The Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptor Is Required to Signal Autophagic Cell Death

David Lam; Artemis Kosta; Marie-Françoise Luciani; Pierre Golstein

doi:10.1091/mbc.E07-08-0823

分子生物学细胞。2008年2月；19(2): 691–700.

数字对象标识：10.1091/桶。电话：07-080823

预防性维修识别码：PMC2230578型

PMID：18077554

肌醇1,4,5-三磷酸受体是自噬细胞死亡信号的必需信号

大卫·林, 阿尔特米斯·科斯塔, 玛丽·弗朗索瓦斯·卢西亚尼,和皮埃尔·戈尔斯坦

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摘要

控制病理生理重要自噬（ACD）和坏死（NCD）细胞死亡的信号通路尚不完全清楚。在粘液菌真核生物模型受益于独特的分析和遗传优势，并且缺乏潜在的干扰凋亡机制，分化因子DIF导致从饥饿诱导的自噬到ACD，或者，如果atg1处被禁用，导致NCD。在这里，通过随机插入突变，我们发现iplA公司该基因是该生物体中唯一编码肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R）的基因，可预防ACD。IP3R是一个调控Ca的配体门控通道²⁺从内质网流出的物质储存在胞浆中。因此，Ca²⁺-相关药物也影响导致ACD的DIF信号。因此，在这个系统中，ACD的主要信号通路需要IP3R和进一步的Ca²⁺-相关步骤。这是对导致自噬细胞死亡的信号通路的分子理解的首次见解之一。

简介

细胞凋亡或I型细胞死亡长期以来被认为是动物细胞程序性死亡的主要类型。然而，其他细胞死亡类型也存在，尤其是当细胞凋亡机制被破坏时。在动物细胞中，主要的非凋亡型细胞死亡、自噬和坏死细胞死亡（分别为II型和III型细胞死亡）仍不完全确定，而它们的病理生理重要性越来越受到重视(费斯特延斯等。, 2006;Zong和Thompson，2006年;戈尔斯坦和克罗默，2007年;Gozuacik和Kimchi，2007年). 为了更好地理解控制这些非凋亡细胞死亡类型的分子机制，使用了哺乳动物模型系统，并在该领域带来了新的见解(清水等。, 2004;于等。, 2004;霍耶·汉森等。, 2005;Pyo公司等。, 2005). 然而，来自这些模型的数据也揭示了从凋亡机制中明确剖析非凋亡细胞死亡机制的困难。例如，Bcl-2家族成员是特征鲜明的凋亡介体，但他们也调节需要自噬基因的非凋亡程序性细胞死亡(清水等。, 2004). Bcl-2和Bcl-X_L（左）结合并抑制Beclin-1，酵母Atg6的哺乳动物同源物，一种重要的自噬介质(帕廷格等。, 2005;马乌里等。, 2007). 此外，Caspase-8已被证明依赖于Atg7和Beclin-1抑制自噬死亡(于等。, 2004). 相反，另一种自噬所需的蛋白钙蛋白酶叶子Atg5通过与Bcl-X结合干扰细胞凋亡_L（左）(优素福等。, 2006). 因此，这些细胞死亡类型具有共同的成分，其中一种可能调节和修改另一种的活性，使他们的研究复杂化。因此，一个不存在主要凋亡调控蛋白的实验系统将是研究非凋亡细胞死亡类型的重要资产。

原生生物盘状网柄菌得益于良好的实验和遗传特性，包括一个小的、已测序的单倍体基因组(艾钦格等。, 2005;Kessin，2006年;库斯帕和卢米斯，2006年) (http://dictybase.org/). 分化为柄细胞后，它经历发育细胞死亡(Whittingham and Raper，1960年). 在体外单层条件下(凯，1987年)模仿这种发展，野生型粘液菌细胞出现空泡细胞死亡(科尔尼永等。, 1994;勒夫罗等。, 2003). 真空化可以被抑制(科斯塔等。, 2004)通过自噬基因的靶向突变atg1处(奥托等。, 2004)显示了空泡化和自噬之间的联系。相应的细胞死亡被称为自噬细胞死亡（ACD）。重要的是，在粘液菌细胞中，没有能够干预非凋亡细胞死亡的凋亡机制的主要成员：没有caspase家族成员（除了一个与自噬或坏死细胞死亡无关的副caspase基因），没有Bcl-2家族成员，也没有BH3（Bcl-2族域）承载分子(罗辛·布法伊等。, 2004;林等。, 2007).

触发单层ACD至少需要两种不同的刺激。第一个刺激是饥饿，这引发了自噬，电子显微镜显示自噬体的形成(de Chastellier和Ryter，1977年; 未发布的数据）。然而，饥饿和自噬本身并没有导致ACD。这需要第二种刺激，即DIF-1（DIF贯穿始终），这是粘液菌DIF是一种小的二氯化分子(莫里斯等。, 1987)当将其添加到正在进行自噬的饥饿细胞中时，会导致细胞空泡化和死亡(凯，1987年;科尔尼永等。, 1994;勒夫罗等。, 2003). DIF通常由粘液菌前孔细胞，在饥饿时。它不是由粘液菌HMX44菌株，因此需要外源性DIF来液泡化和死亡，使人们能够轻松区分饥饿（而不是导致DIF合成）和DIF的作用。其他粘液菌在单层试验中，菌株在饥饿状态下会产生一些DIF。然而，这是以相对少量的量进行的，因此与仅具有饥饿诱导的内源性DIF的对照相比，外源性DIF的添加仍然导致显著更多的细胞死亡。重要的是，外源性DIF对不经历饥饿的细胞没有明显影响。这些数据使我们能够从饥饿中分离出DIF诱导的ACD。

