美国人类遗传学杂志。2007年10月；81(4): 673–683.
新型锌指蛋白ERIS的纯合突变与Wolfram综合征2有关
弗吉尼亚联邦大学人类遗传学系（S.A.；C.H.；X.-J.X.；K.H.S.；A.P.；R.S.）和药理学与毒理学系（M.Z.；L.S.S.），里士满；约旦安曼约旦大学医院国家糖尿病、内分泌和遗传学中心（K.A.；H.E.-S.）和内科；爱荷华市爱荷华大学儿童医院儿科
通信和转载地址：Rita Shiang博士，邮政信箱980033，Richmond，VA 23298-0033。电子邮件：uge.ucv@gnaihsr 版权所有©2007美国人类遗传学学会。保留所有权利。 摘要
在一个新的高度保守的锌指基因中发现了一个错义突变，ZCD2、，三个患有Wolfram综合征（WFS）的约旦血统近亲家庭。研究表明，这些家族没有WFS1基因突变(WFS1型)但在4q22-25被映射到WFS2基因座。核苷酸109的G→C颠倒预测氨基酸从谷氨酸转变为谷氨酰胺（E37Q）。虽然氨基酸是保守的，突变是非同义的，但该疾病的发病机制是因为突变也会导致异常剪接。该突变通过消除外显子2来破坏信使RNA剪接，并导致提前终止密码子的引入。中的突变WFS1型也被发现会导致低频非综合征性听力损失、进行性听力损失以及与听力损失相关的孤立性视神经萎缩。对377名听力损失先证者的筛查没有发现WFS2基因的突变。这个WFS1型-编码蛋白Wolframin定位于内质网，在钙稳态中发挥作用。这个ZCD2型-编码蛋白(e（电子）内质的第页小叶我膜间秒mall蛋白），也显示定位于内质网，但不与Wolframin直接相互作用。与对照组相比，受影响个体的淋巴母细胞在受他psigargin刺激时，细胞内钙显著升高，尽管细胞内钙的静息浓度没有差异。
Wolfram综合征（WFS[MIM222300])是一种伴有严重神经变性的常染色体隐性遗传疾病。受影响的个体表现为青少年发作的胰岛素依赖性糖尿病和视神经萎缩。1,2其他神经和内分泌表现包括尿崩症、感音神经性耳聋、痴呆、精神疾病、肾道异常和膀胱无力。三,4一个导致疾病的基因，WFS1、，在染色体4p16.3上，已克隆并编码一种新的跨膜蛋白，该蛋白位于内质网（ER）中，可能在钙（Ca）中起作用2+)体内平衡。5–8此外WFS1型该基因在低频感音神经性耳聋、进行性耳聋和伴有视神经萎缩的耳聋中起作用。9–11
WFS2（MIM）的基因座604928)在标记之间映射到染色体4q22-24D4S1591号和D4S3240型在三个有血缘关系的约旦大家庭中。12虽然这些家系没有亲缘关系，但单倍型分析显示，这些家系中存在一种常见的受影响单倍型。一项广泛的表型分析显示，WFS2患者还有其他症状，如明显出血倾向，以及血小板与胶原蛋白的聚集缺陷，13以前在患有WFS的家庭中没有描述过。此外，相当多的患者患有消化性溃疡病，并伴有出血倾向，导致胃肠道出血。14
在这项研究中，我们在一个新的高度保守的锌指基因中确定了WFS2的突变原因，ZCD2、，位于关键基因区域。此外，还揭示了突变的致病性证据。对该新基因的其他研究包括其蛋白结构域、表达和细胞定位的特征描述，以及确定该基因是否在Ca中起作用的研究2+平衡。为了确定WFS2基因是否也与非综合征性听力损失相关，还对大量听力损失患者进行了突变分析。
材料和方法
遗传标记
通过使用该程序搜索基因组DNA中的微卫星区域，在4q24-q25区域发现了新的遗传标记人造卫星在关键基因区域内发现了四个新的微卫星簇。开发了扩增该区域的引物，并在10个无关的CEPH个体中进行了测试（此处和下面的所有引物均显示为5′→3′）（Wpoly2F[tgactagttgatgtgtgtggcag]、Wpoly_2R[ccaacgctagtgaggtgtgg]、Wpoly5F[caatatcccatactagagtc]、Wcoly5R[tgcatgttgaacaggtac]、Woly6F[actgtagatcc]、Wpoly6R[gaccactttgtgccc]、Wpoly7F[atgctaggccag]和Wpoly7R[gttgtattctgcacc]）。