脯氨酰羟化酶结构域蛋白对成人红细胞生成的调节

摘要

介绍

缺氧引起的红细胞生成是一个高度调节的适应性过程，维持体内氧稳态，其失调可能导致病理后果。大量研究表明，人和动物低氧诱导的红细胞增多症与促红细胞生成素（Epo）上调有关，^1–9可能是由于缺氧诱导因子（HIF）的积累。^10–12

HIF是一种异二聚体转录因子，由3个氧敏感α亚基之一和一个常见且稳定的β亚基组成。^13–15作为感知氧浓度的基本机制，α亚基的稳定性是通过含脯氨酰羟化酶结构域（PHD）的蛋白质对氧依赖性降解域中的特定脯氨酸残基进行羟基化来调节的，这些蛋白质属于2-氧戊二酸/铁依赖性双加氧酶超家族。^16–20羟基化HIF-α亚单位被von Hippel-Lindau（VHL）蛋白识别，用于多泛素化和蛋白酶体降解。^17,21–23

鉴于PHDs在调节HIF-α丰度方面的重要性，它们有望在红细胞生成、血管生成和代谢等过程中发挥关键作用，这对动物适应缺氧环境或应对因循环受阻而导致的局部组织缺氧至关重要。虽然只有一种HIF-特异性脯氨酰羟化酶秀丽隐杆线虫或黑腹果蝇，人类和其他哺乳动物至少有3种PHD亚型，称为PHD1/EGLN2/HPH3、PHD2/EGLN1/HPH2和PHD3/EGLN3/HPH1。^16,17,24作为脯氨酸特异性羟化酶，所有3种亚型在常氧条件下都能有效地将HIF-α亚基羟化。^16,17,25此外，每个PHD亚型的强制过表达都可以抑制HIF依赖的转录活性。²⁶

然而，不同的PHD在表达谱上确实存在差异，^25,27亚细胞定位模式，²⁸以及对HIF-1α或HIF-2α的不同活性。²⁹因此，不同的PHD亚型可能在调节缺氧反应中具有不同的功能。例如，在常氧培养的许多细胞系中，PHD2是导致HIF-α降解的主要亚型，部分原因是其表达最丰富。³⁰然而，在缺氧条件下，负反馈调节机制被激活以上调博士2和博士3转录。³¹由于PHD3在常压下处于非常低的水平，低氧诱导的表达在这种亚型中尤为显著。简而言之，由于不同PHD亚型的差异调节，重要的是要解决单个PHD亚型别在调节体内各种病理生理过程中是否发挥特殊作用。

虽然我们之前已经证明PHD2是小鼠胚胎和成年血管系统中最关键的亚型，^32,33控制血液稳态的基本PHD亚型尚未确定。人类点突变的杂合性PHD2级据报道，该基因（P317R，可降低羟化酶活性）与红细胞增多症的病因相关。¹²然而，其他PHD亚型的贡献仍然未知。为了剖析不同亚型在红细胞增多症相关病理条件中的作用，我们分析了携带以下突变的小鼠的血液表型：博士1^−/−,博士3^−/−,博士1^−/−/博士3^−/−(博士1/三双淘汰赛，或博士1/三DKO），以及博士2大多数成人组织中的体细胞突变。我们的数据表明，成年小鼠的血液稳态主要由PHD2维持，但进一步受到PHD1和PHD3联合作用的调节。

方法

结果

在之前的研究中，我们培育了携带编码PHD1、-2和-3基因的靶向破坏的小鼠。^32,33在这里，我们使用这些小鼠来评估不同PHD亚型对血液稳态的作用。因为博士1^−/−和博士3^−/−我们将这些小鼠杂交以获得博士1^+/−/博士3^+/−小鼠，进一步交叉产生博士1^−/−/博士3^−/−(博士1/三DKO）小鼠以及各种其他预期基因型的后代，其中野生型同窝鼠被进一步杂交以获得对照小鼠。尽管进一步交叉博士1/三DKO小鼠的产仔量通常较小（通常每胎产3-4只幼崽），我们没有观察到活产子代的出生后死亡率增加（到手稿完成时的~12个月）。产仔数减少是由于胚胎死亡还是受精减少，尚待研究。