自噬基因失活，atg1处还发现了另一种死亡类型粘液菌(科斯塔等。, 2004). 这个atg1处-空细胞在饥饿和DIF作用下，相继产生活性氧（ROS）、ATP耗竭和早期膜破裂，反映了坏死细胞死亡（NCD）(拉波特等。, 2007). DIF可能通过对饥饿细胞线粒体的直接或间接解偶联样作用诱导NCD。然而，尚不清楚这是通过哪些细胞内途径实现的。

动物细胞中导致非凋亡性死亡的机制尚不清楚。我们利用了强大的遗传工具和细胞凋亡的主要参与者的缺失粘液菌研究参与这些细胞死亡类型的信号通路。如本文所述，通过随机插入突变(库斯帕和卢米斯，1992年)以及对死亡抵抗力的选择粘液菌未空泡化且未经历ACD的突变体。被破坏的基因是iplA公司，唯一编码肌醇1,4,5-三磷酸（IP_三)受体（IP3R）。这控制着Ca²⁺来自内质网（ER）的通量储存在胞浆中(帕特森等。, 2004;Choe和Ehrlich，2006年). 虽然iplA公司突变抑制ACD，但仅不一致地抑制NCD。对外源性DIF的反应iplA公司表型和钙的额外使用²⁺-相关药物使我们能够定义ACD所需的iplA依赖性DIF通路。因此，在这个模型系统中，DIF通过IP3R、Ca²⁺焊剂和钙²⁺-自噬细胞死亡相关蛋白。

材料和方法

细胞、细胞培养、诱导细胞死亡和显微镜

父母粘液菌本报告中使用的菌株为HMX44A（有关推导，请参见勒夫罗等。, 2003)，HMX44A。atg1-1（通过插入自噬基因突变的HMX44A衍生物atg1处;科斯塔等。, 2004)、DH1、DH1。atg1-1（一种DH1衍生物突变为atg1处;奥托等。, 2004)和胸苷营养缺陷型JH10。在这里报道的工作中获得的突变体是HMX44A。atg1-3（另一种HMX44A衍生物因自噬基因缺失而突变atg1处; 见下文），HMX44A。第1-3.iplA页⁻（英寸）[iplA公司⁻（ins），插入中断iplA公司基因]，HMX44A。iplA公司⁻（英寸），JH10。iplA公司⁻（英寸），DH1。iplA公司⁻（英寸），DH1。iplA公司⁻（del）和DH1。atg1-1.iplA⁻（删除）[iplA公司⁻（del），是iplA公司基因]。承受iplA公司⁻（ins）突变在HL5改良培养基中生长(科尔尼永等。, 1994)补充10μg/ml速溶素（Invitrogen，Carlsbad，CA）。胸腺嘧啶营养缺陷型JH10细胞在添加100μg/ml胸腺嘧啶的HL5中生长（西格玛阿尔德里奇，密苏里州圣路易斯）。其他菌株仅在HL5改良培养基中生长。

诱导JH10、DH1和HMX44A细胞的空泡死亡(科尔尼永等。, 1994;勒夫罗等。, 2003)或自噬基因突变株的坏死细胞死亡atg1处(科斯塔等。, 2004;拉波特等。, 2007)，细胞在cAMP存在下饥饿，然后用所述的分化因子DIF-1处理。在指定的时间段后，使用Axiovert 200显微镜（德国耶拿卡尔蔡司）对Lab-Tek室中的细胞进行检查（微分干涉对比度[DIC]，63倍或相位对比度，100倍，油浸）。荧光激活细胞分选仪测定2′-7′-二氯荧光素二乙酸酯（DC-FDA）荧光和再生试验如前所述(勒夫罗等。, 2003;拉波特等。, 2007). 每个带有直方图的数字都是一个单独的实验，通常是两个实验，并且至少代表三个这样的实验。

试剂

环孢菌素A（CsA）、塔氏菌素（Tg）和1,2-双（2-氨基苯氧基）乙烷-N个,N个,N′,N′-四乙酸（BAPTA）购自Sigma-Aldrich。在二甲基亚砜中制备CsA（50 mg/ml）储备溶液，在纯乙醇中制备Tg（3 mM），在0.3 N碳酸氢钠NaHCO中制备BAPTA（100 mM）_三在DIF的同时或DIF前30分钟，将每种试剂以所示的最终浓度添加到Lab Tek室中的饥饿细胞中。在指定的培养时间后，通过显微镜和/或流式细胞仪分析细胞。

随机插入突变与发育筛查

每次转染，2×10⁷用10μg BamHI-线性化pUCBsrΔBamHI载体在冰冷电穿孔缓冲液（10 mM Na）中电穿孔指数生长的营养JH10细胞₂高性能操作₄/千赫₂人事军官₄pH6.1和50 mM蔗糖）。细胞在22°C的HL5培养基中培养24 h，然后在进一步的5-10 d培养期内添加10μg/ml杀鼠灵以选择转化子。选择后，12×10⁶转化子在75-cm中进行单层细胞死亡诱导²烧瓶（Falcon；BD Biosciences Discovery Labware，Bedford，MA）（如上所述，最终容量增加至20毫升）。48小时后，去除含DIF的Soerensen缓冲液，并用HL5培养基替换，以使存活细胞生长。当获得足够的细胞后，进行第二轮类似的细胞死亡诱导和选择。在DIF中孵育48小时后，将存活的细胞接种在产气克雷伯菌细菌草坪置于SM/5平板上，并在22°C下培养3-5天。用双目显微镜（卡尔蔡司）检查细菌草坪上每个克隆体作为单独斑块的发育情况。从培养皿中回收带有异常茎的克隆，并在添加抗生素（100μg/ml氨苄西林和300μg/ml链霉素；Sigma-Aldrich）的HL5培养基中生长，以去除残留的细菌。此过程导致分离出25A突变株(图1A） ●●●●。

