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EMBO J。2008年1月23日；27(2): 433–446.
2008年1月17日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.emboj.7601963
预防性维修识别码：项目经理2234339
PMID：18200046

分裂和选择性融合通过自噬控制线粒体分离和消除

吉拉德·特威格,1,* 阿尔瓦罗·埃洛扎,1,* 安东尼·J·A·莫利纳,1,2 希博·穆罕默德,1 雅各布·D·威克斯特罗姆,1 吉尔·沃尔泽,1 林西·斯泰尔斯,1 莎拉·海格,1 斯蒂夫·凯茨,1 盖伊·拉斯,1 约瑟夫·阿尔罗伊,三 吴敏,4 贝内迪克特·菲比,5 袁均英教授,5 裘德·T·迪尼,2 芭芭拉·科基,2和Orian S Shirihai公司1,一
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关联数据

补充资料

摘要

β细胞内去极化线粒体的积累与氧化损伤和糖尿病的发展有关。为了确定去极化线粒体的来源和命运，对单个线粒体进行光标记，并通过融合和分裂进行追踪。研究人员发现，线粒体以“接吻-奔跑”模式经历了频繁的融合和分裂周期。裂变事件常常产生不均匀的子单元：一个子单元的膜电位（Δψ）增加米)而另一种则降低了膜电位，降低了发生融合事件的概率。总之，这种模式产生了一个非融合线粒体亚群，发现这些线粒体降低了Δψ米并降低融合蛋白OPA1的水平。通过DRP1抑制裂变机制K38A公司或FIS1系统RNAi降低线粒体自噬，导致线粒体氧化蛋白的积累，呼吸减少，胰岛素分泌受损。蛋白质水解前阶段的自噬脉冲追踪和阻滞表明，自噬前线粒体失去Δψ米OPA1的过度表达降低了线粒体自噬。总之，这些发现表明，分裂后选择性融合分离了功能失调的线粒体，并允许通过自噬去除线粒体。

关键词：自噬、β细胞、分裂、融合、线粒体

介绍

活细胞中的线粒体形成一个动态的网，通过融合和裂变事件不断重塑。融合产生具有连续膜和基质腔的网络。因此，每个网络的组成部分共享溶质、代谢物和蛋白质(中田等2001年;阿里穆拉等, 2004;陈等, 2005)以及电化学梯度，使它们电耦合(斯科拉切夫，2001年;细枝等, 2006). 线粒体网络的这些特征表明，融合是一种机制，完整的线粒体可以通过这种机制补充受损的单位，并可能恢复其活性，从而保持代谢效率(陈，2006). 然而，最近的报道质疑融合作为恢复去极化线粒体的生理机制的作用，因为线粒体膜电位（Δψ米)使用药物解偶联剂导致网络广泛断裂，细胞光学萎缩蛋白-1（OPA1，一种融合蛋白）降解，并抑制融合(勒格罗斯等, 2002;梅森等, 2004;杜维津·考贝特等, 2006;石原等, 2006;歌曲等, 2007). 药物诱导细胞Δψ崩溃米阻止融合，目前尚不清楚融合伴侣的配对是任意的还是选择性的，以及去极化线粒体在被功能网络包围时是否确实参与了融合和裂变的循环。此外，如果线粒体存在于允许基质和膜成分扩散和平衡的动态网络中，则在未受干扰的细胞内产生去极化线粒体的事件并不明确。因此，网络是否能够产生与源网络功能不同的分离线粒体尚待确定。解决这个问题需要对单个裂变事件的后果进行表征。

虽然融合可能会将功能失调的线粒体募集到活性池中，但自噬以去极化的线粒体为目标进行消化和清除(埃尔莫尔等2001年;普里奥等, 2005); 线粒体在这两种命运之间的分类机制尚不清楚(莱文和袁，2005). 若融合和自噬是去极化线粒体的竞争命运，我们认为裂变可能在允许这种竞争发生方面发挥关键作用。

为了确定融合/裂变平衡是否在控制去极化线粒体的命运中发挥作用，进而通过互补来拯救或通过自噬来消除，有必要确定裂变是否对自噬至关重要，如果是，是什么机制触发裂变。这里我们证明了聚变触发裂变，而裂变对自噬至关重要。尽管线粒体网络看起来是同质的，但分裂可以产生代谢上不同的子单元。Δψ降低的子线粒体米不太可能与线粒体网络再融合，更有可能成为自噬的靶点。

结果

线粒体融合是选择性的

我们假设线粒体融合是一个选择性过程，并测试了可以识别出融合能力低的线粒体亚群的预测。我们的目标是追踪这些线粒体，检查它们的代谢功能、来源和命运。INS1细胞的融合是通过线粒体基质靶向光活化GFP（mtPA-GFP）从线粒体亚群扩散到整个线粒体网络来确定的。在每个细胞中，一个约占单个焦平面细胞横截面积10%的区域受到双光子激光刺激，导致标记线粒体体积的10-20%（平方英寸图1A). 融合的结果是，活化的mtPA-GFP分子扩散到未标记的线粒体，导致含有活化mtPA-GFF的线粒体的GFP荧光强度（FI）降低(图1B; 参见中的“线粒体融合分析”补充数据). mtPA-GFP的稀释在10–30分钟后达到稳定状态。如果线粒体与网络非选择性融合，我们预计会看到GFP信号的均匀分布和稀释。然而，在32%的INS1细胞中，线粒体亚群未能稀释其活化的mtPA-GFP，并且携带了在光转换后立即测量的相同GFP FI(n个=22). 在原代小鼠β-细胞中也获得了类似的结果（60%，n个=10;图1D). 在每个细胞中检测到的明确的非融合线粒体结构的数量为3.1±1.1。这表示实验开始时标记的线粒体群体中非融合线粒体的数量。（因此，如果每个细胞正常化，则每个细胞的线粒体数量将达到～20个。）

