Atg1激酶复合物参与调节蛋白质募集以启动非特异性自噬的闭锁囊泡形成酿酒酵母

菌株和质粒

这个酿酒酵母本研究中使用的菌株列于表1通过在相应染色体位点整合修饰基因来标记蛋白质，并通过基于聚合酶链反应（PCR）的程序进行基因缺失(朗廷等。1998年). 对于基因破坏，整个编码区被替换为大肠杆菌kan^第页,波贝裂殖酵母HIS5,乳克鲁维酵母URA3,克鲁维酵母HIS3，或酿酒酵母TRP1,LEU2级，或URA3公司使用PCR引物对开放阅读框两侧的区域进行识别，该引物包含约40个碱基。Western blotting、PCR或两者都验证了假定的基因敲除和标记菌株。通过检测prApe1、绿色荧光蛋白（GFP）-Atg8或两者的处理，确认标记结构的功能。

pRS316 GFP-APG1质粒是Yoshinori Ohsumi博士（日本冈崎国立基础生物学研究所）赠送的礼物。表达GFP-Atg8[pGFP-Aut7（416）]的质粒如前所述(黄等。2000年). 为了整合GFP-Atg8，我们使用了一个基于pRS306的质粒，该质粒含有GFP-ATG8内源性基因自动液位计8发起人(铃木等。, 2001); 集成是在URA3公司轨迹。为了构建含有编码GFP的基因的三个串联拷贝的ATG17-3xGFP质粒ATG17型该基因经PCR扩增并连接到pRS306-3xGFP的ClaI–AgeI位点，如前所述(俄罗斯等。, 2001). 所得质粒用于酵母转化，以整合ATG17-3xGFP第17页染色体位点。这个atg1处^K54A公司和atg1处^M102A型前面描述了突变体(阿贝利奥维奇等。, 2003;卡马达等。2000年). 含有双点突变的质粒，atg1处^K54A、M102A通过基于PCR的定点突变产生。DNA测序用于验证突变。

对于酵母双杂交筛选，我们使用了一种N末端截短的Atg1，缺少激酶结构域（Atg1ΔN），如前所述，该结构域通过BamHI和SalI位点引入酵母双杂交诱饵载体pGBDU-C1(尤里米苏和克林斯基，2005a). 该版本Atg1的C末端缺失突变体（ΔC20）通过PCR产生，并使用相同的限制性内切酶位点克隆到pGBDU-C1中。pGBDU-C1质粒表达分别在878和885位用丙氨酸取代酪氨酸和精氨酸的点突变（Atg1^{Y878A、R885A})精氨酸和赖氨酸的谷氨酸分别位于885和892位（Atg1^{R885E、K892E})使用pGBD-Atg1ΔN构建物通过基于PCR的定点突变产生。全长Atg13（pAD-Atg13），如前所述(斯科特等。2000年)，被用作猎物。将每组诱饵和猎物质粒转化为菌株PJ69-4A，并通过在缺乏腺嘌呤的SD板上划线转化，检测其生长情况来分析相互作用。

为了生成本机Atg1的突变版本，我们从野生型开始在g1含有其内源性启动子和终止子的基因被克隆到pRS315[pATG1（315）；阿贝利奥维奇等。, 2003]其中在终止密码子之后引入了NheI位点。Atg1ΔC20，Atg1^{Y878A、R885A}和附件1^{R885E、K892E}每个突变都是从包含这些相应突变的pGBDU-C1载体克隆到pATG1（315）中，作为SphI–NheI片段。通过DNA测序验证了这些突变。这些构建物用于Pho8Δ60碱性磷酸酶分析以及荧光和电子显微镜分析。

对于蛋白A（PA）亲和性分离，在ATG起始密码子之后设计了一个BamHI位点的Atg1开放阅读框，通过PCR扩增并克隆为SpeI–SalI片段到pCu416载体(Labbe和Thiele，1999年). 使用来自质粒pTS480的BamHI片段上的PA标签来创建该结构的N末端PA标签版本，并通过监测prApe1在在g1表达该蛋白的Δ菌株。将含有Atg1ΔC20缺失或点突变的DNA片段作为SphI–SalI片段从pGBDU-C1载体中切除，并在用相同的酶组消化后用于替换PA标记结构中的野生型Atg1序列。

全长ATG13公司，包含其内源性启动子和终止子序列，被克隆到pRS315中(卡马达等。2000年). AvrII位点是通过定点突变引入的，在ATG13公司用含有XbaI位点的引物从3HA-Apg12（东京医科和牙科大学水岛Noboru Mizushima博士馈赠的礼物）中扩增出含有血凝素（HA）编码序列三个串联拷贝的DNA，并将其连接到AvrII位点，以创建3xHA与Atg13的N末端融合。用Western blotting和PCR验证该结构，并通过检测prApe1成熟度来分析其功能。HA-tagged Atg11已在前面描述(尤里米苏和克林斯基，2005a).