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图1。

iplA和atg1的结构和突变体粘液菌菌株。（A） pUCbsrDBamHI插入iplA基因的定位（登录号：。AJ277590型)在最初的JH10突变克隆25A中。质粒拯救和pUCbsrDBamHI每侧侧翼序列的鉴定显示其插入iplA基因7361位的DpnII位点。pUCbsrDBamHI含有一个杀囊虫素抗性标记。（B）拯救质粒，称为iplA（ins）载体，用于通过同源重组诱变iplA基因及其插入点。使用位于pUCbsrDBamHI两侧的左右臂靶向iplA基因，通过插入导致其中断。左臂和右臂分别对应于iplA基因的位置6144-7355和7362-7610。与已发布的AX4基因组序列相比，由于菌株之间的序列差异或构建物（我们仍将其视为插入构建物）制备过程中发生的事件，在插入上游有六个核苷酸的微小缺失。该质粒用于获得简单的iplA⁻JH10、DH1和HMX44A中的突变体，并通过插入HMX44A.atg1-3（参见D）、双atg1⁻iplA公司⁻HMX44A中的突变。（C）构建物，称为iplA（del）载体，用于在iplA基因中引入缺失。PCR扩增的左臂和右臂分别对应于iplA基因的1304-2636和9713-11201位置，能够删除约7 kb的iplA基因组。该载体含有一个ura选择标记，用于在DH1中获得一个简单的iplA⁻和双atg1⁻iplA公司⁻突变体。（D）构建物，称为atg1-3载体，用于在atg1基因中引入缺失。PCR扩增的左右臂对应于atg1基因的−673到+409和712-1675位置（登录号：。AY191011年)分别导致atg1基因的～0.3 kb缺失。使用Cre表达载体pDEX-NLS-Cre去除插入物中的漂浮抗囊虫素盒(费等。, 2004). 由此产生的HMX44A.atg1-3细胞对atg1基因进行了突变，并对短梗霉素敏感。在（B）中使用它们来获得双atg1⁻iplA公司⁻突变体。

25A突变细胞的质粒拯救及iplA基因的鉴定

用不同的酶消化25A突变细胞的基因组DNA，并用Bsd法进行Southern blot分析^R（右）探针（pUCBsRBamHI的450碱基对XhoI–BglII片段）。ClaI消化产生9.7 kb片段，包含pUCBsrΔBamHI载体（4.6 kb）及其基因组侧翼序列（5.1 kb）。为了挽救和再循环该质粒及其侧翼序列，用ClaI消化25A突变细胞的基因组DNA，并将该DNA的一小部分连接并转染到电竞争性SURE细菌（Stratagene，La Jolla，CA）中。在含有100μg/ml氨苄西林的LB板上选择转化子。这种被拯救的质粒，被称为iplA公司（ins）矢量(图1B）从扩增的转化子中纯化，并使用pUCBsrΔBamHI载体中的反向引物进行测序（bsr5，5′-GCATTATGAAACAGCCAAAG–3′；PR161，5′-GGCTCGTTGTGTGG-3′；和PR214，5′-GCTATGACATAGAA-3′）。相应的序列用于国家生物技术信息中心网站上的BLASTn搜索(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，仅限于粘液菌基因组），识别iplA公司序列。

进一步iplA突变体的制备和验证，包括双突变体

要在中获得缺失突变iplA公司，我们从基因组DNA中制备了一个含有5′和3′臂的同源重组构建物。通过在引物中加入适当的序列，在PCR产物的末端产生限制性位点。对于iplA公司缺失（7087个碱基对），5′臂（1295个碱基配对）从核苷酸（nt）1341到nt 2635，3′臂（1226个碱基偶）从nt 9722到nt 10947iplA公司基因。双臂与BamHI结扎成pGEM-T Easy（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。用BamHI将质粒线性化后，将内聚端填充并去磷酸化。从pJB1中取出带有ScaI和ClaI的吡咯5-6盒（3700个碱基对），填充并通过钝端结扎在双臂之间克隆，以获得iplA公司（del）向量(图1C） ●●●●。不同菌株的细胞用iplA公司（ins）由ClaI或iplA公司（del）载体经SacII-AccI消化后，分别在含有短梗霉素的HL5修饰培养基或SIH培养基（Formedium；不含尿嘧啶）中选择产生的转化子。通过在微孔板中限制稀释来克隆耐药细胞。假定iplA公司⁻用引物bsr5（5′-CGCAACCAGAGATTTTTAAACC-3′）和iplA13（5′-CCAATACTAGGGAATGAC-3′iplA公司⁻利用引物ura4（5′-CTGGTACTAGACCTC-3′）和iplA7（5′-GGCTTAGATGACACGTA-3′）进行克隆。然后通过Southern blot证实了相应的突变。

