷/新霉素STOP盒的缩写，包含3个多腺苷化位点，功能已被证明[22]和Neo-2xpA（S2)是一个新霉素cDNA，其后是2个多腺苷化位点。然后我们测试了这些“条件AAV”（AAV-LS1L-GFP；AAV-LS型2L-RFP）使用两个不同的Cre敲除驱动程序，即Pv-Cre小鼠，其在含有parvalbumin（Pv）的蛋白中表达Cre+)GABA能神经元[23]以及在前脑谷氨酸能神经元中表达cre的Emx-cre小鼠[24]两个版本的LSL都表现良好。
Cre激活的AAV载体在Cre敲除小鼠的大脑中提供细胞型特异性和高水平的基因表达。（a） 将一种通用的AAV-GFP病毒注射到Pv-cre小鼠的新皮质，非特异性标记神经元。金字塔可以通过粗大的顶端树突（黑色箭头）和突出的轴突（白色箭头）来识别。（b） 注射AAV-lox-STOP-lox（LS1五十） -GFP病毒进入Pv-cre小鼠的新皮质，特异性标记表达cre重组酶的神经元。示意图中STOP暗盒以灰色显示，详细描述见方法Δβgeo-3xpA，具有3个多腺苷化位点的改良β-半乳糖苷/新霉素STOP盒。（c） AAV-LS的注入2L-RFP病毒进入Pv-cre小鼠的新皮质，特异性标记表达cre-rewise的神经元。这里使用了一种不同版本的STOP盒，Neo-2xpA，一种具有2个聚腺苷酸位点的新霉素STOP盒。对CMV公司CMV启动子和β-珠蛋白内含子；比例尺，a–c为250µm。（d） 注射AAV-LS的PV-cre小鼠新皮质篮子中间神经元中GFP和小白箭头的共定标1L-GFP；标尺，20µm。最右侧的篮状细胞轴突高分辨率图像，具有PV+中间神经元特征的“篮状”终末分支和围绕锥体细胞体（用NeuN免疫荧光标记）的花束（黄色箭头）；比例尺，5µm。（e） 注射AAV-LS的Emx-cre-nlsLacZ小鼠新皮质锥体神经元GFP和LacZ的共定标1L-GFP；标尺，20µm。请注意，并非所有LacZ+锥体神经元GFP阳性。最右边，沿着锥体细胞顶端树突的棘（蓝色箭头）；比例尺，5µm。（f） Thy1-GFP小鼠体内GFP荧光强度归一化为GFP标记锥体体强度的量化；n＝每组15个细胞。Thy1-GFP和AAV标记的体细胞的强度范围都很大，只有最亮的细胞被选中进行这一特殊比较（参见方法详细信息）。Thy1-GFP:1+/-0.08；AAV-LS型1L-GFP:：Pv-cre:1.5+/-0.1；AAV-LS型1L-GFP：：Emx-cre 1.3+/-0.2）。所有AAV注射组织在1.5–3个月大的小鼠注射后12–15天固定。
在新皮质中，PV在一类显著的GABA能抑制中间神经元中表达，即篮状中间神经元，它快速突起并支配锥体神经元的胞体和近端树突。注射AAV-LS的Pv-cre小鼠的新皮质1L-GFP（单道注射，见方法GFP的表达几乎只限于PV+中间神经元(). 总体积1.46 mm三从4只动物中检测到97%的GFP表达神经元（n=416 GFP+神经元）也呈PV免疫阳性，表明具有高度的细胞类型特异性。在同一卷中，总计479 PV+神经元被鉴定出来，表明AAV-LS平均标记效率为86%1L-GFP。高水平的GFP表达可以明亮而壮观地标记旺盛的篮状细胞轴突树突(;)，包括其高度特征性的局部分支和锥体细胞体周围的体周发作(;). LS系列2L给出了非常相似的标记模式(和图S1).