蛋白质A亲和力分离

细胞生长在50 ml SMD中，该SMD缺乏适合OD的营养缺陷氨基酸₆₀₀= 0.6. 添加雷帕霉素（0.2μg/ml；Fermentek，Jerusalem，Israel），并将细胞额外培养2 h。如前所述进行PA亲和性分离(他等。, 2006)，只有一个例外：细胞提取物与免疫球蛋白（Ig）G-Sepharose珠在4°C下孵育2 h。洗脱液通过6%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，转移到Immobilon聚偏二氟乙烯（IPVH00010；Millipore，Billerica，MA），并用单克隆抗HA抗体进行免疫印迹（Santa Cruz Biotechnology，CA）。

酶分析

如前所述，使用Pho8Δ60进行碱性磷酸酶检测，并使用HA标记的Atg1进行体外磷酸化检测(卡马达等。1995年;野田佳彦等。1995年). 如前所述，使用菌株PJ69-4A中的AD-Atg13和BD-Atg1变体进行β-半乳糖苷酶分析(玫瑰色等。, 1990).

Atg1和Atg13也是在饥饿条件下PAS招募Atg蛋白质所必需的

确认PAS招聘中的缺陷第11天Δ第17天Δ背景是由于Atg17功能的丧失，我们用表达Atg17或Atg17的质粒转化了该菌株^C24R型; 半胱氨酸在Atg17的24位突变为精氨酸，导致与Atg1和Atg13失去相互作用(卡贝亚等。, 2005). 野生型Atg17的出现恢复了第11天Δ第17天根据GFP标记的Atg1或Atg8（我们未公布的数据）的招募，Δ细胞在饥饿条件下组装PAS。相反，Atg17^C24R型没有补充PAS装配中的缺陷（我们未发布的数据）。Atg17是包含Atg1激酶和其他相互作用蛋白（包括Atg13）的复合物的一部分(卡马达等。2000年;不错等。, 2002). 因此，我们研究了Atg1和/或Atg13在类似于Atg17的非特异性自噬过程中是否在PAS组装中起作用。为了解决这个问题，我们首先在第11天Δ第13天Δ或atg1处Δ第11天Δ突变体。

与结果类似第11天Δ第17天Δ应变，Atg8或Atg1的PAS定位在第11页Δ第13天饥饿条件下的Δ双突变，而这些蛋白的PAS定位在第13天Δ单缺失菌株，可能是由于营养生长期间形成的Atg11-依赖性PAS的存在(图3和​和4，4、A和B）。类似地atg1处Δ第11天Δ突变体在胞浆中显示GFP-Atg8的扩散荧光信号(图3A和​和4A）；4A） ；我们不能在该菌株中使用GFP-Atg1标记，因为质粒表达的杂交蛋白补充了自动液位计1（我们未公布的数据）。因此，我们将Atg17-GFP作为另一个PAS标记物检测到atg1处Δ第11天Δ双突变株。在营养和饥饿条件下，Atg17-GFP信号在胞浆中扩散(图3C） ●●●●。总的来说，这些结果表明Atg1及其调节剂Atg13和Atg17在非特异性自噬期间PAS的形成中起着重要作用。

在单独的窗口中打开

图3。

在饥饿条件下，Atg蛋白的PAS募集需要Atg13和Atg1。GFP-Atg8（A）或GFP-Atg 1（B）的本地化第11天Δ（AHY001），第13天Δ（CWY233），atg1处Δ第11天Δ（TYY158），以及第11天Δ第13天Δ（CWY235）菌株和GFP-Atg17（C）atg1处Δ第11天Δ（TYY158）菌株通过荧光显微镜进行检测，如图1。

在单独的窗口中打开

图4。

在饥饿条件下，各种Atg蛋白的PAS募集需要Atg1及其调节剂Atg13和Atg17。使用荧光显微镜检查Atg蛋白的定位，如图1在转移至SD-N 2小时后，对含有PAS斑点的细胞数量进行GFP-Atg8（A）、GFP-Atg 1（B）、Atg14-GFP（C）和Atg16-GFP。ND，未确定。