HMX44A.atg1-3突变细胞

前面描述了缺失等位基因atg1-2的同源重组结构(科斯塔等。, 2004) (图1D） ●●●●。随后，用BamHI将该结构线性化，末端填充并脱磷。从靶向载体pLRBLP中取出悬浮的杀细胞素抗性盒(费等。, 2004)并连接到上述序列。将产生的缺失结构线性化，并用于HMX44A细胞的电穿孔。在HL5培养基中用短梗霉素（10μg/ml）筛选转化子10 d，然后通过PCR对其进行克隆和筛选，以使缺失结构与内源性atg1处基因座。挑选、扩增一个同源重组克隆，并用Cre表达载体pDEX-NLS-Cre电穿孔(费等。, 2004). 用新霉素20μg/ml在HL5培养基中筛选转化子2周，进行克隆，然后将克隆细胞系复制到两个不同的平板上。在一个平板中添加速溶菌素（10μg/ml）。选择复制品在短梗霉素存在下死亡的克隆，进行扩增，并允许其在HL5培养基中生长，无需任何选择。这些速灭活素敏感细胞被克隆并再次复制。在一个平板中加入新霉素。选择在新霉素存在下死亡的重复克隆。这些细胞现在没有抗急速杀菌素和新霉素药盒，这已通过PCR和Southern杂交证实。去除了杀囊虫素盒，但保留了73-nt序列，包括翻译停止盒和单个loxP位点。此外，在atg1处基因。

ATP水平的测量

使用CellTiter-Glo发光细胞活性测定试剂盒（Promega）对细胞群中的ATP进行定量。每个样品，3×10⁵每毫升细胞以1500 rpm离心5分钟。将细胞重新悬浮在100μl（共2个）中-(N个-吗啉基）乙磺酸，并转移到乳白色96-well板的孔中（Nalge Nunc，Rochester，NY；参考文献236105）。通过添加100μl CellTiter-Glo试剂并在摇床上混合2分钟来溶解细胞。将平板在室温下培养10分钟。通过光度计测量细胞提取物中的ATP水平，并以每个细胞为单位表示。

结果

茎秆发育改变的遗传筛选产生了一个插入iplA基因的突变体

粘液菌细胞群随机突变(库斯帕和卢米斯，1992年)通过两轮DIF诱导的单层细胞死亡来富集抗细胞死亡突变体，并在细菌草坪上传播，在那里每个野生型细胞可以繁殖并发育成子实体。这使我们能够直观地筛选这些克隆，拒绝那些根本没有发育的克隆，并选择那些发育发生的克隆，但茎是不正常的，因此可能是由抗死亡突变细胞构成的。

在中使用此方法粘液菌菌株JH10，我们分离出一个突变克隆，称为25A。克隆25A的子实体一般小于野生型JH10的子实体。在诱导单层细胞死亡时，25A突变细胞表现出自噬细胞死亡缺陷，空泡细胞比例明显降低。该基因通过质粒拯救鉴定，其在JH10和DH1细胞中的靶向突变在定性上导致了相同的表型，表明该基因的突变导致了自噬细胞死亡的缺陷。在挽救的质粒中，插入质粒pUCbsrDBamHI两侧的基因组序列被完全测序，并与粘液菌基因组(艾钦格等。, 2005). 5′和3′侧翼序列分别对应于iplA基因（登录号：6144-7355和7362-7610）的片段。AJ277590型). 诱变pUCbsrDBamHI质粒已插入该基因7361位的DpnII位点(图1A） ●●●●。iplA基因（共15066个核苷酸，包括3个内含子）编码3177个氨基酸蛋白质，是粘液菌该IP3R管理Ca²⁺从内质网到胞浆的通量(特雷纳等。2000年;沙洛斯克等。, 2005).

自噬细胞死亡需要IP3R

带有侧翼序列的拯救质粒对应于iplA公司基因，此后称为iplA公司⁻（ins）载体在三个遗传背景下通过同源重组使该基因失活：JH10、DH1和HMX44A(图1B） ●●●●。相应的突变细胞命名为JH10。iplA公司⁻（ins）、DH1。iplA公司⁻（英寸）和HMX44A。iplA公司⁻（英寸）。基因7361位的插入突变iplA公司通过PCR和Southern印迹对每个病例的基因进行了验证。在单层实验中，饥饿和添加DIF后，对这些突变体和相应的野生型细胞进行ACD和NCD测试。这个iplA公司突变、thapsigargin、BAPTA和环孢素A对DH1细胞有显著作用，如下所述，对JH10细胞只有中间作用，对HMX44A细胞几乎没有检测到作用。这些结果表明HMX44A和DH1背景在钙方面存在差异²⁺焊剂或钙²⁺需求，通过替代或冗余路径从DIF走向死亡。下面我们将仅详细描述在更具启示性的DH1背景下获得的结果。

在DIF存在下24小时后，饥饿的DH1野生型细胞出现大量空泡。与此形成鲜明对比的是，经过类似处理的DH1.iplA⁻（ins）细胞没有空泡化(图2A），特别是在细胞团边缘具有高度的流动性，类似于涌现的桨细胞(勒夫罗等。, 2003). 在DIF中48小时后，DH1.iplA簇⁻（ins）细胞完全分离，生成的单个细胞仍然没有空泡化，呈现桨状细胞形态(图2A） ●●●●。即使在以后，DH1.iplA⁻（ins）细胞通常不会空泡化，它们在类似于无DIF对照组的饥饿培养基中几天后死亡。总之，在用相控显微镜检查空泡化的14个实验中，有14个实验显示对照DH1细胞出现了明显的DIF诱导的空泡化，而在这14个实验的12个实验中没有检测到DH1.iplA的空泡⁻细胞。而在DIF DH1细胞的存在下合成了纤维素外壳，反映了纤维素合成机器的诱导(布兰顿等。2000年)，DH1.iplA⁻（ins）细胞没有(图2B）表明iplA可能在诱导的上游起作用。