注射AAV-LS的Pv-cre小鼠中GFP的表达1L-GFP稳定数月。（a） 将AAV-LS注射到Pv-cre小鼠（顶行；每个时间点3只小鼠）和野生型对照小鼠（中行；每个时刻3只小鼠1在注射后6、15、30和60天（dpi）灌注L-GFP和。请参见图S3对于60 dpi。所有的外荧光图像都是使用相同的采集参数用CCD摄像机采集的。使用了不会导致信号饱和的最大曝光时间（75 ms），并对所有显示的图像应用了相同的查找表。在Pv-cre小鼠中，GFP表达水平随时间增加。在这些条件下，在一些野生型对照小鼠（蓝色箭头）中检测到稀疏的弱信号；比例尺，100µm。最下面一行是野生型对照小鼠（蓝色）和Pv-cre小鼠（黑色）标记神经元体细胞GFP强度的量化。在注射Pv-cre的动物中，每只动物的GFP+细胞平均计数为（6,15,30 dpi）：110+/-34,215.3+/-34,195.3+/-26个细胞。（b） AAV-LS的全电池电流钳记录1以20dpi从2.5个月大的Pv-cre小鼠中转染L-GFP的神经元。左，记录细胞的DIC图像；插图显示GFP荧光；比例尺，10µm。对，响应250 pA电流阶跃的峰值的示例轨迹；比例尺，10 mV，25 ms。
功能性证明Cre激活的AAV载体具有细胞类型特异性。向Pv-cre小鼠注射AAV-LS2制备用于电生理记录的L-ChR2mCherry和急性切片。（a–c）光刺激直接诱发ChR2阳性神经元的去极化反应。靶向记录的ChR2阳性细胞的DIC和荧光图像（a）；比例尺：10µm。在细胞连接模式（b）中记录对持续时间增加的光刺激的尖峰反应（蓝线表示为7、14和500 ms）；比例尺：40 pA，25 ms。在TTX存在下，ChR2-介导的电流保持不变。（c） ；比例尺：50 pA，10 ms（d）电场刺激诱发抑制性突触后电流（上迹线，保持电位设置为AMPA/NMDA介导电流的反转电位，0 mV）和兴奋性突触前电流（下迹线，维持电位设置为GABA介导电流反转电位，−55 mV），以全细胞电压灯模式记录在金字塔细胞中；比例尺：40 pA，20 ms（e）光刺激特异性诱发抑制性突触后电流（上迹线），未检测到兴奋性突触前电流（下迹线）；比例尺：20 pA，20 ms。在相同的记录条件下，检测到抑制性和兴奋性自发突触事件；比例尺：20 pA，50 ms。
AAV-LS的标记效率1L-GFP根据与注射部位的距离而变化：效率>96%（200µm三体积）在注射中心附近观察到，而注射标记边缘足够稀疏，因此可以高分辨率跟踪单个篮细胞的轴突和树突(). 此外，注射量越小，标签越稀疏（数据未显示）。实现对体积大于200µm的篮式细胞进行高效标记三，可采用多途径注射[25].
Emx-cre小鼠在大多数（如果不是所有的话）新皮质锥体神经元中表达cre重组酶和核靶向lacZ[24].注射AAV-LS的Emx-cre小鼠的皮层1L-GFP，GFP的表达仅限于lacZ+锥体神经元(). 总体积为0.822 mm三（4只动物），98%的GFP+细胞与LacZ共定位。标签效率高达86%（0.51 mm三卷）。第5层锥体神经元的特征性顶树突和基底树突很明显；树突被棘高度装饰().
几种Thy1-GFP和-YFP转基因株已成功用于体内谷氨酸能锥体神经元的结构动力学成像[26]–[28]，主要是因为荧光信号在稀疏标记的神经元中是强烈的（可能是由于转基因的多个拷贝）。我们的AAV-LS转染篮子中间神经元中GFP的表达强度1注射后15天的L-GFP病毒（dpi）与年轻成年小鼠Thy1-GFP标记的锥体神经元相似[29]：亮标记AAV-LS躯体的GFP强度1L-GFP篮式细胞（GFPAAV:Pv公司)比Thy1-GFP标记的锥体神经元（GFP）高1.48+/-0.10倍您的1)(). 此外，我们发现，在Emx-cre小鼠的锥体神经元和Pv-cre小鼠篮子中间神经元（GFP）之间，AAV-驱动的GFP表达强度相似AAV:Emx公司/GFP公司您的1 = 1.27+/−0.19,). 因此，AAV-LS1L-GFP的表达与细胞类型和Cre驱动因子无关。使用相同的方法，我们还测量了Z/EG指示小鼠中GFP的表达水平[22]用Pv-cre小鼠（Pv-cre:：Z/EG）繁殖。与Thy1-GFP小鼠（GFP）锥体神经元相比，Pv-cre:：Z/EG小鼠篮状中间神经元的GFP强度弱50倍以上Pv-cre:Z/EG/GFP公司您的1强度=0.016+/-0.10）。Pv-cre:：Z/EG小鼠GFP表达水平过低，无法成像轴突或树突，标记效率低(图S2).