在这项研究中，我们重点研究了成年小鼠的血液表型。出生后6周或更晚，博士1/三DKO小鼠的爪子明显变红(图1A） 和鼻子(图1B） 尤其是鼻孔下方。这些小鼠的肝脏也出现肿大(图1C： 野生型，1.4±0.13克；DKO，2.2±0.2克；n=6，P（P）<.001）和脾肿大(图1D： 野生型，95±6mg；DKO，204±14毫克；n＝6，P（P）< .005). 这些形态学变化与红细胞生成活性升高相一致。事实上，这些小鼠的外周血样本显著增加了红细胞（RBC）的数量，同时血红蛋白浓度也提高了(图2A、 B）。红细胞压积值增至.67(图2C） 这明显高于野生型平均值约0.53。然而，白细胞（WBC）的数量没有显示出统计上的显著变化(图2D） 。我们惊讶地发现，尽管红细胞生成活性增加，但血清Epo水平降低(图2E） ●●●●。相比之下博士1/三DKO小鼠，博士1^−/−和博士3^−/−小鼠没有明显的血液学异常(图2F至J）。

在单独的窗口中打开

图1

出现红斑博士1/3DKO和博士2CKO小鼠。（A-D）红血性外观（爪子和鼻子分别为红色，A和B），肝脏（C）和脾脏（D）肿大博士1/三DKO小鼠。WT，野生型；DKO、，博士1/三双基因敲除小鼠。（E-H）博士2CKO小鼠和博士2^{飞行/飞行}对照小鼠。三苯氧胺治疗CKO和CKO约6周后的腹部（E）和爪子（F）博士2^{飞行/飞行}老鼠。注意坏死的肠和红色的爪子博士2CKO小鼠。左侧，博士2^{飞行/飞行}; 正确的，博士2CKO公司。（C） 脾脏。顶部，博士2^{飞行/飞行}; 底部，博士2CKO公司。（D） 肝脏。左侧，博士2^{飞行/飞行}，对，博士2CKO公司。图像是用连接到徕卡MZFLII立体显微镜（徕卡微系统公司，瑞士海尔堡）的CoolSNAP电荷耦合设备数码相机（Photometrics-Roger Scientific，亚利桑那州图森）拍摄的。使用单物镜（Leica Plan 1.0，10倍放大率，Leica Microsystems）获取图像。Openlab（Improvision，马萨诸塞州列克星敦）用于初始图像采集，Photoshop 7.0（Adobe Systems，San Jose，CA）用于后续处理。

在单独的窗口中打开

图2

外周血的血液学参数博士1^−/−,博士3^−/−、和博士1/3DKO小鼠。（A-E）博士1/三DKO和野生型对照小鼠。红细胞表示红细胞；血红蛋白；Hct，hemtocrit；白细胞和白细胞。n=6。（E） ELISA检测血清Epo水平。n=4**P（P）< .01; *P（P）< .05. （F-J）正常血液特性博士1^−/−或博士3^−/−老鼠。（A-I）野生型（WT）数字中显示的外周血血液学参数，博士1^−/−，或博士3^−/−老鼠。P（P）>0.05适用于所有对比较。n=6。（J） ELISA检测WT中的血清Epo水平，博士1^−/−，或博士3^−/−老鼠。n=6。误差条代表SEM。