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图2。

iplA公司突变细胞几乎完全抑制了DIF诱导的自噬细胞死亡。（A） DH1中的真空化被抑制。iplA公司⁻（ins）受到DIF的突变细胞。野生型和DH1。iplA公司⁻（ins）突变细胞饥饿8小时，然后在100 nM DIF（DIF；右）或不存在DIF（无DIF；左）的情况下清洗并进一步培养。最初8小时饥饿期后16、24或48小时的DIC显微镜照片。在DIF作用下的DH1野生型细胞中可见液泡（白色箭头）。然而，在缺乏DIF或突变株中几乎没有液泡iplA公司⁻受到DIF的细胞。后一组显示浆细胞(勒夫罗等。, 2003)（黑色箭头）最常出现在细胞聚集体的外围。（B） DH1中没有出现纤维素外壳。iplA公司⁻（ins）突变细胞对DIF的反应。在DIF、DH1 wt和DH1中培养16小时后。iplA公司⁻（ins）突变细胞用钙氟标记。对于每种细胞类型，相控显微镜（顶部）或荧光显微镜（底部）拍摄的照片对应于相同的显微视野。箭头如A所示。只有DH1野生型，而不是DH1。iplA公司⁻（ins）突变细胞空泡化，钙氟阳性。（C） DH1中克隆形成细胞死亡显著减少。iplA公司⁻（ins）突变细胞比DH1野生型细胞对DIF的反应。在使用或不使用DIF培养24小时后，添加富含HL5的培养基，并在进一步48小时的培养期后对细胞进行计数。

野生型和iplA公司⁻对突变细胞进行再生试验，根据存活细胞的增殖来量化DIF诱导的ACD(图2C） ●●●●。正如预期的那样，与没有DIF的对照组相比，用DIF孵育后DH1野生型细胞的数量要少得多，这反映了饥饿和DIF引发的细胞死亡。相反，DH1的数量。iplA公司⁻无论是否用DIF处理，（ins）细胞都是相同的(图2C）表明这些突变细胞对DIF诱导的死亡具有抵抗力。在六个实验中，有六个实验显示DIF显著诱导了对照DH1细胞的死亡，但没有显著的DIF诱导DH1细胞死亡。iplA公司⁻细胞。总的来说，在DH1细胞中iplA公司失活导致DIF诱导的事件在桨状细胞阶段明显停止。随后的自噬空泡化和死亡需要IP3R。

可变比例细胞中坏死细胞死亡需要IP3R

在atg1自噬基因突变的细胞中，饥饿和DIF导致无空泡化和NCD(科斯塔等。, 2004;拉波特等。, 2007). 为了确定iplA基因的突变是否不仅影响ACD，也影响NCD，我们在DH1和HMX44A背景中进行了双靶向突变（atg1和iplA）。四个atg1⁻获得突变细胞(图1B和C），并检查是否存在NCD。国际律师协会⁻突变细胞HMX44A.atg1-3.iplA⁻（ins）和DH1.atg1-1.iplA⁻（del）与各自的iplA进行比较⁺对应HMX44A.atg1-3和DH1.atg1-1。同样，只显示在DH1背景中获得的结果。

两个iplA⁺和iplA⁻在缺乏DIF的情况下，饥饿的细胞呈圆形且折射(图3A） ●●●●。添加DIF后，与iplA相比⁺控件(拉波特等。, 2007)，突变型iplA⁻细胞倾向于显示较少的DC-FDA阳性细胞（如前所述，ROS生成细胞较少；拉波特等。, 2007) (图3B）减少ATP消耗(图3C） 20分钟时，核周浓缩细胞与60分钟时圆形和折射细胞的混合物(图3A）在两个独立的iplA中，细胞质膜破裂的时间较短⁻克隆(图3D） ●●●●。然而，与上面显示的其对ACD的清晰和可重复性良好的效果相比，iplA突变仅部分损害了NCD，并且不同实验的损害程度是可变的。在18个实验中，与对照细胞中质膜破裂的细胞百分比相比，iplA⁻细胞在五个实验中低于三分之一，但在11个实验中高于一半。我们寻找但无法确定导致这种变化的实验参数（数据未显示）。我们推测，在极限条件下，即使钙适度升高²⁺由于IP3R引起的水平可能“非特异性”加剧饥饿诱导的线粒体对DIF的敏感性。细胞可能需要或不需要IP3R和相应的额外Ca²⁺以实现最佳线粒体解偶联，这可能反映了发育过程中预先存在的异质性粘液菌细胞与胞浆钙的关系²⁺浓度(库比特等。1995年;爱资哈尔等。, 1996).