AAV-LSL-GFP的表达稳定数月
我们对AAV转染Pv-cre小鼠后GFP表达的时间进程和稳定性进行了表征。GFP信号早在注射后6天就显著。在注射后15天，表达水平进一步增加，并在至少60天内保持强劲。Pv-cre小鼠中单个AAV转染细胞的表达水平是异质的，甚至接近注射部位，如可变表达水平可能是稳定AAV基因组数量的细胞间差异的结果[30]和/或Cre激活的AAV基因组的数量。与Pv-cre小鼠相比，对照野生型小鼠注射AAV-LS1L-GFP显示少量GFP信号(). 在某些情况下，检测到一些微弱的GFP标记细胞，通常位于颗粒下层，这表明AAV-LS中的STOP盒有非常轻微的泄漏1L-GFP；然而，这种泄漏表达的发生率和水平都非常低().
即使在长期转染后，AAV也被认为是非致病性的[15],[18],[19]在AAV-LSL-GFP转染数周后的Pv-cre小鼠中，高度旺盛的篮状轴突和特征性的体周神经束表明AAV对中间神经元的形态没有可检测到的不良影响。为了检查是否对篮状中间神经元的内在生理特性有任何不利影响，在转染后18–20天制备急性皮质切片，并通过全细胞记录分析GFP阳性细胞。AAV转染的篮状中间神经元保持其特有的非调节性、快突表型[31]响应去极化电流注入(). 如预期的PV+篮状中间神经元，这些细胞具有较低的输入电阻（115.55+/-32.00mΩ（n=3个细胞）；它们的峰值很窄，26摄氏度时峰值半宽为0.82+/-0.06 ms，超极化后峰值较大（18.55+/-4.07 mV）。这些结果表明，AAV转染后中间神经元的固有生理特性得到了保留。总之，我们的结果表明，由Cre激活的AAV进行基因传递适合于长期的形态学、生理学和行为学研究。
Cre激活的AAV方法是细胞类型特异性的功能证明
我们通过表达通道视紫红质-2（ChR2；[32],[33])，一种快速门控的光敏阳离子通道，能够对短暂的蓝光脉冲作出反应，使神经元去极化，达到峰值阈值。一种ChR2-m樱桃融合蛋白[32]用于创建AAV-LS2L-ChR2mCherry，并将该病毒载体注射到2周大的Pv-cre小鼠中。在注射后1-2周制备的急性切片中进行电生理分析，以功能测试ChR2的细胞型特异性表达。
首先，我们证明AAV转染的神经元直接对光敏感(). 通过可视化mCherry荧光，将转染的神经元作为细胞附着或全细胞记录的靶点(). 短时间暴露于蓝光下，在ChR2mCherry+神经元中可靠地诱发了光驱动动作电位（棘波）。随着持续时间的延长，峰值数量增加；长时间的光刺激诱发了一种放电模式，这种放电模式与PV+中间神经元对长时间去极化电流注入的“口吃”放电模式一致(;[31]). 闪电瞬时射速高达260赫兹。对于持续时间为25ms的光脉冲，峰值的平均潜伏期为4.83+/−1.13ms，范围为2.3至9.4ms（n=6）。为了证实光的去极化效应是直接的，在存在或不存在动作电位阻滞剂TTX的情况下，对设置为低于阈值的光刺激，对ChR2mCherry+神经元进行全细胞记录(). 正如预期的那样，在TTX存在的情况下，维持光诱发的去极化电流，排除了去极化是双突触驱动的可能性。在使用TTX之前，到当前启动的平均延迟为0.73+/−0.19，并且在存在TTX的情况下，没有改变，为0.77+/-0.17 ms（n=3）。