接下来，我们通过流式细胞术分析了各种造血标志物的分布。在博士1/三DKO脾脏和肝脏，红系祖细胞（Ter119⁺)分别增至正常值的4.3倍和3.6倍，骨髓（BM；图3A） ●●●●。脾髓细胞（CD11b）的数量⁺)也呈上升趋势(图3B） 以及显示造血干细胞表面标记特征的骨髓衍生细胞的数量（Lin⁻Sca-1型⁺CD117号⁺; 从此称为HSC）增加到正常值的2.4倍(图3C） ●●●●。此外，HSC标记的细胞在博士1/三DKO肝脏和脾脏(图3C） ●●●●。虽然甲基纤维素菌落形成试验没有证实造血活性增加（每10个菌落⁵细胞：野生型BM，440±50；DKO-BM，530±55；n=6，P（P）=.33），BM衍生Ter119增加⁺和林⁻Sca-1型⁺CD117号⁺尽管如此，细胞仍提示骨髓属性在博士1/三DKO小鼠。

在单独的窗口中打开

图3

流式细胞术分析博士1/3DKO小鼠。（A） 红细胞（Ter119⁺); （B） 髓系（CD11b⁺); （C） HSC（林⁻Sca-1型⁺CD117号⁺). 对骨髓（BM）、脾脏和肝脏样本进行分析。显示了每个器官中的总细胞数；n=6至7。P（P）数值显示在条形图上方。误差条代表SEM。

为了评估PHD2在造血中的作用，我们生成了博士2他莫昔芬诱导的条件性敲除小鼠(（f）)外显子2博士2^{飞行/飞行}/罗莎26^{+/CreERT2公司}小鼠（图S1A，可从血液网站；请参阅在线文章顶部的补充资料链接）并在6周后检查血液表型。在这些小鼠中，各种组织中的红细胞表现比在博士1/三DKO小鼠(图1E和F）。脾脏进入博士2CKO小鼠相对于博士2^{飞行/飞行}老鼠(博士2^{飞行/飞行}，108±19毫克；博士2CKO，528±69毫克；n=6，P（P）< .01;图1G） ●●●●。这个博士2^{飞行/飞行}对照组小鼠也同时接受三苯氧胺治疗博士2CKO小鼠排除该药物的潜在药理作用。此外，肝脏也比正常人更大、颜色更浓(图1H） ●●●●。博士2CKO小鼠在他莫昔芬治疗后约40天开始死亡，诱导敲除后约90天死亡率达到90%（图S1B）。此外，博士2CKO小鼠表现出其他地方已经描述过的显著的血管表型。³³

确定是否博士2CKO小鼠存在血液形成或体内平衡缺陷，我们将其血液学参数与博士2^{飞行/飞行}对照小鼠。博士2CKO小鼠每单位体积的RBC数量增加(图4A） ，血红蛋白浓度较高(图4B） 红细胞压积急剧升高（.83；图4C） ●●●●。此外，白细胞数量也显著增加(图4D） 。在2周内，血清Epo水平达到基础水平的约230倍博士2淘汰赛(图4E） 血红蛋白浓度也随之增加(图4F） ●●●●。

在单独的窗口中打开

图4

外周血血液学参数异常博士2CKO小鼠。（A-D），博士2CKO和博士2^{飞行/飞行}对照组小鼠均在6周龄时服用三苯氧胺，并在6周后进行分析。红细胞、血红蛋白浓度、红细胞压积和白细胞均显著增加。n=6.**，P（P）< 0.01. （E） ELISA测定血清Epo水平随时间增加。每个时间点n=3。（F） 血红蛋白浓度增加的时间过程。每个时间点n=3。误差条代表SEM。

在博士2CKO小鼠，Ter119⁺和CD11b⁺脾脏中的细胞都显著增加，同时骨髓和肝脏中也有中度但统计学上不显著的变化(图5A、 B）。脾脏CD11b大量扩张⁺细胞数量可以部分解释外周血白细胞数量增加的原因(图4D） 。BM衍生的HSC有增加的趋势(图5C） ，但没有中的重要博士1/三DKO小鼠。然而，脾和肝Lin⁻Sca-1型⁺CD117号⁺人口显著增加(图5C） ●●●●。这些扩增与甲基纤维素集落形成试验评估的血管外造血活性增加相关(图5D） ●●●●。