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图3。

iplA公司突变细胞对DIF诱导的坏死细胞死亡有部分抑制作用。（A）一些DH1。atg1-1.iplA⁻（del）细胞对DIF没有表现出坏死细胞死亡的形态学特征。DH1。atg1-1和DH1。atg1-1.iplA⁻（del）细胞饥饿16小时，然后清洗并在100 nM DIF（DIF，底部）存在或不存在的情况下进一步培养（无DIF，顶部）。添加DIF后60分钟拍摄的相差显微镜照片。白色箭头，显示坏死细胞死亡迹象的细胞；黑色箭头，单元格未显示此类标志。（B） DC-FDA阳性细胞百分比在iplA公司⁻比中的iplA公司⁺细胞。缺少DH1。atg1-1和DH1。atg1-1.iplA⁻（del）细胞与荧光ROS检测探针DC-FDA孵育20–30分钟，有或没有DIF，荧光DC-FDA阳性细胞通过流式细胞术定量。（C）年ATP消耗较少iplA公司⁻比中的iplA公司⁺细胞。缺少DH1。atg1-1和DH1。atg1-1.iplA⁻将（del）细胞与DIF或不与DIF孵育20–30分钟，并使用CellTiter-Glo-Luminescent细胞活力测定试剂盒对每个细胞群中的ATP进行定量（单位为每个细胞的阿托莫）。（D） DIF诱导的质膜破裂的细胞百分比在iplA公司⁻比中的iplA公司⁺细胞。通过流式细胞术检测饥饿DH1细胞膜破裂，并将其量化为时间函数。atg1-1（正方形）和DH1的两个独立克隆。atg1-1.iplA⁻（del）（圆形；三角形）细胞培养，无（虚线）或有DIF（连续线）。相同百分比的细胞（可能是相同的细胞）显示出核周聚集、DC-FDA荧光和随后的质膜破裂。

总之，iplA⁻突变使ACD受损，表明IP3R是该死亡所必需的，而NCD仅部分受损。这些结果有助于定义一种DIF触发的通路，涉及ACD严格要求的IP3R，但NCD仅部分要求。

Thapsigargin诱导BAPTA和环孢菌素A抑制自噬非坏死细胞死亡

上述实验表明，至少ACD需要IP3R粘液菌DH1细胞，强烈提示钙的关键参与²⁺Tg，肌（内质网）钙的抑制剂²⁺ER膜上的ATP酶（SERCA）泵将阻止Ca²⁺从胞浆流入内质网的流量，导致胞浆钙增加²⁺浓度，特别是粘液菌(田中等。1998年). 尽管饥饿的DH1细胞本身没有出现空泡化(图4A、左上角），添加Tg后24小时可观察到大量空泡细胞(图4A、左下），类似于添加DIF后观察到的结果(图4B、左上角）。此外，与DIF类似，添加Tg导致DH1细胞死亡，这是再生测试中评估的结果(图4C、左）。Tg或DIF引起的空泡化或死亡更少iplA公司⁻单元格(图4A、右下角，C，右）。此外，在存在1 mM Ca的情况下²⁺螯合剂BAPTA、DIF触发的DH1细胞显示较少的液泡(图4B、左）。BAPTA还部分抑制DIF诱导的细胞死亡，如再生试验所示(图4C、左）。相反，在饥饿的DH1中。atg1-1没有DIF，Tg细胞不能触发NCD(图4D）和Ca²⁺螯合剂BAPTA不改变核周缩合和膜破裂（数据未显示）。总的来说，Tg和BAPTA结果表明，给定细胞溶质Ca²⁺浓度阈值可能是必需的（与IP3R结果一致），并且足以用于进一步的真空化和ACD事件，但对于NCD则不需要或更少。

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图4。

thapsigargin或BAPTA对自噬或坏死细胞死亡的影响。（A）在DH1中Tg可以在没有外源性DIF的情况下诱导空泡化，但在DH1中不能。iplA公司⁻（ins）突变细胞。DH1和DH1。iplA公司⁻（ins）突变细胞饥饿8小时，清洗，然后用Tg 5μM（底部）或不带Tg（顶部）进一步培养24小时。（B）加利福尼亚州²⁺-螯合剂BAPTA抑制DIF诱导的DH1细胞空泡化。DH1和DH1。iplA公司⁻（ins）突变细胞饥饿8小时，清洗，然后用DIF和BAPTA 1 mM（底部）或无BAPTA（顶部）进一步培养24小时。DH1。iplA公司⁻（ins）突变细胞接受与非电针对照相同的治疗。相位对比图片。（C） Tg或BAPTA分别诱导或抑制DH1 WT细胞中的克隆原性死亡。缺少DH1和DH1。iplA公司⁻将（ins）突变细胞置于DIF、Tg和BAPTA的不同组合下24小时，然后比较它们的克隆形成能力。（D） Tg可提高DIF诱导的细胞质膜破裂率。缺少DH1。atg1-1细胞在有或无DIF和Tg浓度增加的情况下孵育。2.5 h后，用流式细胞仪测定质膜破裂细胞的百分比。

上述结果与IP3R介导的从内质网储存物释放到Ca的胞浆中一致²⁺在饥饿的细胞中，这可能是ACD所必需的。据预测，下游钙含量降低²⁺-相关步骤可能具有与IP3R灭活相同的效果。A主Ca²⁺-结合蛋白是钙调素。钙²⁺/钙调素激活激酶和蛋白磷酸酶钙调神经磷酸酶，钙调神经蛋白与钙偶联²⁺蛋白质去磷酸化的信号。钙调神经磷酸酶可被药物CsA结合的小蛋白亲环素抑制。CsA确实显著延缓了DIF诱导的DH1细胞空泡化，但它并没有改变桨细胞的外观和出现时间(图5A） ●●●●。这表明，液泡化延迟是由于在桨细胞阶段或之后发生的CsA敏感性事件，或不依赖于桨细胞形成的途径。CsA对空泡化的抑制而不是桨状细胞形成的抑制是由于CsA的后期作用，因为当在DIF后5小时加入CsA时，空泡化受损(图5B） ●●●●。这证实了早期的类似观察结果(霍恩和格罗斯，1996年)并表明，在添加DIF数小时后，自噬细胞死亡途径发生了必需的CsA敏感性事件。再生实验表明，CsA不仅延缓了空泡化，而且也延缓了ACD，因为在DIF后14h而不是17h加入富含HL5的培养基时，CsA可以从DIF诱导的ACD中挽救一些DH1细胞(图5C） ●●●●。此外，重要的是CsA并没有延迟或抑制DH1中的NCD。atg1-1细胞（数据未显示；如果有的话，CsA倾向于增加NCD）。因此，尽管环孢素a没有损害NCD，但在桨后阶段，它明显延迟了ACD途径的空泡化和死亡。这些和以前的结果表明，DIF/IP3R通路控制ACD，但仅部分控制NCD。一个CsA不可抑制的部分，可能是钙调神经磷酸酶，在通向ACD的路径上更为下游。