接下来，在ChR2mCherry阴性锥体细胞突触后，在mCherry标记密集的区域对转染神经元进行全细胞记录(). 以下实验用于证明ChR2mCherry的表达仅限于PV+中间神经元：在AMPA/NMDA介导电流（0 mV）的反转电位下记录突触后反应，这是一种检测抑制电流并与兴奋电流隔离的保持电位，然后在GABA介导电流的反转电位（−55 mV）记录突触后反应，这是一种检测兴奋电流并将其与抑制电流隔离的保持电位。为了响应持续25 ms的光脉冲，在0 mV的保持电位下记录抑制电流(). 共有14个神经元检测到抑制反应，平均反应幅度为231+/-53.5 pA（范围：649.5-38.5 pA）。电流启动的平均潜伏期为6.63+/-0.55 ms，因此考虑到ChR2mCherry+神经元的平均尖峰潜伏期为4.83 ms，突触后反应潜伏期与电流的单突触激活一致。在所鉴定的14个抑制反应神经元中，未检测到兴奋性突触后电流，也未在任何其他神经元中检测到任何抑制反应阴性的兴奋性突触后电流（n=7）。为了证实在这些记录条件下，如果存在兴奋电流，就会检测到兴奋电流，电刺激被用来激发抑制电流和兴奋电流()此外，还检测到抑制性和兴奋性自发突触事件(，插图）。上述数据表明，ChR2的表达对抑制神经元具有特异性。
PV+抑制性中间神经元轴突结构动力学的体外成像
我们通过双光子显微镜在注射AAV-LS的Pv-cre小鼠（n=3）的新皮质中对篮状中间神经元进行了体内长期成像1L-GFP。将玻璃窗直接植入小鼠皮层。GFP的表达足够明亮，可以可靠地成像树突、轴突和假定的突触前神经束，这些神经束被视为沿着轴突的明显肿胀(). 在密集标记的区域，经常观察到篮状细胞树突和轴突的丛状物交织在一起，以及“篮状”突起的簇状物(，请参阅电影S1和电影S2查看高倍z系列堆栈）。在所有3只实验动物注射部位的边缘，标记稀疏，单个细胞的树突可以很容易地追溯到胞体(，请参阅电影S3以查看三维旋转）。我们发现树突主要呈肉冻状且光滑()，尽管在某些情况下树突状突起很明显(，请参阅电影S4查看z系列堆栈）。树突状突起的密度和大小与之前皮质快刺篮细胞的特征相似[34]分离良好的轴突分支和隆起经常可见().
In-vivo公司Pv-cre小鼠中GFP标记篮子中间神经元的双光子成像。（a） z系列从软脑膜表面以下～20µm处开始，从密集标记区域到～120µm深度的低放大投影。星号表示两个细胞体的顶部。许多树枝状分支用蓝色箭头表示。（b–c）（a）中突出显示的区域在两个不同深度的高倍z投影：软脑膜下85–90µm（b）和65–75µm。请注意光滑的白杨树突（蓝色箭头）和大小不等的密集的树突簇（黄色箭头）。（d） z系列从稀疏标记区域投射到软脑膜下方60–170µm处，显示出一个孤立的GFP标记篮子中间神经元。树突（蓝色箭头）可以追溯到胞体，轴突突起（黄色箭头）在这个放大倍数下表现为混浊信号。（e–f）从（d）中灰框所示区域放大的轴突形态示例。（e） 图中所示为轴突篮状结构（星号），（f）所示为分离良好的轴突分支（黄色箭头），带有明显的花束（黄色箭头所示）。（g–h）（d）中所示区域的枝晶结构。细胞的树突状物大部分呈白杨色（g），尽管偶尔在一些树突状分支上可见小突起（h）。比例尺a、d：20µm；b–c、e–h:5µm。
稀疏标记的一个主要优点是，它可以对同一神经元的树突和轴突结构进行可靠和重复的成像[27]在GIN转基因系中[35]GFP表达水平足以对生长抑素阳性中间神经元进行体内成像，但重叠树突状树干的密集标记阻止了对长约40微米的树突状分支的追踪，轴突结构的密集标记使重复测量难以定位同一区域（S.K.，未公开数据）AAV-LS的新皮质1L-GFP将Pv-cre小鼠注射到稀疏标记区域，我们能够反复成像相同树突分支（未显示）和轴突结构的长延伸()在几个星期的过程中。此外，树突分支很容易追溯到胞体().