所有微卫星均为多态性，杂合度Wpoly2为0.79，Wpoly5为0.81，Wpoy6为0.78，Wpoly 7为0.82。这些标记和该地区的其他已知标记(D4S2961、D4S3043、D4S1572、D4S2913、D4 S411、，D4S1531，和D4S2917号)被输入WFS2影响的家族。引物末端标记γ-P33Wpoly2、Wpoly5和Wpoly6的退火温度为60°C，Wpoly7的退火温度则为65°C。样品在测序凝胶上运行，并暴露在x射线胶片上。
SSCP分析
引物组分别针对单带扩增进行了优化。将7μl PCR产物与3μl SSCP负载染料（95%甲酰胺、20 mM EDTA、0.05%二甲苯氰醇和0.05%溴酚蓝）混合制备样品，在95°C下变性5分钟，并在冰上快速冷却。对每个引物集运行三个样本：患者PCR产物、对照PCR产物和患者加对照PCR产物。预运行30分钟后，将变性样品通过含有1×三硼酸盐EDTA（TBE）和10%甘油的10%（49:1）丙烯酰胺：双丙烯酰胺凝胶（National Diagnostics）在4℃下8 W下运行5小时，或在4℃在3 W下运行16小时。按照制造商的方案，凝胶在1×TBE中以1:10000稀释的SYBR Gold（分子探针）中染色。
ZCD2型PCR和限制性内切酶消化
合成了四组引物来扩增ZCD2型来自基因组DNA的基因：Exon1F（gctcgggagaggtaggtacc）和Exon1R（ggattttacctctccccc）、Exon2aF（agcactgagctaccaca）和Exon 2aR（cgtttagaaccacc）、Exon 2bF（tcgcatttggctactt）和Exone2bR（ggggatttaggagaacac），以及Exon3F（gctttctgagattc）和Exton3R（ccagtatagaccatt）。PCR使用65°C的退火温度进行。通过消化249-bp Exon2a PCR产物和X百万I使用制造商的条件（NEB）。ZCD2型对每个家庭中一名受影响个体的外显子2进行测序，以确认这种变化。弗吉尼亚联邦大学和约旦科技大学机构审查委员会（IRB）批准使用这些样本，并在适当情况下获得所有受试者的知情同意或同意。
TaqMan基因分型
为了计算突变的等位基因频率，设计了一种定制TaqMan SNP基因分型分析（Applied Biosystems），专门用于检测这种单碱基变化。该方法使用5′荧光化学和TaqMan探针。使用ABI PRISM 7900序列检测系统对对照组进行基因分型。通过测序确认基因型后，将WS-2家族的一名受影响个体（W2）和两名专性携带者分别用作纯合和杂合对照。通过对440名约旦对照者的88份随机选择的DNA样本（20%）进行测序，确认了该基因型。
控制队列
这三个对照队列包括一个种族匹配的队列，共有440名无关的约旦对照。此外，从人类基因组多样性项目（HGDP）-CEPH人类基因组多态性细胞系小组获得1064个对照15使用86个不相关的CEPH对照。HGDP-CEPH小组包括148名与这三个家庭具有相同种族背景的个人。这些队列共有3180条染色体，其中1176条是种族匹配的。
失聪队列
在377名接受筛查的失聪先证者中，288名来自多重家族，表明存在隐性遗传模式，患有严重的听力损失。我们还筛查了84名中重度常染色体显性遗传性听力损失的先证者。如果先证者有垂直传播的听力损失家族史，并且听力损失是舌后进行性的，则先证者被归类为常染色体显性遗传。尽管大多数人有严重听力损失，但有14人有高频听力损失，只有1人有低频听力损失。弗吉尼亚联邦大学IRB批准使用这些样本，并在适当情况下获得所有受试者的知情同意或同意。
细胞培养