在单独的窗口中打开

图5

造血祖细胞和造血干细胞的分析博士2CKO小鼠。（A-C）流式细胞术分析。（A） 红色（Ter119⁺); （B） 髓系（CD11b⁺); （C） HSC（林⁻Sca-1型⁺CD117号⁺). 对骨髓（BM）、脾脏和肝脏样本进行分析。显示了每个器官中的总细胞数。n=6至7。P（P）数值显示在条形图上方。（D） 甲基纤维素菌落形成试验。基因型显示在底部。f/f和CKO参考博士2^{飞行/飞行}和博士2CKO小鼠。每10个菌落数⁵给出了单元，n=6；P（P）数值如图所示。误差条代表SEM。

鉴于PHD2活性的部分丧失与人类轻度红细胞增多症有关，¹²我们的发现是PHD2表达的广泛缺失导致了极严重的红细胞增多症，我们有兴趣研究PHD2的杂合性博士2敲除等位基因将至少导致红细胞生成的适度升高。如所示图6尽管他莫西芬治疗过博士2^（f）/−/罗莎26^{+/CreERT2公司}（即，博士2服用三苯氧胺2周后，CKO小鼠表现出预期的红细胞表型，博士2^（f）/−接受平行三苯氧胺治疗的小鼠（无CreERT2）的红细胞压积无明显增加(图6A） ，血清血红蛋白浓度(图6B） ，或RBC号码(图6C） ●●●●。因此，单个漂浮等位基因足以维持红细胞生成活性的负调控。值得注意的是博士2CKO小鼠在这个时间点（三苯氧胺治疗2周后）的白细胞和血小板数量没有出现统计上显著的变化。

在单独的窗口中打开

图6

杂合子小鼠的正常血液学参数博士2淘汰赛。（A-E）博士2条件敲除小鼠和对照组。（A） 红细胞压积值。（B） 血红蛋白浓度。（C） 红细胞数量。（D） 白细胞。（E） 血小板。在服用他莫昔芬前两周，进行基线测量（Tam，−）。在服用他莫昔芬（Tam，+）2周后再次进行测量。CreERT2状态表示为Cre−或+，分别表示缺席或在场。博士2^（f）/−携带CreERT2并喂食三苯氧胺的小鼠也被指定为CKO，用于条件敲除。这些类似于博士2其他实验中使用的CKO小鼠，除了这里的一个等位基因在三苯氧胺治疗前为−；它是作为种系突变遗传的。对于（A）到（E），n=3到7*P（P）< .05. （F） 20周龄以上生殖系杂合子的血液学分析。n=5至6。误差条代表SEM。

为了进一步评估杂合小鼠在较长时间内是否会出现红细胞增多症，我们还检测了杂合生殖系小鼠的血液学参数(博士2^+/−)20周以上的小鼠。如所示图6F、 两组之间无显著差异博士2^+/+和博士2^+/−老鼠。因为失去了一个人博士2小鼠中的等位基因将PHD2蛋白水平降低约一半，³²我们得出结论，小白鼠PHD2的中度丢失并不会对红细胞生成产生实质性影响。

我们还进行了分子分析，以更好地了解本研究中观察到的血液表型。确定博士2CKO、，博士1^−/−、和博士3^−/−小鼠与单个PHD亚型的差异表达相关，我们分析了不同组织中PHD1、-2和-3的蛋白水平。通过体外转录/翻译（IVTT）实验初步鉴定了不同PHD亚型的蛋白带(图7A和图S2），并且在之前的研究中也确定了PHD2带。³²如所示图7B、 PHD2是所有检查组织中含量最高的同种型。PHD1仅在几个器官（睾丸、骨髓、脾脏，可能还有肝脏）中微弱检测到，而PHD3在所有组织中均低于检测水平。IVTT通道中存在2个PHD1谱带（一个更强烈的缓慢迁移谱带和一个较弱的快速谱带），可能是由于存在2个不同的翻译起始位点。³⁷