篮子中间神经元体内结构动力学的慢性双光子成像。（a） 轴突分支和轴突的形态图像示例，在两天的过程中两者都是稳定的。（b） 观察了一周的成像间隔，其中轴突分支和突起基本稳定（黄色箭头），轴突轴上的增加（蓝色箭头）和减少（红色箭头）。注意，第7天没有显示两个最右边的波顿。（c） 轴突隆起增加和减少的比例（检测的隆起总数=183，来自三只动物）。（d） 新形成的石柱至少持续两天（蓝色箭头）的例子。比例尺：5µm。
我们在一周内监测了青春期后年轻成年小鼠（3个月大）的轴突动力学。Axon boutons在两天的时间间隔内相当稳定()轴突形态未见明显改变。长期成像显示，年轻成年小鼠的轴突隆起是动态的，尽管大多数隆起在一周内是稳定的。轴突轴上容易观察到轴突波顿增加和减少(). 增加和减少的数量是平衡的（每只动物的平均增加数量（n=3）：10.10+/-0.41%；减：9.47+/-1.18%，共检测183个波顿）。香肠之间的平均距离为5.5µm，与之前关于固定组织的报告一致[34]在少数情况下，可以监测新形成的浮石的持续性。我们发现这些新形成的浮石在剩下的成像实验中一直存在(). 这些结果表明，在体内，抑制性中间神经元轴突能够重塑青春期后大脑的结构。
讨论
随着对大脑中基因表达模式越来越全面的了解[10]很明显，基因表达谱与已知的解剖学和生理学定义的神经元类别相关[36]细胞类型特异性转录启动子是系统地建立细胞类型“遗传通路”的关键工具，部分是通过产生Cre驱动因子实现的[12]在这里，我们通过将病毒介导的基因表达纳入Cre/loxP二进制系统来改进这一策略。通过结合Cre驱动程序的力量和病毒介导的基因转移，我们开发了一种通用且经济高效的方法来标记和操作小鼠大脑中特定类别的神经元。取得了两个重要进展：1）适合活体成像特定细胞类型突触结构的高水平基因表达；2） 通过通道视紫红质的表达激活特定神经元类型。该方法在标记效率方面也是通用的。我们证明可以实现>95%的标记效率。对于需要稀疏标记的应用，可以通过减少注射的病毒量以及将成像研究引导到病毒转染的外围来降低效率。这与转基因系相反，转基因系的效率是固定的（即比较具有图S2). 此外，病毒注射不仅可以将基因传递到限制性细胞类型（由用于驱动Cre的转录启动子定义），还可以传递到特定的大脑区域和发育阶段，这在行为研究中是一个优势。最后，与小鼠基因工程相比，病毒生产更具成本和时间效率。尽管AAV的包装能力有限，约为5kb外源DNA[37].
皮层GABA抑制中间神经元对神经回路操作的各个方面都至关重要。此外，抑制性神经元的结构轴突重塑已被确定为经验发展和成人学习期间皮层回路微调的潜在细胞机制。例如，两个胡须[6]和视觉[5]剥夺减少了与锥体细胞接触的抑制性突触的数量，而刺激胡须则导致以锥体棘为靶点的突触前抑制性突触体的数量持续增加[4]最近的一项研究表明，与锥体神经元相比，皮质GABA能中间神经元中的树突状重塑可能更为显著[38]然而，由于GABA能细胞类型的异质性和缺乏高分辨率标记方法，尚未在完整的大脑中研究特定类别的抑制性皮层神经元和突触的结构动力学。通过对特定细胞类型中Cre激活病毒基因表达的双光子成像，我们首次观察到Pv+篮中间神经元的体内结构动力学。我们发现，尽管来自Pv+篮细胞的假定突触前神经束大体上是稳定的，但即使在年轻人中也会重塑。
一般应用
由于条件AAV向量的构造简单且经济，因此可以很容易地实现各种应用。首先，可以使用特定细胞类型的强烈标记来追踪长程轴突投射[19]并纯化细胞类型以分析基因表达谱[9]此外，以亚细胞为靶点的版本，如突触素-YFP融合蛋白，将允许在体内对确定的神经元结构进行高分辨率成像。其次，RFP或通道视紫红质在特定细胞类型中的表达将有助于生理学和成像实验中的细胞类型识别。用于研究哺乳动物体内神经网络活动的两种主要技术，动作电位四极管记录和容积钙成像[39]受细胞类型异质性固有问题的影响，记录或成像神经元的细胞类型身份极难确定。即使在区分兴奋性神经元和抑制性神经元的最基本层面上也是如此。我们在本研究中开发的方法可能有助于缓解这个问题。AAV-LSL-RFP可用于在体内钙成像实验中预先标记特定细胞类型，以便跟踪已知皮质细胞类型的钙动力学。此外，AAV-LSL-ChR2可用于在四极管记录期间识别细胞类型。这可以通过比较和匹配孤立单元的棘波与已知的、遗传定义的细胞类型的光诱发棘波来实现。第三，表达通道视紫红质或卤视紫红素的条件型AAV可用于在行为任务期间激活或抑制特定时间段的特定细胞群，以测试特定细胞类型在电路功能中的相关性。此外，显性阴性或shRNA结构可以通过条件AAV载体引入，以抑制基因功能，从而调节体内特定脑区特定细胞类型的活性。