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一部分线粒体的融合能力降低。(A类)用mtPA-GFP（绿色）转导INS1细胞并用TMRE（红色）染色。mtPA-GFP分布在光活化后立即显示（2分钟内）（用虚线方框表示的面积），并在mtPA-GFF扩散的平台阶段显示（45分钟）。未出现GFP FI衰减（小于5%）的线粒体用箭头标记。上标尺，10μm；下标尺5μm。(B类)融合事件导致mtPA-GFP在线粒体群体中扩散，导致其稀释和GFP FI值下降(n个=16). (C类)非融合线粒体和融合线粒体之间TMRE FI的相对差异，根据全细胞平均值进行校准。(D类)表达mtPA-GFP的初级β细胞在七个不同区域（正方形）被光激活，并在2分钟后和培养2小时后再次成像。比例尺，10μm。*P（P）<0.001。

与平均细胞Δψ相比米经TMRE FI测定，非融合线粒体去极化。定量分析发现TMRE FI降低26%±5.3，相当于7.8±1.6 mV(图1C;P（P）<0.001，未配对t吨-测试）。

聚变和裂变是成对的连续事件

为了确定分离是去极化的上游还是下游，我们描述了非凋亡INS1和COS7细胞中线粒体的生命周期。用mtPA-GFP标记和追踪单个线粒体，以绘制融合和裂变事件的时间图(图2). 聚变和裂变是成对的，最常见的是聚变之后是裂变(图2A和B). 累积概率分析表明，聚变触发裂变，但裂变对随后聚变的时间没有影响(图2C和D). 在INS1和COS7细胞中，我们发现线粒体的大部分时间是在裂变后“单一状态”（定义为从裂变到融合的时间间隔）中度过的，而在融合后“融合状态”中只有5.4-7.2%的时间（定义为融合和裂变之间的时间隔隔）。

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随着时间的推移，追踪单个线粒体，可以发现融合和裂变是成对的。(A类)一种表达mtPA-GFP并与TMRE联合标记的INS1细胞。两个线粒体在光激活后20秒融合（如“20秒”箭头所示）。然后，在两极之间建立电压差（60–120秒），然后将其物理分离（120秒）。该模式在性质上与图3Bi.比例尺，2μm。(B类)单个线粒体的融合和裂变时间图。用mtPA-GFP标记的单个线粒体被监测1小时，并记录融合和裂变的发生。INS1和COS7细胞中的线粒体分别在融合后、连接状态下花费77秒（±71秒）和87秒（±78秒），在孤立、分裂后状态下平均花费1434秒和1172秒。(C类)核聚变引发裂变。聚变事件发生后不同间隔裂变事件发生的累积概率（给定时间间隔后发生的所有裂变事件的分数）。数据拟合为双曲线函数，表示两个事件（INS1，对2=0.98; COS7、，对2=0.96). 直线显示了预测的裂变事件概率随时间的线性增长率，如果裂变独立于聚变事件发生，则可以预期该增长率（虚线INS1，对2=0.77; COS7、，对2=0.84; 看见补充数据). (D类)裂变不会引发聚变。裂变事件发生后不同间隔发生聚变事件的累积概率。数据点拟合成线性关系(对2=0.92），如果聚变独立于裂变发生（分别为0.05和0.06%/秒；参见补充数据).

聚变和裂变过程中的膜电位变化

使用mtPA-GFP和TMRE对单个线粒体进行双重标记，以确定单个裂变事件的生物能量分布(图3A). 为避免成像伪影和激光引起的损伤而采取的措施的详细描述见补充数据利用单个线粒体的TMRE和mtPA-GFP之间比率的变化来计算Δψ的偏差米如前所述(细枝等, 2006). 我们发现在两次聚变-裂变事件之间的间隔期间，Δψ米INS1和COS7线粒体均稳定；记录期的95%花费在平均基线的±2.7 mV范围内(图3C;补充图S1). 在裂变过程中，mtPA-GFP分子在两个子线粒体之间重新分配和平衡，GFP FI与裂变前线粒体相似（Δ裂变前后=2.2±1.2%；Δ女儿1和2=1.6±1.1%). 然而，裂变事件发生后，Δψ立即发生巨大变化米已测量(图3A-C). 我们在48次裂变事件中观察到以下模式：

  1. 在85%的裂变事件中，与裂变前电位相比，一个子线粒体去极化（标准=2 mV）达到最大振幅+5.9±3.7 mV，而另一个子线粒体超极化（标准=2 mV）到最大振幅−6.5±3.8 mV(图3Bi). 在22%的裂变事件中，裂变后去极化阶段持续不恢复(图3Bii). 对去极化装置进行了额外的10-30分钟跟踪。费希尔的单侧概率分析表明，这种模式(图3Bii)Δψ的米在中没有优先发生更改从头开始裂变事件与聚变事件之后的事件相比(P（P）=0.34).
  2. 在4%的裂变事件中，一个女儿有类似的Δψ米在裂变之前，另一个子粒子超极化(图3Bii). 在这些情况下，相对于细胞平均Δψ，母亲线粒体相对去极化7–10 mV米。这些模式与从头开始裂变，而不是在聚变之前（双面，P（P）=0.049).
  3. 在11%的裂变事件中，两个子体的Δψ没有变化米.