来自约旦人群的两个对照（W1和JA）和一个受影响（W2）的淋巴母细胞系在RPMI 1640中保存我-补充有10%胎牛血清（FBS）的谷氨酸盐（Invitrogen）。P19小鼠胚胎癌细胞在添加7.5%小牛血清、2.5%FBS和0.5%庆大霉素的α-最低必需培养基（Invitrogen）中生长。HEK293人胚胎肾细胞保存在添加了10%FBS和1%青霉素和链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基（Invitrogen）中。所有细胞系均保持在5%的CO中2培养箱保持在37°C。将要转染的P19和HEK293细胞保存在所述培养基中，不添加抗生素。
逆转录聚合酶链反应
使用Trizol（Invitrogen）从W1、W2和JA人类淋巴母细胞中提取总RNA。用20 U RQ1 DNA酶（Promega）处理总RNA。从500 ng总RNA、5 ng/μl寡核苷酸和随机引物以及0.5 mM脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）中生成第一链cDNA，然后将其加热至65°C 5分钟，然后立即在冰上冷却。然后添加第一链缓冲液（1×）、0.01 M二硫苏糖醇和40 U核糖核酸酶抑制剂（Promega），并将混合物在37°C下培养2分钟。添加等分的200 U Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶（Invitrogen），并允许反应在37°C下发生50分钟，然后在70°C下最后孵育15分钟。
用于扩增ZCD2型cDNA分别为pogo.aRTF（gctcgggagagaggagtgga）和pogo.aRTR（tgcaggaaaataaattggaa）。GADPH公司使用的引物是GADPHF（acttcaacagcacacacatc）和GADPHR（ccctgtgtagccaaattc）。PCR在12.5μl反应中进行，其中包含1.25μl cDNA、1×PCR缓冲液（GeneChoice）、0.2 mM dNTPs、0.26 pmol/μl每个引物和0.25 U塔克聚合酶（GeneChoice）。引物在63°C下退火。
表达载体的构建与转染
两种含有FLAG标记的哺乳动物表达载体ZCD2型构建了cDNA，其中一个在N端有FLAG，另一个在C端。使用寡核苷酸生成带有限制酶末端的FLAG标签，并将其插入目的载体pDEST26（Invitrogen）。对于N末端的FLAG标签，引物是ggaccatggcgtactaccacacaagacgacgacaagt和gcggaccatgcataccacacacaaga，它们创建了一个囊II站点位于5′端和Xba公司I位于3′端。对于C-末端FLAG标签，引物是gtacaagtggttgactacaagacgacgacaagtgagagcgt和aaagtgtgactacaaaagacga，这两个引物产生了一个Bsr公司5′端的GI位点，然后是FLAG序列上游的attB2位点，后面是终止密码子Aat公司II站点位于3′端。
对于N端FLAG结构，使用囊II和Xba公司I站点。对于C末端FLAG-tag结构，使用萨尔我和Hin公司dIII并克隆到pBluescript KS（Stratagene）；然后，通过使用英国标准普尔GI和Aat公司II站点；最后，包含FLAG标签的pDEST26片段被克隆回萨尔我和Nhe公司pDEST26载体的I位点。
ZCD2型cDNA来自IMAGE克隆5105935（Invitrogen）。它被子克隆到生态RI和Xho公司I输入载体pENTR3C（Invitrogen）的位点，创建pENTR5105935。为了在C末端创建带有FLAG标签的融合蛋白ZCD2型以pENTR5105935为模板，利用引物pENTR3C-F2（tggcttttgcgtttctac）和pogo3′no-stop XhoR（gccgctcaggctacttctttctcagtattagtg）通过PCR产生无终止密码子的cDNA，并克隆到生态pBluescript SK（Stratagene）的RV站点。通过测序检查克隆的完整性，然后使用生态RI公司/Xho公司I站点。