在单独的窗口中打开

图7

分子分析博士2CKO和博士1/3DKO小鼠。（A） 放射自显影术[³⁵S] IVTT生产的蛋氨酸标记PHD1、2和3。免费、非法人[³⁵S] 蛋氨酸。（B） 野生型成年小鼠各种组织中PHD1、-2和-3的蛋白质印迹分析。以等量的IVTT产生的PHD1、-2和-3蛋白作为对照。注：PHD1有2条谱带，因为存在选择性翻译起始。（C） 抗-PHD2蛋白印迹博士1/三DKO组织。（D） 抗HIF-1α和HIF-2α蛋白印迹博士2CKO和博士1/三DKO小鼠。（E，F）Q-PCR分析Epo公司mRNA。飞行/飞行，博士2^f/f；CKO、，博士2CKO；WT，野生型；DKO、，博士1/三丹麦克朗。n=6。（F） 面板E中的刻度减小**P（P）< .01; *P（P）< .05. 误差条代表SEM。

野生型和野生型之间BM、脾脏、肝脏和肾脏中PHD2的丰度相似博士1/三DKO小鼠(图7C） 这表明PHD1/3双重缺陷并没有上调造血器官中PHD2的表达。我们还检测了野生型肾脏和肝脏中HIF-1α和HIF-2α的水平，博士2^{飞行/飞行},博士2CKO和博士1/三DKO小鼠(图7D） 。正如预期的那样，HIF-1α水平在博士2CKO小鼠。然而，在PHD2缺陷的肾或肝组织中，HIF-2α仍然无法检测到。在博士1/三DKO小鼠，HIF-2α在肝脏中显著增加，但在肾脏中没有增加，但HIF-1α在两个器官中都没有增加。事实上，肾脏HIF-1α水平在6人中的5人中中度降低博士1/三DKO小鼠。理论上，由于较高的红细胞数量和更有效的氧气输送，肾脏灌注增加可能会增加PHD2介导的羟基化和随后的HIF-1α降解博士1/三DKO小鼠。

在mRNA水平上，Q-PCR分析显示Epo公司中的表达式博士2CKO肾脏而非肝脏，尽管两者HIF-1α增加(图7E、 F），表明肝脏HIF-1α不足以Epo公司表达式。形成鲜明对比的是，博士1/三DKO小鼠肾功能显著降低，而非增加Epo公司表达式(图7F） ，这可能是导致血清Epo水平降低的部分原因。然而，红系祖细胞和早期红细胞数量的增加也可能通过增加受体结合减少了游离Epo蛋白分子。然而，肝脏Epo mRNA在博士1/三DKO小鼠(图7F） 与肝脏HIF-2α上调相一致。

讨论

在人类和其他哺乳动物中诱导红细胞增多症是缺氧的基本适应机制之一，^38–41这也与导致HIF-α积累和Epo过度表达的基因改变有关，例如人类的部分功能丧失突变甚高频或PHD2级基因。^1,2,12PHD在启动HIF-α降解和抑制红细胞生成方面的作用正在被开发用于治疗贫血和组织缺血的治疗程序。例如，PHD抑制剂，也被称为HIF稳定剂，正在进行临床试验。^42,43

在本文中，我们详细研究了不同PHD亚型在红细胞生成中的作用。我们发现，所有3种PHD亚型都有助于成年小鼠红细胞生成的调节，但程度不同，并且通过不同的HIF途径。博士2仅基因破坏就导致了显著的红细胞增多和过早死亡，可能是由于血液高粘滞所致。虽然单次击倒博士1或博士3导致未检测到红细胞增多博士1和博士3也导致红细胞压积适度增加（平均0.67博士1/三DKO vs.83英寸博士2CKO小鼠或野生型小鼠中的.53）。