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单个裂变事件的代谢结果。(A类)COS7细胞中的线粒体分裂产生两个子线粒体，TMRE/GFP FI比率差异为～28%（～Δ=9 mV）。相对GFP FI变化最小（Δ=3.4%）。为了清楚起见，显示了裂变前60秒和裂变后160秒的伪彩色比。比例尺，2μm。(B类)Δψ图米随着时间的推移，典型裂变事件；（i） 裂变导致一个单位的暂时去极化，（ii）裂变导致一单位的永久去极化；（iii）裂变导致超极化子线粒体和分裂前电位的线粒体的产生。(C类)平均Δψ米裂变前（左，灰色）和裂变后（右，实心和空心圆圈分别表示去极化和超极化线粒体）。只有裂变事件，其中Δψ米包括两个线粒体的连续追踪(n个=7）。

测试并排除了观察到的去极化的潜在机制：

  1. 裂变过程中产生孔隙；未观察到mtPA-GFP泄漏；
  2. ATP合成酶活性增加；用1μM寡霉素观察到去极化，n个=4;
  3. 降低燃料可用性或克雷布斯循环功能；在膜透性燃料琥珀酸甲酯存在下观察到去极化，n个=3;
  4. 渗透率过渡孔的开口；用1μM环孢素A观察到去极化，n个=4;
  5. 线粒体移位（从核周到质膜下，反之亦然；参见补充数据);
  6. 自噬体吞噬子代线粒体（AP）；自噬发生在去极化后数小时，当自噬被抑制时，去极化线粒体更频繁(补充图S4; 图7E）。

去极化的女儿线粒体不太可能融合

测试裂变引起的Δψ变化米安排随后的融合事件，我们跟踪去极化和超极化子体并记录随后的融合过程(图4). 超极化子线粒体在裂变后3分钟内融合的概率是去极化子线粒体的6倍，裂变与融合之间的平均时间间隔为105秒（范围为40–620秒；n个=8). 这些事件的典型示意图如所示图4AFisher的双侧概率分析表明，去极化的子线粒体在裂变后150秒内发生融合的概率要低得多(P（P）=0.03). 在两个实验中，用Δψ去极化线粒体米电池Δψ以下9–10 mV米观察到平均值发生裂变，并产生一个超极化子体，随后进行融合（数据未显示）。

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聚变-裂变事件的后果。(A类)四个不同实验（i–iv）中线粒体追踪的示意图和相应的Δψ米痕迹（iv）。彩色箭头表示裂变期间超极化（红色）和去极化（绿色）子体的生成。请注意，裂变事件后，融合（黑色箭头）最好发生在超极化子线粒体中。(B类)去极化线粒体在数小时的时滞后选择性地靶向自噬。AP用LC3:GFP标记，后者从胞浆转运到AP的隔离膜。MTR是一种膜电位染料，可对线粒体进行不可逆染色，并在去极化过程中保留。在检测APs含量之前，MTR用于在不同时间点对INS1细胞（14分钟，50 nM）中的线粒体进行脉冲标记。在设定的检测时间，用胃蛋白酶抑制素A（10μM）和E64d（10μM）处理细胞30分钟，以阻止AP内的消化，然后进行共焦显微镜检查（见材料和方法的示意图）。MTR脉冲用于报告Δψ米在染色期间。虽然AP外的线粒体显示出明亮的MTR荧光，但位于AP内的线粒体的荧光随MTR脉冲时间的不同而变化。请注意，如果在检测到自噬前1小时用MTR脉冲处理AP内的线粒体，则线粒体的MTR FI变暗（圆形，顶部面板），但如果在检测出自噬之前24小时脉冲处理，线粒体的MTR-FI变亮（圆形，底部面板）。比例尺，10μm。(C类)MTR FI的分布（以Δψ给出米)在自噬之前的不同时间内，AP-磷酸化线粒体的数量增加。值是相对于单元格的平均MTR FI。在x个-轴，零值表示平均Δψ米正值代表去极化线粒体。

Δψ米去极化发生在自噬前数小时

以前有人认为代谢受损的线粒体最好是通过自噬来靶向的(埃尔莫尔等2001年;普里奥等, 2005). 去极化和自噬之间的时间间隔表明早期AP的隔离膜是否有助于去极化子线粒体的分离及其融合概率的降低。在存在或不存在蛋白水解酶抑制剂E64d和胃蛋白酶抑制素A的情况下，对线粒体、溶酶体、AP和自噬体（晚期AP）进行成像。我们发现，除非药物阻止晚期AP含量的消化，否则很少捕捉到带有AP标记物的线粒体共定位(补充图S2). 晚期AP蛋白水解的抑制导致15–30个AP在30分钟内积累，表明AP的周转率高，自噬开始后线粒体快速清除(补充图S2).

为了揭示线粒体在自噬开始之前或之后是否去极化，我们测定了Δψ米自噬前不同时间点的自噬细胞线粒体(图4B;补充图S10). Δψ米通过用Δψ脉冲细胞来确定米-依赖性染料，丝裂原追踪红（MTR），在不同的时间点。在检测到自噬前24小时脉冲标记的线粒体有明亮的MTR染色，表明Δψ完整米在染色期间(图4B和C). 然而，那些在检测到自噬前1–3小时脉冲处理的人的MTR染色较暗，表明去极化发生在吞咽前一个或多个小时。为了确定MTR本身不会诱导或抑制自噬，在用MTR处理24小时的INS1细胞中测试了MTR对LC3-I转化为LC3-II（自噬激活标记）的影响。MTR在上述实验所用浓度下对自噬没有影响（数据未显示）。为了验证观察到的LC3:GFP聚集物是由AP形成的，并不代表表达伪影，用自噬抑制剂3-MA处理LC3:GFP表达细胞，并对聚集物进行量化。在这些条件下未观察到骨料。