尽管Atg8经常被用作PAS的代表性标记，但大多数Atg蛋白也被招募到该位点。因此，我们通过检测在自噬不同阶段起作用的功能基团的其他蛋白质来扩展我们的分析。GFP-Atg8是一种泛素样蛋白，其定位代表了Atg3、Atg4和Atg7的功能，这些都是Atg8正确翻译后处理所必需的。同样，Atg1定位部分反映了作为Atg1激酶复合体一部分的蛋白质，包括Atg13和Atg17。接下来，我们研究了Atg14和Atg16在饥饿条件下的定位。Atg14是磷脂酰肌醇3-激酶复合物I的一部分，其与Atg6/Vps30、Vps15和Vps34一起在自噬中发挥作用(木原等。, 2001). Atg16参与Atg12-Atg5结合系统，这是自噬体形成所必需的(库马等。, 2002). 与Atg8-GFP相比，Atg14-GFP和Atg16-GFP显示点状信号减少；在营养条件下，只有约20-30%的细胞表现出弱PAS点状（我们未发表的数据）。在这两种情况下，饥饿条件下的信号更强，在单一缺失菌株中PAS定位明显(图4、C和D）。当我们在第11天Δ第17天Δ,第11天Δ第13天Δ，或atg1处Δ第11天Δ双突变体在饥饿条件下，我们观察到PAS斑点明显减少，同时弥散细胞溶质染色增加(图4，C和D）类似于Atg8-GFP和GFP-Atg1的结果(图4、A和B）。总之，这些结果进一步表明，在非特异性自噬期间，PAS组织需要Atg1及其调节剂Atg13和Atg17。

Atg1激酶活性对Atg蛋白的PAS招募不是必需的，但对其正常定位是必需的

Atg13和Atg17调节Atg1激酶活性(卡马达等。2000年)但Atg1激酶活性在自噬或Cvt途径中的作用尚不清楚(奈尔和克林斯基，2005年). 相互矛盾的报道表明，较高的激酶活性在自噬中起着更重要的作用(卡马达等。2000年)或Cvt途径(阿贝利奥维奇等。, 2003;奈尔和克林斯基，2005年). 为了检测Atg1激酶活性在PAS形成中的潜在作用，我们决定使用激酶活性降低的Atg1突变形式，它结合了两个先前表征的突变等位基因。Atg1^K54A公司突变体的激酶活性位点发生了改变，但根据Pho8Δ60分析，其功能仍然较低(卡马达等。2000年;图5A） ●●●●。当结合102位蛋氨酸突变为丙氨酸时，Atg1^K54A、M102A双突变体显示的自噬活性水平与atg1处Δ应变(图5A） ●●●●。为了证实自噬活性的丧失与激酶活性的降低相对应，我们使用了体外激酶测定。表达HA标记的Atg1、Atg1的细胞^K54A公司和Atg1^K54A、M102A用0.2μg/ml雷帕霉素处理1.5小时。在天然条件下，用抗HA抗体对每个突变体的蛋白质提取物进行免疫沉淀，然后用髓鞘碱性蛋白作为底物分析免疫复合物的体外激酶活性(卡马达等。1995年). 与野生型Atg1对照相比，Atg1^K54A公司和附件1^K54A、M102A突变体的体外激酶活性几乎完全丧失(图5B） ●●●●。Pho8Δ60（而非激酶分析）显示两个Atg1突变体的活性存在差异；我们怀疑这反映了分析的性质，因为Pho8Δ60分析更具定量。

在单独的窗口中打开

图5。

自噬需要Atg1激酶活性。（A） Atg1突变体有自噬缺陷。监测非特异性自噬标记Pho8Δ60的碱性磷酸酶活性，以确定自噬活性水平。野生型（YTS159）和atg1处Δ（UNY1）菌株携带表达Atg1、Atg1的质粒^K54A公司（附件1^K（K）)，附件1^K54A、M102A（附件1^公里)或在缺乏营养缺陷氨基酸的SMD中培养空载体（pRS415），并将其转移到SD-N中4 h。收集样品并对蛋白质提取物进行碱性磷酸酶活性测定，如材料和方法.结果表示三个实验的平均值和SD。（B） Atg1突变体缺乏激酶活性。这个在g1表达HA-Atg1、HA-Atgl的Δ突变（WHY001）细胞^K54A公司，或HA-Atg1^K54A、M102A用0.2μg/ml雷帕霉素处理2 h。用抗HA抗体免疫沉淀每个突变体的提取物，然后按照材料和方法。