PHD2缺陷小鼠的红细胞增多症很可能是由Ter119的过度分化和增殖引起的⁺红系祖细胞，已知其大量表达Epo受体。⁴⁴这一概念与流式细胞术数据一致，流式细胞仪数据显示Ter119显著增加⁺单元格(图5A） 和ELISA检测结果显示博士2CKO小鼠(图4E） ●●●●。三苯氧胺治疗6周后观察到白细胞数量的变化，但在治疗前（2周）没有观察到，这表明髓系细胞数量的增加可能是血液性质严重改变和患者健康状况普遍恶化的结果博士2CKO小鼠。同样，HSC人群扩张的直接原因也有待于在未来的研究中阐明。

PHD2作为红细胞生成负调节因子的主要作用可能是因为它是迄今为止最丰富的亚型(图7B） ●●●●。虽然肝脏PHD2缺乏导致HIF-1α蛋白水平升高，但对HIF-2α没有明显影响。同样值得注意的是，我们观察到PHD2缺陷肝脏中HIF-1α的积累并没有促进局部Epo公司表达式。这一发现与最近的研究一致，这些研究表明，HIF-2α而不是HIF-1α对Epo公司表达，尤其是在肝脏中。^45–50在博士2然而，CKO肾脏上调Epo公司在未检测到HIF-2α积聚的情况下表达。因此，尽管HIF-2α而非HIF-1α是Epo公司基因激活，当HIF-1α在肾脏中积累到较高水平时，可能能够激活Epo公司表达式。无论涉及的特定HIF-α的身份如何，很明显，显著增加环氧丙烷表达是影响血液表型的主要因素博士2CKO小鼠。

红细胞增多的机制博士1/博士3DKO小鼠更为复杂，尤其是因为PHD1和PHD3蛋白都处于低水平。在各种可能性中，一个合理的解释是，两者可能只在选择性细胞类型中表达，导致其在总组织裂解物中的丰度明显较低。另一方面，需要破坏这两者博士1和博士3触发红细胞增多症的基因与其总体低表达水平一致。同样令人惊讶的是，在博士1/三DKO小鼠。一种可能性是，大量红系祖细胞可能通过受体结合从血清中清除Epo。

与血清Epo水平降低相比，Epo公司表达上调博士1/三DKO肝脏，伴有同一器官中红细胞数量显著增加。值得注意的是，肝脏HIF-2α水平升高而非HIF-1α水平与这些变化相关，这表明PHD2和PHD1/3的组合调节肝脏中不同的HIF-α亚单位。这些发现也与体外研究一致，该研究表明不同PHD亚型之间存在类似的差异活性。²⁹

很可能会增加环氧丙烷肝脏中的表达通过刺激肝微环境中红细胞的分化和增殖而促进红细胞增多。也不排除红系祖细胞内源性Epo生成可能因PHD1/3双缺陷而增加并导致红细胞增多的可能性；然而，尚不清楚是否Epo公司红系祖细胞的表达依赖于HIF。⁵¹无论如何，我们的数据与早期的研究一致，该研究表明，服用PHD抑制剂后，无肾动物的红细胞生成增加，⁴²这表明抑制肾脏以外器官的PHD功能可以加速红细胞生成。然而，其他可能的机制也可能可行。例如，由于骨髓微环境中的缺氧调节造血干细胞功能，⁵²研究骨髓特性的改变是否会导致红细胞增多症是未来的一个重要方向博士1/三DKO小鼠。

我们的结论是，PHD2和PHD1/3通过不同的机制调节红细胞生成，这对贫血和其他血液疾病的治疗具有重要意义。例如，了解PHD2对于抑制Epo公司我们的数据可能会启发组织特异性治疗的发展。此外，由于血管缺陷与PHD1/3缺乏无关，抑制PHD1和PHD3可能是治疗贫血的一种更好的方法。总之，本文所述的工作建立了PHD缺陷小鼠作为红细胞生成研究的动物模型，并确定了不同PHD亚型在调节HIF-α稳定和Epo公司表达式。这些发现有望促进PHD作为治疗血液病的特定药物靶点的发展。

补充材料

致谢

脚注

工具书类