以下观察结果也支持了这一事件序列：（a）用Δψ降低追踪单个线粒体50分钟后米，如果这些单位被消耗和消化，则mtPA-GFP强度不会像预期的那样降低(补充图S3)和（b）抑制自噬并不会导致去极化线粒体的恢复，而是导致其积累，如INS1所示（图7E，n个=6），MEF(补充图S4C,n个=10）或大鼠肝脏H4(补充图S4A,n个=5). 总之，这些结果表明，去极化子体的融合能力不太可能因AP吞没而降低。

OPA1减少是非融合和自噬细胞线粒体的特征

去极化和自噬之间的长时间间隔表明，线粒体在自噬之前作为非融合线粒体度过了很长一段时间。因此，假设在自噬之前，线粒体可能会因融合蛋白如OPA1的降解而失去融合能力。为了验证这个假设，我们对非融合线粒体进行了免疫反应性研究(图5A)和AP内线粒体的(图5B). 为了测定非融合线粒体中OPA1的蛋白水平，表达mtPA-GFP和mtDsRed的细胞进行融合分析，如图1A在光转换后2小时，细胞被固定、渗透并使用OPA1 C末端的单克隆抗体进行免疫染色（hOPA1中的氨基酸708–830；阿罗毗等, 2007). 非融合线粒体是指那些在2–3小时内未将其光转换mtPA-GFP与未标记线粒体平衡的线粒体，因此其GFP FI比同一细胞中的平均线粒体高出两倍以上。测定了OPA1与mtDsRed的比值，并在线粒体中降低，线粒体保持高强度的mtPA-GFP(图5A)表明非融合线粒体的特点是OPA1免疫反应降低。接下来，我们测定了AP内线粒体的OPA1免疫反应性(图5B). 在表达LC3:GFP和基质蛋白mtDsRed的细胞中，使用胃蛋白酶抑制素A和E64d抑制蛋白水解活性2–4小时，这两种蛋白都是通过慢病毒转导引入的。基质蛋白mtDsRed和LC3:GFP的完整荧光验证了抗蛋白水解活性的有效性。与AP外的线粒体相比，AP内的线粒体显著降低了OPA1免疫反应性(P（P）=0.003），但mtDsRed FI不变(P（P）=0.38). 为了控制部分蛋白水解酶活性可能产生的潜在伪影，我们重复了这次实验，用巴非霉素抑制溶酶体V-ATP酶，这抑制了溶酶体与早期AP的融合，并保留了AP内的线粒体形态（对于巴非霉素经处理的AP的电子显微镜，参见补充图S8). 在这些条件下观察到OPA1免疫反应的类似降低(P（P）<0.001；图5B).

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AP内非融合线粒体和线粒体OPA1水平降低。(A类)INS1细胞线粒体OPA1的相对免疫荧光与融合能力相关。单元格(n个=6）被光激活（约占细胞线粒体质量的10–15%），然后在固定前返回培养箱2小时。根据线粒体分享并稀释光转换mtPA-GFP的能力，线粒体被分类为融合线粒体(n个=54）其中GFP FI低于平均值的2倍且未融合(n个=10）其中GFP FI至少比平均值高200%（以与所述相同的方式图1). 在每个细胞中，未融合线粒体的OPA1 FI被归一化为通过融合稀释mtPA-GFP的线粒体的OPA1FI。非融合线粒体OPA1 FI降低(P（P）=0.003）。显示了一组mtPA-GFP、mtDsRed和OPA1免疫染色的FI编码图像。比例尺，2μm。(B类)OPA1 FI，而不是mtDsRed FI，在经历自噬的线粒体中减少。表达mtDsRed和LC3:GFP的INS1细胞用0.2μM巴非霉素（45分钟）或胃蛋白酶抑制素a和E64d的混合物（90分钟）处理并固定。通过mtDsRed和LC3:GFP的共定位来定义AP内的线粒体。APs中的OPA1 FI被归一化为位于APs外的线粒体中的FI（mtDsRed阳性的细胞器和阈下GFP FI）。AP中的OPA1 FI为50%(*P（P）<0.001）和54%(**P（P）=0.003）。AP内的线粒体与位于AP外的线粒体具有相似（96%）的mtDsRed FI(P（P）=0.47). 比例尺，2μm。(C类)OPA1过度表达对含AP线粒体数量的影响。在用OPA1过度表示或对照（mitoPA-GFP）的腺病毒转导后48–72小时，对已经表达LC3:GFP和mtDsRed的INS1细胞进行成像。OPA1过度表达（OE，n个=6）归一化为对照(*P（P）=0.001). 图片显示了每组具有代表性的细胞。红色，mtDsRed；绿色，LC3:GFP。在对照细胞中，注意AP与线粒体的共定位。比例尺，10μm。

为了确定观察到的OPA1减少是否有助于线粒体对AP的靶向性，在稳定表达LC3:GFP和mtDsRed的INS1细胞中用腺病毒转导OPA1过度表达。在APs内的蛋白水解被药物阻止1小时的条件下，通过计数含有线粒体的APs来确定线粒体自噬。与转染mtPA-GFP腺病毒的对照细胞相比，OPA1-过表达细胞中的线粒体吞噬减少了64%(图5C,P（P）<0.001). AP总数无显著差异（每个细胞的AP：对照组，47.4±19；OPA1 OE，35.1±21）。如前所述，OPA1过度表达可导致线粒体大小减少或增加(奇波拉特等, 2004;格里帕里克等, 2004;陈等, 2005). 与MEF细胞类似，INS1细胞中OPA1的过度表达导致线粒体大小普遍但相对均匀的减小，而线粒体融合活性保持不变(陈等, 2005). 这些观察结果排除了自噬减少完全是由于线粒体尺寸增加所致。