认识到基于细胞类型的方法的重要性，NIH神经科学蓝图项目资助了系统生成Cre表达小鼠系的工作(http://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/rfa-MH-06-007.html). Cre激活的病毒基因表达增加了Cre小鼠系的用途和影响，并代表了研究神经回路组织和功能的重大技术进步。除了Cre/loxP，Flp/frt是另一个在小鼠中建立的重组系统[40]两种系统的组合应允许同时标记和操作两种细胞类型。
方法
根据冷泉港畜牧业和护理/福利指南对小鼠进行治疗。
生成LSL。XFP AAV载体
为了生成适合AAV载体的STOP盒，我们减小了Z/EG结构中STOP盒的大小[22]（C.Lobe的礼物）从4959个基点降至1788个基点。这是通过删除大部分βgeo融合基因实现的：βgeo的XbaI-SphI片段（包含上游loxP位点和大部分βgeo-fusion基因）被包含上游loxP位点和lacZ基因短N末端片段的657bp PCR片段所取代。PCR引物为：5′-GTTCGTCTCTGGCGTG ACC-3′,5′TTTGGGCATGCGAAACGCCGAGTTAACG CCATC-3′.得到的“Δβgeo/EG”结构包含2.8 kb的EcoRI-NotI片段，包含5′至3′的loxP、Δβge、3xpolyA、loxP和GFP cDNA。将这个2.8 kb的片段转移到包含ITR的AAV-MCS质粒（Stratagene），该质粒位于CMV启动子和β球蛋白内含子下游的HincII位点。该AAV-LS中的最终插入物大小为4682 bp1L-GFP载体。1.5 mg AAV-LS1L-GFP载体由maxiprep（Qiagen）纯化，并由宾夕法尼亚大学载体核心设施包装成AAV。
为了促进用任何感兴趣的转基因基因（～≤2kb）取代GFP，设计了LoxP-STOP-LoxP穿梭质粒。我们使用了一个短STOP盒（1298 bp；LS2五十） 仅由新霉素基因和2个HSV polyA信号组成，以终止转录，两侧有2个loxP位点。本LS2L盒是由Michael Lazarus博士在Clif Saper博士（哈佛大学，未发表）的实验室中设计的，我们证实它足以使GFP的表达以Cre介导的重组为条件(图S1). 将新霉素STOP盒亚克隆到AAV-MCS质粒中。大多数原始AAV-MCS多克隆位点（MCS）保持完整，位于STOP盒的下游，因此有助于插入感兴趣的基因以供未来研究。STOP盒末端的第一个ITR长度为2660 bp。考虑到AAV的容量为～5 kb[37]，约2kb或更少的转基因适合于该载体。去除穿梭载体中存在的大量生长激素polyA信号可以将基因插入大小增加到2.5kb。生成AAV-LS2L-RFP构造dsREDexpress（Clontech）被亚克隆到LS中2限制位点EcoRV和HindII的L穿梭质粒。生成AAV-LS2L-ChR2mcherry结构，ChR2mchirry[32]被亚克隆到LS中2L穿梭质粒（D.Kvitsiani，未出版）。如上所述制备AAV载体。
病毒注射
通过腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（0.13 mg/g，0.01 mg/g体重）麻醉年轻成年小鼠（1.5–3个月大，除非另有说明）。使用牙钻（Henry Schein）在头骨上钻一个小孔，距离脑门后0.5毫米，距离中线1.5毫米。硬脑膜被轻微刺破，病毒通过压力注射的方式传播，使用一个玻璃微移液管（尖端大小约为10µm）连接到Picospritzer（General Valve）上。将玻璃微吸管降低至软脑膜表面以下0.5 mm。为了将病毒注射到大脑中，以0.2–0.4 Hz的频率进行40次吹气（25 psi，持续时间10 ms），然后将吸管向表面缩回50微米，重复压力注射。重复此顺序，直到移液管尖端达到表面以下−250微米的深度。然后将移液管固定大约5分钟，然后完全从大脑中抽出。
免疫细胞化学和共定位定量