为了进一步研究Atg1激酶活性对自噬的影响，我们再次决定进行电子显微镜分析以获得形态学数据。包含atg1处Δ第四人民党Δ虚拟产品4Δ突变用表达Atg1、Atg1的质粒转化^K54A公司，或Atg1^K54A、M102A每个菌株在选择性培养基中生长到中对数期，转移到SD-N 4小时以诱导自噬，并通过电子显微镜进行检查，如材料和方法饥饿后，携带野生型Atg1的细胞在液泡内大量堆积自噬体，而携带空载体的细胞由于缺失自动液位计1(图6). 在含有Atg1激酶突变体的细胞中，与野生型相比，自噬体的总积累量显著减少。与Pho8Δ60分析结果一致，在表达Atg1的细胞中检测到少量尺寸缩小的自噬体^K54A公司突变，而在表达Atg1的细胞中几乎没有发现自噬体^K54A、M102A总之，这些结果表明，尽管Cvt途径需要较高水平的激酶活性，但Atg1激酶活性在自噬中起着重要作用(阿贝利奥维奇等。, 2003).

在单独的窗口中打开

图6。

Atg1激酶活性是自噬体形成所必需的。（A） Atg1突变体在自噬体积累方面存在缺陷。这个atg1处Δ（HCY76；第四人民党Δ第4版Δ）携带表达Atg1、Atg1质粒的菌株^K54A公司（附件1^K（K）)，附件1^K54A、M102A（附件1^公里)或在选择性培养基中培养空载体（pRS415），并将其转移到SD-N中4 h。用高锰酸盐固定细胞，并按照材料和方法（B）自噬体积累的定量。对每个菌株的50个切片进行评分，以确定自噬体在液泡中的积聚情况。

在确定了Atg1激酶突变体的表型后，我们现在可以提出一个问题，即Atg1酶活性是否参与自噬的启动，尤其是PAS的组装和/或Atg蛋白的招募。我们使用了atg1处Δ第11天带有GFP-Atg8或Atg17-GFP的Δ菌株整合在各自的染色体位点上，并表达Atg1或Atg1^K54A、M102A并进行荧光显微镜分析。正如我们在图2，GFP-Atg8或Atg17-GFP在atg1处Δ第11天饥饿条件下的Δ双突变菌株(图7A、 矢量）。野生型Atg1完全弥补了该菌株中GFP-Atg8或Atg17-GFP的PAS定位缺陷(图7A） ●●●●。同一细胞含有表达Atg1的质粒^K54A、M102APAS也显示出与GFP-Atg8或Atg17-GFP对应的强点状突起(图7A） ●●●●。这些数据表明，在诱导非特异性自噬的饥饿条件下，Atg8或Atg17的PAS募集并非绝对需要Atg1激酶活性。

在单独的窗口中打开

图7。

Atg1激酶活性对于Atg8和Atg17的PAS定位不是必需的，但对于这些蛋白质在饥饿条件下的正常定位是必需的。（A） 来自atg1处Δ第11天用编码Atg1、空载体或Atg1的质粒转化来自相应染色体位点的表达GFP-Atg8（HCY116）和Atg17-3xGFP（HCY119）的Δ菌株^K54A、M102A。细胞在SMD中生长，并在荧光显微镜前将其转移到SD-N中2 h，如所述材料和方法（B）为了量化PAS处的荧光强度，通过荧光显微镜观察A中每个菌株的30个单独细胞。荧光强度的相对百分比计算如下材料和方法并归一化为野生型Atg1细胞的值，该值设置为100%。误差条表示三个独立实验的SD。（C） 在饥饿条件下，PAS中Atg8的再分布受Atg1激酶活性的影响。这个atg1处Δ第11天从染色体位点（HCY116）表达GFP-Atg8的Δ菌株与编码质粒共转化自动液位计1^ts秒和附件1^K54A、M102A或自动液位计1^ts秒和空向量。细胞在24°C的SMD培养基中生长，并在温度变化之前转移到SD-N中1h。用于灭活Atg1^ts秒，将细胞移到37℃2 h，然后移回24℃2 h。用荧光显微镜检查细胞，如材料和方法（D）为了量化PAS处的荧光强度，通过荧光显微镜观察C中每个菌株的30个单独细胞。根据表达Atg1的细胞中GFP-Atg8的值计算荧光强度的相对百分比并进行归一化^ts秒以及在允许温度下设置为100%的空矢量。误差条表示三个独立实验的SD。（E） 量化含有GFP-Atg8点作为C的PAS标记的细胞数量。对每个菌株的大约150-200个细胞进行分析，以计算含有荧光点的细胞百分比。