抑制分裂减少线粒体自噬

融合和自噬对Δψ的相互依赖性米提示线粒体分裂可能在线粒体与网络的分离和解偶联中发挥关键作用，从而使功能失调的子单位去极化和自噬。在表达低水平FIS1（线粒体分裂过程中的速率限制蛋白）的INS1细胞中，评估了分裂在线粒体自噬中的作用(Yoon公司等, 2003;冈本和肖，2005年)在表达显性负形式的裂变蛋白DRP1（DRP1）的细胞中K38A公司或DRP1-DN）。这两种病毒都是通过慢病毒转导引入的，并在感染后10天内进行了测试（参见补充图S5A和B;斯托扬诺夫斯基等, 2004). DRP1-DN的表达导致线粒体结构转变为具有扩大圆形末端的特征性细长小管（图7B；补充图S9). 影响FIS1系统线粒体形态上的RNAi较为温和，并通过形态计量分析进行了验证(补充图S5C). 抑制线粒体分裂导致含线粒体的AP数量减少(P（P）<0.001;图6A和B)但不包括含ER的AP数量(FIS1系统RNAi组，P（P）=0.51；图6C). 溶酶体总数(图6C)AP总数保持不变（DRP1-DN组：n个=11,P（P）=0.53;FIS1系统RNAi组：n个=12,P（P）=0.59).

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抑制分裂可减弱线粒体特异性自噬（线粒体吞噬）。(A类)的共焦图像FIS1系统RNAi、DRP1-DN和对照细胞共表达AP标记LC3:GFP（绿色），并用MTR染色（红色、对照和FIS1系统RNAi组）或mtDsRed（红色，DRP1-DN），并用胃蛋白酶抑制素A和E64d处理以阻止晚期AP的消化。放大的区域FIS1系统RNAi细胞显示有线粒体和无线粒体的AP（分别为白色和蓝色圆圈）。比例尺，5μm。(B类)INS1细胞表达AP的线粒体定量分析FIS1系统RNAi或DRP1-DN。在每一组中，含AP的线粒体的数量均与其对照组一致，并且发现存在显著差异(*P（P）<0.001;**P（P）<0.001). (C类)改变分裂不会损害内质网自噬和AP或溶酶体质量。表达LC3:GFP的INS1细胞用ER Tracker染色以评估含AP内质网。对照组和溶酶体中含AP的内质网数量没有显著差异FIS1系统RNAi细胞(P（P）=0.51;n个=11). 溶菌酶传感器染色（75 nM，30分钟）显示对照组和FIS1系统RNAi细胞(P（P）=0.21). DRP1-DN单元中的总AP数与对照相似(n个=11,P（P）=0.53）。

虽然线粒体自噬受到抑制，但隔离膜的组装和AP向晚期AP的传播不受FIS1系统RNAi，如（a）长期暴露于E64d和胃蛋白酶抑制素a（对照组24±5，FIS1系统RNAi 21±7），（b）从培养基中去除E64d和胃蛋白酶抑制素A后<1分钟内恢复AP消化（数据未显示），（c）对照组和对照组之间的溶酶体形成能力没有差异FIS1系统用溶酶体蓝色染料染色的溶酶体计数显示RNAi组(图6C;补充图S6)和（d）电子显微照片，显示通过蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制素A和E64d或溶酶体V-ATP酶抑制剂巴非霉素处理获得的早期和晚期AP的正常外观(补充图S8).

裂变缺陷线粒体氧化蛋白较多，活性氧较少

我们假设，抑制裂变将减少功能失调线粒体的分离和降解，从而导致受损线粒体蛋白质的积累。表达线粒体蛋白的细胞中线粒体蛋白氧化水平FIS1系统RNAi比对照组高1.7倍(图7A,n个=4). 在DRP1-DN处理的细胞中也发现了类似的效果，其中羰基化蛋白和硝基酪氨酸都积累(图7A和B). 为了测试后一项发现是由ROS过度生产引起的可能性FIS1系统使用二氢乙硫铵（DHE）评估RNAi细胞ROS生成(图7C). 表达FIS1系统正常培养条件下RNAi与对照RNAi的比较（11 mM葡萄糖；P（P）=0.50). 使用22 mM葡萄糖后，这种下降变得显著(P（P）<0.001). 这些结果表明，在裂变缺陷细胞中观察到的氧化蛋白增加是累积的结果，而不是过度产生损伤。为了测试抑制自噬是否影响线粒体中氧化蛋白的积累，我们用巴非霉素A1（0.1μM）抑制溶酶体和AP之间的融合，并测定羰基化蛋白(图7D). 用巴非霉素A1处理3小时后，线粒体中的氧化蛋白水平增加，早期AP的积累增加，LC3-II带增加。3-MA（2 mM，5天）抑制早期AP的启动，导致Δψ亚细胞异质性增加米和小的去极化线粒体的出现(图7E). 在两个自噬缺陷细胞系Beclin1 RNAi H4和ATG5−/−MEF细胞中观察到类似的作用(补充图S4A和C).