注射后15天对小鼠进行麻醉（戊巴比妥钠；6 mg/100 g体重），并在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中经心灌注4%多聚甲醛。使用振动仪（徕卡VT100）切割80微米厚的冠状切片。10%的NGS和1%的Triton®声波风廓线仪阻断了大脑切片。然后在4°C下将切片在10%的NGS、0.1%的Triton和一级抗体NeuN（小鼠单克隆，1∶400稀释；Chemicon）、PV（小鼠单抗，1∶1000；Sigma）或LacZ（小鼠单株，1∶200，Promega）中孵育过夜。然后用Alexa594-共轭山羊IgG（1∶400；分子探针）培养切片，用VectaBond安装介质（Vector Laboratories）和盖玻片（玻璃厚度：#0）安装在载玻片上。为了量化标记效率，我们采集了共焦图像，用手分别为两个荧光通道中的每一个单独的细胞进行识别，然后对共同定位进行评分。按照Chattopadhyaya 2004所述进行共焦显微镜检查[5]使用蔡司LSM510显微镜和20倍物镜数值孔径（NA）0.5或63倍油物镜（NA 1.4）。在多轨道模式下收集每个通道的扫描，以避免通道之间的串扰。
GFP荧光强度的量化
如上所述制备来自AAV转染的小鼠的脑切片。使用配备10倍物镜（NA 0.5，蔡司）、水银球、0.5中性密度滤光片、窄带GFP滤光片组（Chroma）和冷却电荷耦合器件相机（ORCA-ER；Hamamatsu）的Axioskop FS2立式显微镜（Zeiss）采集外荧光图像。图像以12位进行数字化，使用0–4096的全强度范围，而不使信号饱和。选择一系列80微米切片中标记最密集的切片（假定注射部位），并量化所选切片中所有细胞体的强度。为了计算单个细胞体的强度，使用ImageJ软件将感兴趣区域（ROI）放置在切片中的所有细胞体上，对给定细胞的九个最强烈的像素进行平均、背景提取，并应用背景最大和最小像素强度差的2倍的阈值。背景计算为200微米的平均强度2未注射对侧皮层的区域。对于转基因小鼠，背景值计算为10个不同20微米的平均强度2非标记皮层区域。暴露时间为75 ms，用于，以及50 ms（对于中量化的数据）单个脑片内AAV标记和Thy1-GFP标记细胞的强度差异很大。我们有兴趣将转基因小鼠中标记最强烈的Thy1-GFP细胞与我们的AAV介导的标记方法进行比较。因此，对每种情况下25-35个细胞体的强度进行了量化，并在。所有报告的误差估计值均按标准误差计算。
电生理学
转染AAV的GFP表达神经元。LS（负载感应）1转染AAV的L.GFP和mCherry表达神经元。LS（负载感应）2使用上述直立显微镜观察L.ChR2mCherry，并在近红外差分干涉对比光学下使用63倍物镜（NA 0.95）修补细胞。在mCherry的案例中使用了德克萨斯州红色滤光片组（Chroma）。用浸泡在ACSF中的切片进行全细胞电流灯记录（单位：mM）：126 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、1 MgSO4、2 CaCl2、10 D（+）-葡萄糖和25 NaCHO3；用95%O2/5%CO2连续起泡，以2–3 ml/min（26°C）的速度灌注。除非另有说明，否则移液管中充满细胞内溶液（mM）：135 K葡萄糖酸盐、4.3 KCl、2 NaCl、10 HEPES、0.5 EGTA、4 MgATP、20磷酸肌酸（Na）和0.3 NaGTP，pH 7.3，300 mOsm，电阻为2-4 MΩ。数据采集频率为5-10 kHz，低通滤波频率为2 kHz。电生理信号由Multicamp 700A放大器、Digidata 1322模数转换器和Clampex9软件（Molecular Devices）进行处理和控制。所有报告的误差估计值均按标准误差计算。
通过窄带GFP滤光片组使用全场外荧光进行光刺激。光刺激的定时通过快门（型号VS25，UniBlitz）控制，并使用Clampex9软件触发。使用光度计校准光传递的持续时间，并将其报告为大于80%最大光强的开始和偏移之间的持续时间。对于突触后记录，移液管中充满（单位：mM）：120 Cs-葡萄糖酸盐、8 KCl、10 HEPES、10 EGTA、10 QX-314。在20µM CNQX和100µM APV存在的情况下，根据电场刺激，对该内溶液中GABA介导的氯电流的反转电位进行了经验测量。
体内双光子成像