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图5。

环孢素A显著延缓自噬细胞死亡。（A）环孢菌素A延迟了DIF诱导的空泡化。饥饿的DH1 wt细胞在没有（顶部）或存在（底部）1μg/ml CsA的情况下与DIF孵育。用DIF孵育16、20或24小时后的相控显微镜照片。（B）即使在DIF后5小时添加环孢素A也会延迟液泡化。在添加DIF后1、5或15 h，向DH1 wt细胞中添加CsA（1μg/ml）。添加DIF后22小时拍摄的相控显微镜照片。（C）环孢素A延迟DH1 wt细胞的克隆性死亡。向饥饿的DH1 wt细胞中添加或不添加CsA（1μg/ml）以及DIF。添加DIF后，在不同时间用富含HL5的培养基替换上清液。一些细胞在DIF后14小时仍然受到CsA的保护，但在以后的时间没有。

讨论

在动物细胞中，IP3R在某些凋亡案例中的参与已被充分记录(可汗等。, 1996;苏加瓦拉等。, 1997;布莱克肖等。2000年;阿塞法等。, 2004;橡树等。, 2005;白色等。, 2005). 然而，只有少数证据表明IP3R参与非凋亡细胞死亡。重要的是，在秀丽线虫内质网钙的突变²⁺释放通道unc-68（ryanodine受体）或itr-1（IP3受体）抑制坏死样神经元死亡(徐等。, 2001). 在原生生物中粘液菌，我们通过随机突变表明，编码唯一IP的iplA基因突变_三该生物体中的受体(特雷纳等。2000年)抑制ACD，表明Ca²⁺通过IP3R的激活从内质网到胞质溶胶的流动是这种caspase非依赖性细胞死亡的信号所必需的。特雷纳等。（2000年）之前在AX2菌株中通过靶向突变使iplA基因失活，缺失约7kb。突变细胞显示出较少的钙²⁺对cAMP的反应产生的内流，对发育（有趣的是，包括较小的子实体）、信号转导、肌动蛋白细胞骨架重组或趋化性的影响很小。沙洛斯克等。(2005)随后显示细胞外钙的进入²⁺和钙²⁺与野生型AX2细胞相比，同一突变体中cAMP引起的内部储存释放量要低得多。这些数据表明，IP3R对于确保Ca²⁺刺激反应通量粘液菌细胞。

钙²⁺IP3R控制的通量（来自ER-Ca²⁺储存到细胞质）和SERCA（从细胞质到内质网）将调节细胞质Ca²⁺水平。钙的作用²⁺ACD的流量不仅由上述遗传论据支持，还由细胞内钙的药理操作支持²⁺水平：1）Tg，用于增加胞浆Ca²⁺，可能导致ACD与之前的观察结果一致(库博哈拉和冈本，1994年;沙普等。, 1996;库博哈拉等。, 2007). 值得注意的是，我们使用了未添加Ca的饥饿缓冲液²⁺（请参见材料和方法). 这表明细胞外钙²⁺内流对ACD和NCD不是必需的，但也使钙的检测更加困难²⁺通量，通量(Nebl和Fisher，1997年;施拉特雷尔等。, 2004). 2） BAPTA，强效钙²⁺螯合剂，抑制ACD，进一步支持对钙的需求²⁺在这条路径中。3） CsA对ACD的抑制作用与iplA突变体相似。CsA是钙的经典抑制剂²⁺/钙调素依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶，但它也可能以其他方式起作用，例如，通过干扰线粒体亲环素D（如动物细胞）。在这种情况下，我们赞成对钙调神经蛋白产生影响，因为钙调神经磷酸酶调节性B亚单位的表达减少导致短柄的形成和柄细胞的不完全液泡化粘液菌AX2应变(伯克勒等。, 2006). 因为IP_三是IP3R的主要配体，很容易推测DIF可能通过诱导IP激活这些钙通道的开放_三生产。值得注意的是，该系统中ACD所必需的第三个信号是cAMP。我们不能排除cAMP和DIF都有助于IP3R途径的触发(Europe-Finner和Newell，1987年;van Haastert，1989年).

引人注目的是，在IP3R基因敲除中独立发现了相同的发育和细胞死亡表型（当进行这些测试时）(特雷纳等。2000年; 本研究），钙调神经磷酸酶敲除(伯克勒等。, 2006)，并添加环孢菌素A(霍恩和格罗斯，1996年; 本研究）。这些一致的观察结果强化了Ca的概念²⁺-ACD的依赖性途径粘液菌他们强烈建议在体内和体外都有类似的机制。他们还建议IP3R、Ca²⁺钙调神经磷酸酶在关键的后桨或桨诱导的空泡化和ACD步骤的上游作用相同(图6).