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抑制裂变或自噬导致蛋白质氧化损伤增加。(A类)线粒体中氧化线粒体蛋白的水平FIS1系统RNA干扰(n个=3），DRP1-DN(n个=4）及其各自的控制单元。印迹检测氨基酸侧链上的羰基（Oxiblot分析，见材料和方法）。负荷控制CIII，线粒体复合物III核心I(*P（P）<0.03,**P（P）<0.04). (B类)将共表达DRP1-DN和mtDsRed（红色）的COS7细胞固定、透化并用抗硝基酪氨酸的单克隆抗体染色（绿色）。对照细胞感染mtPA-GFP慢病毒。DRP1-DN细胞线粒体中硝基酪氨酸免疫反应增强，尤其是在远端和扩大端。比例尺，15μm（另请参见补充图S9). (C类)击倒FIS1不会增加ROS产量。ROS生产FIS1系统DHE FI在不同葡萄糖水平下测量RNAi和对照细胞。用染料负载细胞，在改变葡萄糖浓度前和10分钟后测量FI（NS，无显著性；P（P）=0.5；*P（P）<0.001). (D类)自噬的抑制会导致蛋白质氧化损伤的增加。用巴非霉素处理INS1细胞（通过阻止与溶酶体融合来阻止自噬，0.1μM持续3小时）会导致线粒体中氧化蛋白的积累，这表现为分离线粒体中羰基化氨基酸的水平增加(E类)抑制自噬产生Δψ米异质性。用3-MA处理INS1细胞（2 mM处理5天），然后用TMRE和丝裂原追踪绿染色。红/绿比值图代表Δψ米在去极化线粒体呈蓝色的地方显示为假彩色。注意亚细胞Δψ的增加米异质性和低TMRE去极化单元的外观（另见补充图S4A–C). 比例尺，5μm。

FIS1敲除影响新陈代谢和胰岛素分泌

通过测量细胞耗氧量来评估裂变减弱和线粒体自噬减少对线粒体呼吸功能的影响(图8). 添加解偶联剂FCCP（5μM）或DNP（100μM）以崩塌Δψ米并评估细胞的最大呼吸能力。发现INS1细胞表达FIS1系统RNAi或DRP1-DN减少48%(n个=4）和32%(n个=4），分别(P（P）两组均<0.001）(图8A). RNAi抗性的过度表达FIS1系统与一起FIS1系统RNA干扰(n个=3）将最大呼吸恢复到表达对照RNAi的INS1细胞的相同水平(n个=3,P（P）=0.72).

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代谢改变伴随着裂变和自噬减少。(A类)FIS1和DRP1基因敲除降低了FIS1系统RNAi和DRP1-DN与对照组比较(n个=每组4个；葡萄糖=11 mM）。3-MA对INS1细胞自噬的抑制作用（2 mM，5天，n个=4）和C2C12细胞（1 mM，5天，n个=4）呼吸能力显著下降。ATG5缺乏的MEF细胞(n个=4）与对照MEF细胞相比，呼吸能力显著降低。使用5μM FCCP或100μM DNP测试最大呼吸(*P（P）<0.001,**P（P）<0.04）。(B类)线粒体DNA编码的细胞色素氧化酶亚基I（COX I）在感染INS1细胞中的表达FIS1系统RNAi和控制RNAi慢病毒，并在1周后进行测试。(C类)GSIS输入FIS1系统RNAi和对照RNAi细胞(n个=每列5，*P（P）<0.05). 数值标准化为每个孔中的细胞数，表示30分钟的刺激。

为了确定FIS1敲除是否影响线粒体蛋白质合成，我们测量了线粒体DNA编码的COX亚单位I的表达水平。我们发现FIS1敲低10天对亚单位I的表达没有影响(图8B). 抗凋亡作用FIS1系统经验证，RNAi治疗可排除技术伪影作为代谢表型的原因(补充图S7).

为了确定自噬减少本身是否会影响OXPHOS活性，对INS1细胞、C2C12细胞和MEF细胞的耗氧量进行了监测，其中自噬受到两种不同机制的抑制。INS1细胞在5天内用2 mM 3-MA抑制自噬，将最大呼吸降低至对照条件的～50%(P（P）<0.001,图8A). ATG5是组装AP隔离膜的基本组件(皮奥等, 2005). ATG5缺乏的MEF细胞最大呼吸减少约40%(图8A). 用3-MA（1 mM）处理C2C12小鼠成肌细胞后，最大耗氧量减少了约16%(P（P）=0.04).

此处使用的INS1细胞来源于大鼠胰岛素瘤（胰腺肿瘤β细胞），其特征是胰岛素分泌和葡萄糖浓度在2–10 mM范围内呈线性关系(霍梅耶等, 2000). 在基础葡萄糖浓度（2 mM）下FIS1系统RNAi和对照RNAi细胞(n个=5,P（P）=0.57;图8C). 将培养基葡萄糖浓度升高至8 mM可增加两种细胞类型的胰岛素分泌(P（P）<0.001;图8C). 然而，在FIS1系统RNAi葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）的幅度小于对照RNAi细胞(n个=5,P（P）=0.02).

讨论

本研究提出了线粒体动力学作为控制线粒体周转的质量控制机制的假设。它表明，融合触发裂变，融合是一个选择性过程，共同导致重复过程，将活性较低的线粒体从网络群体中分离出来。通过以下方式抑制聚变和裂变循环的发生FIS1系统RNAi或DRP1-DN可阻止线粒体自噬和受损线粒体物质的积累，导致代谢功能和胰岛素分泌下降(图9). 线粒体动力学和自噬之间的联系可以从两个方面得到证明：一方面，裂变是产生去极化线粒体的事件；减少分裂或增加融合抑制线粒体自噬。另一方面，AP内的线粒体被发现失去了OPA1和Δψ米在被AP瞄准之前，有两个特征，这将使它们无法融合。

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线粒体生命周期模型，整合线粒体动力学和周转。线粒体在融合后状态（网络）和分裂后状态（孤立）之间循环移动。聚变是短暂的，会引发裂变。裂变事件发生后，子线粒体可能保持完整的膜电位（红线）或去极化（绿线）。如果它去极化，除非它再极化，否则不太可能进行后续融合。在去极化和孤立几个小时后，线粒体通过自噬被清除。