根据Holtmaat（2004）中描述的方案制作慢性窗口[41]注射AAV-LS后2–3周1L-GFP。用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（0.13 mg/g，0.10 mg/g体重）麻醉动物，并给予少量地塞米松（0.02 ml，4mg/ml）以减轻炎症。去除颅骨上的皮肤，局部应用利多卡因。使用牙钻（Henry Schein）将之前注射病毒后的颅骨区域（直径约1 mm）移除，使硬脑膜保持完整。然后将玻璃盖玻片（EM Sciences，#1，5 mm圆形）涂上稍微加热的琼脂糖（III-A型，在HEPES缓冲ACSF中为1%），轻轻放在开颅手术上，并用牙科丙烯酸树脂密封。
在成像当天，用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（0.13mg/g，0.10mg/g体重）麻醉小鼠，并将其固定在显微镜物镜下方的固定位置。使用定制的双光子激光扫描显微镜获取GFP标记细胞的静脉内图像[13]，由ScanImage软件控制[42]光源为运行在λ910 nm处的Ti:Sapphire激光器（Mira 900，相干），由10瓦泵浦激光器（Verdi V-10，相干）驱动。光线通过扫描透镜和蔡司物镜（40×浸水物镜，NA 0.8）聚焦。用光电倍增管（Hamamatsu）检测信号。以每像素0.36–0.075微米的分辨率，以1微米的步长收集图像堆栈。
借助ImageJ和Matlab软件计算Axon波顿数。在量化之前，对原始图像进行中值滤波（2.0像素）。在ImageJ中手动追踪轴，并将强度剖面图（1像素厚度）导入MatLab。计算每个轴突节段的强度剖面图的近似导数和导数的标准偏差，如果导数值大于至少3个连续点的正标准偏差，则对是否存在bouton进行评分，并越过负标准偏差，而不在零线上波动。
支持信息
图S1
STOP2提供条件表达式。（a） 注射AAV载体的Pv-cre小鼠的外荧光图像，该载体包含短Neo-2xpA STOP盒（LS2L）和人类RenillaGFP基因（AAV-LS2L-hrGFP，C.Saper的礼物）。（b–c）以3∶1的比例联合注射AAV-LS2L-hrGFP（b）和通用AAV-RFP（c）的野生型对照小鼠的共焦图像。（d） 注射AAV-LS2L-hrGFP的PV-cre小鼠新皮质篮子中间神经元中GFP和小白箭头的共定标（白色箭头）；标尺，20微米。最右侧的篮状细胞轴突高分辨率图像，具有PV+中间神经元特征的“篮状”终末分支和围绕锥体细胞体（用NeuN免疫荧光标记）的花束（黄色箭头）；标尺，5微米。
（3.73 MB畅通节能法）
图S2
在Pv-cre:：Z/EG小鼠中低水平GFP表达。使用1秒曝光时间的年轻成年Pv-cre:：Z/EG小鼠的荧光图像（比)和一个压缩的查找表。使用与中相同的采集参数，单元格（箭头）不可见轴突和树突分支都不容易看到，尽管偶尔会注意到靠近胞体的树突分支主干（箭头所示）。比例尺，100微米。
（0.45 MB畅通节能法）
图S3
注射后60天。使用与中相同的参数和查找表注射AAV-LS1L-GFP的年轻成年Pv-cre小鼠的图像；标尺，100微米。
（0.38 MB畅通节能法）
电影S1
z系列堆栈，从中已被占用。
（1.10 MB MOV）
电影S2
z系列堆栈，从中已被占用。
（461毫巴莫夫）
电影S3
单元格的三维旋转如所示.
（1.36 MB MOV）
电影S4
z系列堆栈，其中已被占用。
（1.65 MB MOV）
致谢
我们感谢Anthony Holtmaat博士、Linda Wilbrect博士和Karel Svoboda博士对慢性体内双光子成像的指导，感谢Karel Swoboda博士的持续支持，感谢Duda Kvitsiani博士、Xiaoyun Wu、Yu Fu和Pricilla Wu博士在构建和免疫训练方面的帮助，感谢Silvia Arber博士赠送Pv-cre小鼠，感谢Yuqing Li博士赠送Emx-cre小鼠，Karl Deisseroth博士获赠视紫红质cDNA，Duda Kvitsiani博士获赠LSL视紫红质体载体，Clif Saper博士和Michael Lazarus博士获赠AAV的未发表数据和礼物。LSL.hrGFP公司。
脚注
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
基金：NARSAD向S.J.K.发送。；Z.J.H.国立卫生研究院和数学基金会。；由向Karel Svoboda拨款MH070052-05提供部分支持
工具书类
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