这个ZCD2型cDNA和ZCD2型使用Gateway LR Clonase II试剂盒（Invitrogen），通过lamda重组反应，将pENTR3C载体中的no-stop cDNA分别克隆到N端FLAG-tag pDEST26载体和C端FLAG-tag pDEST 26载体。通过测序确认表达结构的序列。按照制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将pN-FLAG ZCD2或pC-FLAG ZCD2转染到P19或HEK293细胞中。
共焦免疫荧光显微镜
HEK293和P19细胞在4孔玻片（Lab-Tek）上生长过夜。用pN-FLAG ZCD2或pC-FLAG ZCD 2转染细胞，并培养过夜。将细胞在PBS中的4%多聚甲醛中在室温下固定20分钟。用PBS清洗一次后，在室温下用0.2%Triton X-100在PBS中渗透细胞10分钟。然后，在室温下用1%牛血清白蛋白在PBS中封闭细胞30分钟。然后在室温下，用抗钙连蛋白抗体（Santa Cruz）、抗FLAG M2单克隆抗体（SIGMA）或两者以1μg/250μl的浓度在PBS中的1%BSA中培养细胞1小时。在PBS中的1%BSA中洗涤两次后，在室温下用Alexa Fluor 488抗小鼠（Invitrogen）、Alexa Fluor 568抗兔（Invit罗gen）或两者在PBS的5%BSA中以1:250的稀释度培养细胞30分钟。细胞在PBS中清洗三次，并在SlowFade Antifade Kit的pH平衡溶液中与4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（Invitrogen）平衡10分钟。向细胞中添加带有SlowFade的DAPI安装介质。使用Leica TCS SP2 AOBS共焦显微镜和LCS软件获得共焦显微图像。
Western-Blot分析和免疫沉淀
收集转染的HEK293细胞和P19细胞颗粒，然后用放射免疫沉淀（RIPA）缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH7.4]，10 mM NaCl）溶解2，3 mM氯化镁2、1%NP-40和0.25%Na-脱氧胆酸）和40μl/ml蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）。将溶解的细胞制成丸，并以1:1的比例添加SDS负载缓冲液。将裂解液在55°C下变性30分钟，然后加载到10%的聚丙烯酰胺凝胶上，然后将其电印在聚偏氟乙烯膜（BioRad）上。分别以1:1000和1:2000的稀释度加入小鼠抗FLAG（SIGMA）和兔抗WFS1（NOVUS）的初级抗体。然后以1:10000的稀释度添加适当的二级抗体用于抗鼠抗体，1:2000的稀释度用于抗兔抗体。使用Western Lightning化学发光试剂plus（PerkinElmer）对免疫反应蛋白进行可视化。
对于免疫沉淀，将5μg/ml一级抗体添加到全细胞裂解液中，并在冰上放置2 h，并定期搅拌。然后，向全细胞裂解液中添加50μl预洗蛋白A琼脂糖珠（Amersham），并在4°C下搅拌培养过夜。珠子被制成颗粒，上清液被丢弃。然后用RIPA缓冲液洗涤珠子两次，将其重新悬浮在18μl的2×SDS负载缓冲液中，并在55°C下变性30 min。然后用western blot分析蛋白质。
钙2+研究