然而，这两种蛋白质的定位模式与野生型Atg1的存在并不完全相同。在表达Atg1的菌株中，GFP-Atg8和Atg17-GFP仅显示出强烈的点状斑点，基本上没有细胞溶质染色^K54A、M102A，而这些蛋白质在野生型Atg1存在时具有较弱的PAS信号和明显的胞浆扩散信号(图7A） ●●●●。这些结果表明，Atg1激酶活性是Atg8或Atg17正常定位所必需的，而不是PAS的组装。为了进一步探讨这一点，我们决定进行定量荧光显微镜检查，以仔细检查在非特异性自噬条件下Atg1激酶活性对PAS形成的影响。这个atg1处Δ第11天带有GFP-Atg8或Atg17-GFP的Δ菌株整合在染色体位点上，并含有表达Atg1或Atg1的质粒^K54A、M102A如上文所述制备，PAS处每个嵌合蛋白的荧光强度按材料和方法.Atg1中PAS处GFP-Atg8的相对荧光强度^K54A、M102A菌株比含有野生型Atg1的细胞高约2倍(图7B） ●●●●。同样，Atg17-GFP在表达Atg1的菌株中也显示出明显更强的PAS强度^K54A、M102A是野生型的～1.5倍。

为了证明Atg1突变体存在时PAS处Atg17或Atg8的积累不是由于与Atg1激酶突变本身相关的慢性缺陷所致，我们利用了Atg1（Atg1）的温度敏感等位基因^ts秒) (铃木等。, 2001)产生相当于条件Atg1激酶突变的基因。我们共同转化表达Atg1的质粒^ts秒和附件1^K54A、M102A进入atg1处Δ第11天表达GFP-Atg8或Atg17-GFP的Δ菌株整合在各自的染色体位点。作为对照，我们使用空载体代替表达Atg1的质粒^K54A、M102A首先，我们分析了GFP-Atg8的处理，以监测Atg1的速率^ts秒饥饿条件下失活。GFP-Atg8被输送到自噬体内的液泡，在液泡腔中溶解后，嵌合体的Atg8部分降解，而GFP相对稳定；游离GFP的出现可以用来监测自噬(郑等。, 2005). 仅表达Atg1的细胞^ts秒在中atg1处Δ第11天Δ背景在24°C的SMD中生长，并在温度变化之前转移到SD-N中1h。GFP-Atg8的自噬依赖性裂解导致的游离GFP的积累在2小时内显著减少，这表明Atg1的失活发生在温度移到37°C后的这个时间范围内（我们的未发表数据）。接下来，我们使用这个条件Atg1^ts秒背景来检查Atg1如何^K54A、M102A激酶突变影响GFP-Atg8与PAS的结合/解离动力学。

在营养状态下，GFP-Atg8在在g1Δ第11天由于缺乏Atg11（我们未公布的数据），Δ在24°C或37°C下出现双突变。在饥饿条件下，GFP-Atg8在PAS处显示出清晰的信号，此外，在与Atg1共存的菌株中还显示出明显的细胞溶质扩散模式^ts秒和附件1^K54A、M102A，或Atg1^ts秒和24°C时的空矢量(图7C） ●●●●。这种模式与野生型菌株基本相同，但与Atg1不同^K54A、M102A细胞溶质染色水平的突变(图7A） ，表明Atg1^ts秒允许温度下的蛋白质补充了atg1处Δ突变，对Atg1具有显性^K54A、M102A表型。在转移到37°C的非允许温度后，GFP-Atg8仅限于PAS，2 h内没有细胞溶质染色，只有在Atg1存在的情况下^K54A、M102A相反，表达Atg1的菌株^ts秒仅Atg1失活时，弥漫性细胞溶质信号增加，PAS点状物减少。因此，Atg1^K54A、M102AAtg1后迅速产生的表型^ts秒突变体失活是由于PAS处的GFP-Atg8信号积聚。当细胞移回允许的温度时，两种菌株中的GFP-Atg8都恢复了最初看到的双PAS和胞浆定位，这表明PAS处的积累不是一种末端表型(图7C） ●●●●。