线粒体融合是选择性的

融合被确定为使用两种不同方法的选择性过程。首先，通过mtPA-GFP的光活化标记一组线粒体。发现一个亚群未与未标记单位交换mtPA-GFP(图1). 其次，对线粒体分裂的子代进行追踪，发现其进行后续融合的概率不相等(图4). 在这两种情况下，Δψ的水平相似米非融合线粒体出现去极化。

虽然先前的研究已经证明解偶联药物会导致线粒体整体断裂并阻止融合(勒格罗斯等, 2002;石原等, 2003;梅森等, 2004;马尔卡等, 2005)这些观察结果与未扰动细胞融合的相关性尚未得到解决。本研究首次在活细胞中证明，线粒体融合优先发生在Δψ较高的线粒体之间米，并产生一个分离的非融合线粒体亚群。此外，这些结果表明，Δψ米影响融合的流行。因为每个融合的线粒体都需要完整的Δψ米为了实现矩阵融合，这个过程不太可能拯救Δψ改变的功能失调单元米然而，融合过程的选择性并不排除线粒体融合是线粒体间代谢物和线粒体间线粒体DNA与完整Δψ的互补途径的观点米(中田等2001年).

相反，Δψ米抑制融合时受到影响(奥利康等, 2003;陈等, 2005)表明熔合能力降低可能是Δψ的原因或结果米去极化。这里提出的实验得出结论，去极化在裂变之后立即发生，而不是作为聚变能力降低的延迟结果。Δψ的稳定性米如本文所述，除裂变后立即期外，所有时间的单个线粒体，进一步支持这样的结论，即在一小时内减少融合不会损害单个单位的生物能量参数。

OPA1作为选择性融合机制

除了减小了Δψ米，非融合线粒体的特征是OPA1免疫反应性的缺失，这为融合能力的降低提供了可能的解释(图5). 最近，一个原核引起了Δψ的完全坍缩米整个细胞线粒体的蛋白质水解断裂或OPA1长（1-）异构体的降解(格里帕里克等, 2004;杜维津·考贝特等, 2006;石原等, 2006;歌曲等, 2007). 在这里，我们表明，完整细胞中单个线粒体的微小和生理去极化伴随着OPA1水平的降低和融合能力的降低。这些结果进一步强调，完整细胞内单个线粒体中OPA1的缺失可能会阻止融合和代谢互补，即使周围有融合活性线粒体(图1). OPA1蛋白水解对ATP浓度的依赖性可以解释Δψ的微小变化米可能导致核聚变能力大幅下降(赫尔兰等, 2004). 考虑到14 mV的去极化可使ATP合成降低10倍(尼科尔斯，2004)在非融合线粒体中发现的～7 mV去极化可能通过ATP耗竭或OPA1的处理改变融合。

本研究中，在非融合线粒体中观察到的OPA1染色减弱主要反映了OPA1的降解，而不是其蛋白水解裂解，因为此处使用的抗体针对l-和s-亚型的共同区域。这一发现与歌曲等(2007)表明完全降解（而非蛋白水解裂解）是OPA1长亚型（剪接1和2）加工的主要途径，因此可能低估了OPA1长异构体的实际损耗。

单次裂变事件的代谢后果

我们发现线粒体裂变导致Δψ的预测性和不对称变化米两个女儿(图2和​和3）。三). 这是第一次测量单个裂变事件的代谢后果。它首次证明，尽管线粒体网络允许基质和膜成分的扩散和平衡，但裂变导致代谢不平衡子体的分离。裂变事件的不对称性质可能在引导线粒体网络的不同片段走向不同的命运以及赋予任何类型的分类机制功能特异性方面发挥作用。

不均匀Δψ背后的许多潜在机制米排除了子线粒体，包括PTP开放、膜完整性破坏和ATP合成酶活性增加。虽然机制尚待解决，但EM对细胞进行的研究发现，用药物处理后，细胞立即发生广泛的线粒体断裂，相邻片段具有不同的嵴结构，这表明线粒体的分裂可能产生膜结构不均匀的子代(巴尔苏姆等, 2006).

自噬是否阻止去极化子单位的后续融合？

去极化线粒体进入连续融合的可能性降低，增加了融合被形成AP的隔离膜阻止的可能性。

我们的观察表明，在缺乏应激相关死亡信号的情况下，线粒体在被AP的隔离膜吞噬前数小时会去极化(图4). 这表明自噬对观察到的子单位去极化或其与融合人群的分离没有贡献。据报道，线粒体去极化和与溶酶体共定位之间的时间间隔为～20分钟(埃尔莫尔等2001年). 然而，Elmore及其同事估计的时间间隔是在自噬诱导物（饥饿和胰高血糖素）和溶酶体而非AP分离膜标记物的检测下测量的。

自噬靶向线粒体和非融合线粒体OPA1免疫反应性降低(图5)在去极化、融合能力降低和自噬清除之间提供了潜在联系。OPA1过表达减少线粒体自噬的能力表明，OPA1在决定线粒体命运中起着作用。这可能是直接的，通过阻止AP靶向，也可能是间接的，通过提高生物能量效率或增加线粒体融合概率，导致更均匀的网络和减少去极化线粒体产生的机会。

线粒体分裂对自噬至关重要

这项研究和其他研究表明，去极化线粒体是自噬的靶点。我们在这里表明，去极化线粒体的主要来源是裂变事件。总之，这些观察结果增加了裂变可能对线粒体自噬至关重要的可能性。

事实上，裂变的抑制导致线粒体自噬的抑制，而不是内质网自噬(图6). AP的形成、溶酶体的质量、自噬体的生成及其内容物的消化均不受影响。我们的结论是，线粒体自噬在组装隔离膜之前受到抑制，并暗示线粒体分裂是线粒体周转的介体。然而，裂变在减少线粒体大小中的作用可能只是允许的，不太可能作为自噬的触发因素，因为我们发现抑制线粒体自噬作用的OPA1的过度表达伴随着线粒体网络的分割，正如其他人所报道的，在INS1细胞中观察到的那样(格里帕里克等, 2004;陈等, 2005).