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图6。

导致细胞死亡的途径示意图粘液菌单元格（请参见工具书类). 常见和自噬途径为黑色，坏死细胞死亡途径为红色。实验上，这些途径是由饥饿（没有产生足够的DIF）和添加外源DIF触发的。底部，饥饿导致自噬，准备由ACD的DIF诱导。当atg1突变时，该途径似乎会导致线粒体的改变，使其准备好被非传染性疾病的DIF诱导。顶部，DIF领先（可能通过诱导IP_三生产）至IP3R活化和随后的Ca²⁺从内质网释放到胞浆。在g1⁺细胞，胞浆钙²⁺然后可以激活钙调素/钙调神经磷酸酶导致ACD。在g1⁻细胞，Ca²⁺可以促进DIF诱导的线粒体解偶联和NCD激活，而atg1的比例相当大⁻DIF细胞可直接改变线粒体。

如图所示，IP3R/Ca²⁺通量在导致ACD的DIF信号传导中起着关键作用，而先前的证据表明，这种死亡途径（解释为向茎细胞分化）涉及基因表达的诱导。Tg和BAPTA诱导和抑制语前特异性基因的表达(沙普等。, 1996;库博哈拉等。, 2007)分别与它们对ACD的影响相关。此外，bZIP转录因子突变体dimA⁻，在单层分析中未分化为干细胞，如iplA⁻突变体，并且对DIF的反应也显示出很少或根本没有特异性的基因表达(汤普森等。, 2004). 国际律师协会⁻突变阻止了DIF作用下细胞周围纤维素外壳的合成，这与IP3R和Ca的控制一致²⁺控制纤维素合成的基因表达通量。此外，在AX2和AX4菌株中，添加DIF可在几分钟内触发DimA和DimB（第二个bZIP转录因子）的核积累(黄等。, 2006;朱可夫斯卡娅等。, 2006). 有趣的是，DimB是空泡细胞死亡和抑制非空泡细胞对DIF的反应所必需的(黄等。, 2006)，如Atg1。总之，这些数据支持DIF可以通过IP3R/Ca激活转录因子来触发ACD的观点²⁺通路。

虽然我们的数据表明ACD需要IP3R粘液菌在哺乳动物细胞中，通过RNA干扰击倒IP3R亚型足以诱导自噬(克里奥洛等。, 2007)以及通过ATP刺激导致IP的游离胞浆钙升高_三生产是大自噬的有力诱导剂(霍耶·汉森等。, 2007). 这些不一致的结果可能与IP3R的激活和抑制能够通过不同的信号通路诱导自噬的可能性有关(Höyer-Hansen和Jaattela，2007年)和/或观察到抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-X_L（左）可以与IP3R进行物理交互(陈等。, 2004;白色等。, 2005)和Beclin-1，一种重要的自噬蛋白(帕廷格等。, 2005;迈乌里等。, 2007). 哺乳动物细胞中可能存在通过IP3R在凋亡和自噬机制之间的紧密调节，进一步强调了粘液菌无凋亡模型研究自噬细胞死亡。

在与DIF孵育时，atg1自噬基因的突变抑制了空泡化，但显示出NCD，这表明空泡化与饥饿诱导的自噬有关，并且atg1基因在从DIF诱导的ACD转换为NCD中起着关键作用。这种突变使线粒体对DIF随后的解偶联敏感，从而导致NCD(拉波特等。, 2007). 不仅在g1⁻突变细胞以及另一个自噬基因（atg5）突变的细胞显示坏死细胞死亡（未公布数据）。BAPTA和CsA抑制ACD而非NCD，而iplA突变也抑制NCD，但与ACD相比持续性较差，表明至少存在两条DIF起始途径(图6). 在g1时处于饥饿状态⁻细胞，DIF可以直接影响线粒体（与之前的报告一致Shaulsky和Loomis，1995年)或通过IP3R（与ER和有利于Ca的线粒体之间的空间接近性一致²⁺交易所；里祖托等。, 2004;索达斯等。, 2006;Rizzuto和Pozzan，2006年)导致线粒体解偶联和NCD。在g1时处于饥饿状态⁺细胞，一条DIF生成途径通过IP3R，可能还有钙调神经磷酸酶，因为它可以被CsA阻断。其在未知亚细胞位置与自噬的融合导致空泡化和ACD(图6).

鸣谢

我们感谢J.Ewbank、L.Leserman、C.Giusti、E.Tresse和Mathieu Fallet（免疫中心）的讨论和帮助；Dicty库存中心(http://dictybase.org/StockCenter/StockCenter.html)以及P.Devreotes和J.Borleis（约翰·霍普金斯大学）pJB1载体的保存处；以及来自J.Faix（德国汉诺威）和R.H.Kessin（哥伦比亚大学）的pLRBLP和pDEX-NLS-Cre载体的初始DH1。atg1-1细胞。我们感谢国家医学研究所和国家科学研究中心提供的机构支持，以及国家癌症防治机构（DictyDeath ANR-05-BLAN-0333-01）、欧洲共同体（FP6 STREP TransDeath LSHG-CT-2004-511983）、，Recherche卫生部（ACI BCMS174）、Cancéropóle PACA和癌症协会。

使用的缩写：

ACD公司	自噬细胞死亡
环孢素A	环孢菌素A
DIF公司	分化诱导因子
IP3R公司	肌醇1,4,5-三磷酸受体
非传染性疾病	坏死性细胞死亡
Tg（千克）	萨普西加金。

脚注

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E07-08-0823)2007年12月12日。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会