数据的量化表明，相对于Atg1的允许温度，PAS处GFP-Atg8的相对荧光强度在非允许温度下高约2.5倍^K54A、M102A应变，应变(图7D） ●●●●。同样，Atg17-GFP在表达Atg1的菌株中也表现出更强的PAS强度^K54A、M102A在非许可温度下，增加了～1.5倍（我们未发表的结果）。此外，我们计算了在这些条件下含有GFP-Atg8 PAS点的细胞数量，以检查Atg1激酶活性是否影响组装的PAS总数(图7E） ●●●●。表达Atg1菌株中GFP-Atg8点的数量^K54A、M102A与野生型Atg1菌株在允许和非允许条件下的结果相当。相比之下atg1处Δ第11天表达Atg1的Δ突变体^ts秒仅在非允许温度下，PAS点的数量明显减少，而在少数可检测的PAS中，GFP-Atg8的强度未受影响（后者可能与尚未分解的PAS位点相对应）。这些结果支持这样一种观点，即自噬特异性PAS募集是一个依赖于Atg1蛋白的动态过程，并且可能存在两种可分离的Atg1依赖性功能；PAS组装（并最终形成自噬体）所需的Atg蛋白的招募，以及随后从该位点的分离，这些步骤分别独立于和依赖于Atg1激酶活性。虽然我们分析的Atg蛋白的PAS募集不需要Atg1激酶活性，但在缺乏正常激酶活性的情况下，Atg蛋白无法从该位点正常分离，这可能反映了功能缺陷，转化为形成自噬体的能力降低。

在定量分析过程中，我们注意到GFP-Atg8点显示出不同的强度，随着时间的推移而增加或减少。为了仔细检查这种动态效应，我们按照材料和方法。如所示图7A、 中的GFP-Atg8atg1处Δ第11天表达Atg1的Δ菌株在转移到饥饿状态时在PAS中显示正常募集。GFP-Atg8荧光在～4分钟达到峰值，7分钟后信号丢失(图8). 相反，同一菌株含有表达Atg1的质粒^K54A、M102A显示GFP-Atg8的强点状信号，在7分钟的时间过程中PAS的荧光模式没有任何实质性变化(图8). 这些结果支持这样的假设，即Atg1激酶活性影响Atg8在PAS中的滞留或从PAS中分离的动力学。

在单独的窗口中打开

图8。

Atg1激酶活性对饥饿期间的Atg8动力学非常重要。来自atg1处Δ第11天用编码Atg1和Atg1的质粒转化表达GFP-Atg8的Δ菌株（HCY116）^K54A、M102A（附件1^公里). 细胞在SMD培养基中生长，在荧光显微镜下转移至SD-N培养2小时。对于延时实验，将细胞固定在含有2%琼脂的SD-N培养基上，如材料和方法每分钟都有人拍照。图像显示了7分钟的时间进程。

Atg1与Atg13的相互作用对自噬很重要

Atg1与Cvt特异性蛋白Atg11、Atg13和Atg17相互作用(卡马达等。2000年;尤里米苏和克林斯基，2005a). 由于我们对Atg1激酶突变体的研究结果，我们决定检查在非特异性自噬条件下，Atg1和Atg13之间的相互作用对于初始PAS的形成是否必要。先前的数据表明，Atg1的C末端可能在与其相互作用的伙伴形成复合体中起作用(阿贝利奥维奇等。, 2003). 基于这些信息，我们决定通过酵母双杂交分析来研究Atg1的C端截短突变体是否失去了与其已知结合伴侣Atg11或Atg13相互作用的能力。因此，我们通过增量删除20个氨基酸生成了一系列C末端截断的Atg1片段。有必要使用缺乏激酶结构域的Atg1构建物进行此分析，否则会导致此分析中的自激活（我们的未公开数据）。用含有表达Atg13的质粒和一个仅缺少C末端20氨基酸的Atg1片段的细胞以及不存在N末端激酶结构域（Atg1ΔC20）的细胞进行双杂交分析，完全失去了在缺乏腺嘌呤的选择性平板上生长的能力，而一个只缺少Atg1激酶结构域的突变株（Atg2ΔN）显示出明显增长(图9A） ●●●●。