总之，线粒体分裂是子线粒体的偶然产生者，其特征是自噬细胞线粒体中发现的三个特征：Δψ减少米OPA1减少，尺寸减小。在被自噬靶向之前，这些线粒体的融合能力降低，不太可能通过融合进入极化网络(图9).

线粒体动力学与胰岛素分泌

糖尿病模型中观察到的GSIS缺陷与线粒体功能障碍密切相关，特别是与异常呼吸链活动有关(梅克勒等, 1999;洛厄尔和舒尔曼，2005年). 裂变抑制降低了最大呼吸链容量，这一观察结果可以解释GSIS的抑制(图8)以及FIS1系统RNAi细胞。

在缺乏活性氧增加的情况下线粒体氧化蛋白的积累FIS1系统RNAi细胞表明抑制裂变导致线粒体周转减少(图7). 这与通过自噬去除线粒体被阻止的实验一致，导致呼吸链活性的相应降低。ATG5−/−成纤维细胞和用自噬抑制剂3-MA处理的细胞，这两种自噬抑制机制不同的细胞模型，被发现呼吸能力降低，类似于FIS1系统RNAi和DRP1-DN处理的细胞。这与对成纤维细胞的研究一致，在成纤维细胞中，3-MA或靶向自动液位计7导致线粒体堆积，Δψ降低米前者和后者线粒体形态的改变(Stroikin公司等, 2004;小松等, 2005). 然而，需要进行额外的研究来确定FIS1系统RNAi和DRP1-DN诱导自噬抑制受损线粒体蛋白的积累和线粒体功能障碍。

这里描述的分裂、选择性融合和自噬的结合可能代表了线粒体群体的质量控制机制(图9). 为什么这种机制在某些情况下不能对抗功能失调的单位或促进呼吸受损的线粒体，目前尚不清楚。质量控制机制的缺陷将导致功能的渐进性、多样性和损伤依赖性下降，如代谢性疾病和衰老。在这种情况下，这里提出的质量控制检查点可能为在裂变受阻的细胞中观察到的诱导衰老提供了一种潜在的机制(Yoon公司等, 2006;李等, 2007).

材料和方法

动物

选用12周龄雄性C57BL6小鼠。

胰岛分离、原代细胞和细胞系培养

如前所述，对岛屿进行隔离、分散和电镀(心脏等, 2006).

细胞系

用pEF321-T转染的ATG5+/+和ATG5−/−小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），以及SV40大T抗原表达载体是水岛核电站的慷慨馈赠，之前已进行过描述(库马等, 2004).

DNA质粒，构建物

构建传递mtPA-GFP、DRP1-DN、pWPI、，FIS1系统shRNA、对照shRNA、LC3:GFP、mtDsRed和OPA1 OE在补充数据.

共焦显微镜

使用蔡司LSM 510 Meta显微镜进行共聚焦显微镜。有关成像协议和成像伪影控制的详细描述，请参阅补充数据.

ROS生成的测量

在37°C下，用1μM DHE（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）加载细胞20分钟。使用Metamorph成像软件（Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA）对图像进行分析。

哦2消费

INS1（表达DRP1-DN）和C2C12细胞中的耗氧量通过XF24生物能量分析（Seahorse Bioscience，Billerica，MA，USA）进行测量。之前已详细描述过检测(吴等, 2007)并在补充数据.

INS1中的耗氧量（表示FIS1系统RNAi）和ATG5 MEF空细胞的测量如前所述(科基等, 1986)（请参见补充数据).

免疫染色

细胞用4%多聚甲醛固定15分钟，洗涤，在0.5%Triton-X中渗透15分钟，清洗，用1%BSA/PBS封闭15分钟，与一抗孵育1小时，洗涤，与二抗孵养1小时，用mowool贴装介质洗涤和贴装。所有清洗均采用PBS，所有程序均在室温下进行。使用了以下主要抗体：OPA1（BD，美国，猫号612606；1:100）和抗硝基酪氨酸（Upstate，MA；1:500）。次级抗体来自Zymed（Invitrogen，Carlsbad，CA）。

INS-1细胞的胰岛素分泌

如上所述执行上述程序(诺埃尔等, 1997)（另请参见补充数据).

蛋白质氧化检测

使用线粒体分离试剂盒（Pierce，目录号89801）进行线粒体分离，然后使用Oxyblot™蛋白质氧化检测试剂盒（Chemicon International）（见补充数据).

统计学

除非另有说明，否则误差条表示SD和未配对t吨-测试用于验证统计差异。

补充材料

补充数据

单击此处查看。（170万，pdf）

补充数据

单击此处查看。（257K，pdf）

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health Grants）5R01HL071629-03、R01 DK074778和P41 RR001395以及NSF拨款DBI-0215829的支持。我们感谢所罗门·格拉芙（Solomon Graf）、以色列·比兰（Israel Biran）、达尼·达根（Dani Dagan）、罗兰·里尔（Roland Lill）、大卫·尼科尔斯（David Nicholls）、埃里克·肖恩（Eric Schon）、吉奥基·哈伊诺茨基（Gyorgy Hajnoczki）、戈登·亚尼（Gordon Yaney）、基斯·托尼姆（Keith Tornheim）、尼卡·丹尼尔（。我们感谢MBL的彼得·史密斯（Peter Smith）和路易斯·克尔（Louis Kerr）以及蔡司的克雷格·拉斯西（Craig Lassy）对共焦显微镜研究的支持。

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