在单独的窗口中打开

图9。

Atg1和Atg13之间的相互作用对自噬很重要。（A） 基于酵母双杂交分析，Atg1的C末端突变破坏了其与Atg13的相互作用。PJ69-4A细胞表达Atg13（AD-Atg13）和缺乏N末端激酶结构域的Atg1（BD-Atg1ΔN），C末端20个氨基酸缺失Atg1ΔM（BD-Atg1ΔC20），Atg1△N替换R885E和K892E（BD-Agg1）^{R885E、K892E})，Atg1ΔN，替换Y878A和R885A（BD-Atg1^{Y878A、R885A})或BD-空载体在缺乏腺嘌呤的平板上生长5天。这些平板上的生长或生长不足分别被评分为+或-。通过测量三个独立实验中的β-半乳糖苷酶活性来量化每组蛋白质的相互作用强度。（B和C）Atg1 C-末端突变体在与Atg13相互作用方面有缺陷，但与Atg11不相互作用。B，atg1处Δ第13天Δ（UNY27）或C，atg1处Δ第11天用表达3xHA-Atg13的质粒转化Δ（YTS157）细胞，该质粒由其内源性启动子或3xHA-Atg11控制CUP1大学如所示的促进剂，以及CUP1大学启动子驱动蛋白A（PA）标记的野生型Atg1（WT）、Atg1ΔC20（ΔC20^{R885E、K892E}（RK）或Atg1^{Y878A，R885A}（年）。作为阴性对照，将UNY27和YTS157细胞转化为表达CUP1大学启动子驱动的野生型PA-Atg1和空的pRS315或pRS414质粒。蛋白质提取物进行亲和分离，洗脱的蛋白质在6%SDS-PAGE凝胶上分离，并用抗HA抗体检测，如材料和方法.IP，免疫亲和纯化分离物。（D） Atg1 C末端突变体在自噬中有缺陷。Pho8Δ60分析用于监测细胞自噬活性在g1表达所示野生型Atg1、空载体（pRS315）或在内源性启动子控制下表达Atg1的Atg1突变质粒的Δ（UNY3）菌株，如材料和方法.从SMD中生长的细胞或在向SD-N转变4小时后制备的蛋白提取物中监测碱性磷酸酶活性。结果代表三个独立实验的平均值和SD。（E） Atg1ΔC20突变体在形成自噬体（检测为自噬小体）方面有缺陷，而在表达C末端点突变体的细胞中形成小的自噬体内。安atg1处Δ第四人民党Δ虚拟产品4Δ菌株（HCY76）分别用空载体或表达野生型Atg1或所示Atg1突变的质粒转化。细胞在SMD培养基中生长到中对数期，转移到SD-N培养基中诱导饥饿，用高锰酸钾固定，并按照材料和方法。在用空载体转化的细胞中未检测到自噬体。（F） 对每个菌株的50个切片进行自噬体直径的量化。基本上，在表达Atg1ΔC20的菌株中未检测到自噬体。

然后我们测量了β-半乳糖苷酶的活性，以定量评估这些相互作用的强度(玫瑰色等。, 1990). Atg13存在时，Atg1ΔN结构产生～60 U的β-半乳糖苷酶活性，而Atg1△C20蛋白仅表现出背景水平的活性(图9A） ●●●●。我们决定通过分离Atg1 C末端结构域中破坏与Atg13相互作用的点突变来扩展我们的分析。Atg1的这个区域在不同的Atg1同源物中高度保守酵母菌属物种。我们进行了定点突变，并在该区域内产生了两组突变体；在第一种情况下，878和885位的酪氨酸和精氨酸残基分别被丙氨酸（Y878A，R885A）取代，而在第二种情况下(图9A） ●●●●。根据酵母双杂交分析，这两对突变均导致Atg1–Atg13相互作用缺失(图9A） ●●●●。为了证实这些Atg1点突变体在与Atg13的相互作用中存在缺陷，我们检测了这两种蛋白质在生理条件下的相互作用。

用雷帕霉素处理含有蛋白A标记的野生型Atg1或突变体Atg1衍生物和HA表位标记的Atg13的细胞，以诱导自噬，并按照材料和方法用IgG-Sepharose分离野生型和突变型蛋白A标记的Atg1，并用western blot分析HA-Atg13的存在。HA-Atg13与野生型Atg1共培养(图9B） ●●●●。相比之下，与Atg1突变体共分离的HA-Atg13数量显著减少；点突变体与Atg13的相互作用损失与ΔC20截断结果基本相同。作为对照，我们检测了一株表达PA-Atg1但不表达HA-Atg13的菌株，并且没有检测到任何共分离带。这些结果表明，Atg1的C端突变导致该蛋白与Atg13相互作用的能力大幅降低。我们还检测了不同Atg1蛋白与Atg11相互作用的能力。在饥饿条件下，野生型Atg1和所有Atg1 C末端突变体与Atg11强烈相互作用(图9C） ●●●●。因此，Atg1的极端C末端对于与Atg13形成复合物很重要，但显然与Atg11无关。最近，据报道，Atg17和Atg1之间的相互作用是通过Atg13介导的(郑等。, 2005;卡贝亚等。, 2005); 因此，这些Atg1突变体也可能显示与Atg17的相互作用发生改变。

Atg1的功能对自噬和Cvt途径都是必需的。相反，Atg13的功能似乎对自噬比Cvt途径更重要；一个第13天Δ突变体显示prApe1部分成熟，但在自噬中被完全阻断(阿贝利奥维奇等。, 2003;卡马达等。2000年). 为了确定破坏Atg1–Atg13相互作用的生理功能，我们测试了Atg1突变体是否能够通过Cvt途径和/或自噬活性成熟prApe1。在营养条件下，在Atg1ΔC20突变体中，prApe1成熟被完全阻断，表明Cvt途径存在缺陷（我们未发表的数据）。相反atg1处Δ包含每个点突变体的菌株，Atg1^{Y878A、R885A}和Atg1^{R885E、K892E}，显示了野生型prApe1成熟模式（我们未公布的数据）。因此，与第13天Δ突变体仅部分影响Cvt途径，Atg1ΔC20突变体在Cvt通路中显示完全阻断。因为Atg1ΔC20突变体与第13天Δ突变体，我们得出结论，最后20个氨基酸不仅对与Atg13相互作用很重要，而且对其他Atg1特异性功能也是必需的。

我们通过测量非特异性自噬标记Pho8Δ60的活性来定量监测大量自噬，该标记编码碱性磷酸酶的改变形式；Pho8Δ60留在胞浆中，只能通过自噬传递到液泡(野田佳彦等。1995年;克林斯基等。, 2007). 在液泡中，Pho8Δ60被加工成其成熟的活性形式。因此，在饥饿条件下测量Pho8△60的活性可以定量分析自噬。碱性磷酸酶活性在atg1处用表达野生型Atg1（空载体Atg1ΔC20，Atg1）质粒转化的Δ细胞^{Y878A、R885A}，或Atg1^{R885E、K892E}在营养和饥饿条件下(图9D） ●●●●。这个atg1处空载体转化的Δ细胞在体自噬中有缺陷，饥饿4h后仅表现出基本水平的Pho8Δ60活性。相比之下在g1表达野生型Atg1的Δ细胞在饥饿后增加，表明野生型Atg 1蛋白补充了自噬缺陷atg1处Δ单元。Atg1ΔC20突变体被完全阻断以进行大量自噬，饥饿后表现出的活性水平与用空载体转化的细胞基本相同。这个atg1处表达Atg1的Δ细胞^{R885E、K892E}和附件1^{Y878A，R885A}野生型细胞的Pho8Δ60活性突变分别为～35%和30%，表明大量自噬存在实质性缺陷。总之，这些结果表明，Atg1的C末端对Cvt和自噬途径都至关重要。此外，携带每组点突变体的菌株的自噬能力降低表明，通过Atg1 C末端介导的Atg1和Atg13之间的相互作用对于有效的非特异性自噬非常重要。

我们决定通过检测Atg1突变体对自噬体形成的影响来完成对其的分析。Atg17的缺失导致细胞自噬体越来越少(郑等。, 2005). 因此，我们检测了表达Atg1ΔC20、Atg1的细胞中产生的自噬体的形态^{Y878A、R885A}或Atg1^{R885E、K892E}电子显微镜观察突变体。我们改变了atg1处Δ第四人民党Δ第4版Δ突变细胞，其质粒表达野生型或突变型Atg1。转化子在选择性培养基中生长，转移到SD-N中4小时以诱导自噬，用高锰酸钾固定，并按照材料和方法与中显示的结果类似图6饥饿4小时后，表达野生型Atg1的细胞在液泡内积聚了～10–14个自噬小体(图9E） ●●●●。与表达Atg1ΔC20的细胞中pho8Δ60活性的基本水平一致，大多数携带这种突变型Atg1的细胞呈现空液泡，而少数细胞呈现液泡，其中含有极少量的自噬体(图9E） ●●●●。同样与表达Atg1点突变体的细胞中体积自噬减少相一致，电子显微镜分析显示Atg1^{Y878A、R885A}或Atg1^{R885E、K892E}突变体产生较小的自噬体（即直径减小），与野生型菌株相比，自噬能力可能降低(图9、E和F）。然而，表达这些Atg1点突变体的细胞中产生的自噬体总数（Atg1为12.87±4.83）^{Y878A、R885A}Atg1为11.23±4.04^{R885E、K892E})与野生型无显著差异（12.28±3.63）。总之，这些数据表明，Atg1和Atg13之间的相互作用调节了自噬小体（以及由此产生的自噬体）的大小，从而调节了自吞噬反应的最佳程度。

我们感谢Takahiro Shintani博士（东北大学）和Fulvio Reggiori博士（乌得勒支大学医学中心）的有益讨论和技术建议。这项工作得到了国家卫生研究院公共卫生服务拨款GM53396（给D.J.K.）的支持。