浓度为1×10的淋巴母细胞6在测量钙之前，将每毫升细胞涂布在用0.1%明胶处理48小时的盖玻片上2+.钙2+测量和计算按别处所述进行19单个淋巴母细胞。简言之，细胞内钙2+（[钙2+]i） 使用Ca测量2+-敏感染料fura-2-AM（分子探针）。钙2+值由钙的荧光比率确定2+-在盲法试验中，结合fura-2（340nm激发）到未结合fura2（380nm激发）。对于基础钙2+测量30～37个细胞。单元格的子集(n个=8）用2μM thapsigargin（TG）处理。使用非配对双尾模型计算平均SEt吨95%CI的测试。
结果
临床更新
WS-2系列
个体V:2在原始血统中，12在与抑郁症斗争了很长一段时间后，受影响的患者在本研究前约5年自杀。个体V:9在原始血统中12出现了高频感音神经性听力损失，尽管没有他兄弟姐妹的严重。
WS-3系列
个体II：3人在本研究前～7年死亡（在原始链接文章发表后12)透析并发症。他在透析期间出现肾衰竭和出血。个体二：9人在本研究前5年死亡，死因不明。
WS-4系列
所有受影响的家庭成员现在都患有糖尿病、视神经萎缩和高频感音神经性聋。糖尿病病情轻微，使用低剂量胰岛素很容易纠正。目前，所有四名受影响的人都有听力损失的症状，而不仅仅是在听力测试期间。
突变检测
标记之间WFS2基因的关键区域D4S591型和D4S3240、，是一个代表7.1 cM的大区域。为了缩小关键基因区域，该区域内的其他标记在家族中进行了基因分型。这些包括标记D4S2961、D4S3043、D4S1572、Wpoly2、，D4S2913、D4S411、，和D4S1531号在近端和D4S2917，聚乙烯5，聚乙烯6，和聚乙烯7在远端。Wpoly标记是由人造卫星这是一个扫描基因组DNA、识别DNA内微卫星延伸并评估其多态性潜力的程序。这些标记要么在家族中没有信息，要么没有越过重组断点；因此，关键基因区域无法缩小（数据未显示）。
关键基因区间包含62个转录物，包括已知基因、全长cDNA、EST和预测蛋白。为了减少基因列表，没有研究没有起始密码子和终止密码子的预测蛋白质。此外，还使用BLAST对翻译后的序列进行同源性搜索，从而消除了额外的假定基因。这在该地区留下了42个待研究的转录本，包括一个优秀的候选基因，银行1，已知可诱导钙2+B细胞动员。20
从已知基因和全长cDNA开始，通过直接测序或SSCP分析筛选该区域中的所有基因。已鉴定出多种多态性，但新预测基因中只有一个核苷酸变化，ZCD2、，发现是这些家族中的WFS2突变。预计核苷酸109中的G→C颠倒将氨基酸37从谷氨酸转变为谷氨酰胺（E37Q）(). 这三个家族中都发现了相同的突变。这些家族尚不清楚是否有亲缘关系，但单倍型分析显示，在相关区域有一个共同的单倍型，12这表明了这种突变的共同祖先。这一变化颠覆了Xmn公司我限制了用于基因型家族成员的酶位点。在所有三个约旦家庭中，突变与表型完全分离(). 所有三个家系的母亲都是专性携带者，而父亲也是如此，尽管从未从这些人身上获得过样本。在从三个家庭的孩子身上获得的20份原始样本中，目前只有16份可供检测。未检测的四名患者的原始血点未产生任何明显的DNA，也无法获得新的样本。
确定WFS2的单一基板变化原因。A、，对控制个体的结果进行排序(左侧面板)基因外显子2的核苷酸109处有一个GZCD2型编码谷氨酸的基因和受影响个体的序列(右侧面板)在同一位置有一个纯合C，将氨基酸转变为谷氨酰胺。B、，WFS2影响家族的截断家谱。突变的基因分型显示在家系下面。所有家谱都代表近亲交配。只有携带DNA样本的儿童才会出现。根据最初公布的血统名称对儿童进行编号。12突变破坏了Xmn公司I限制酶位点（GAANNNTTC），纯合子受累个体显示249-bp片段，而野生型等位基因被切割成210-bp片段和39-bp片段（未显示）。
包含突变的扩增区域在每个家族中至少一个受影响个体中测序，所有个体均显示109G→C突变。SNP数据库中未找到此更改(数据库SNP). 针对突变的自定义TaqMan SNP基因分型用于筛查来自不同人群的大量对照个体的这种变化。在种族匹配的对照人群中，只有一条染色体发生了变化。来自受影响约旦家庭的一名个人是约旦控制小组的成员。由于该面板是匿名的，因此不知道控制面板中包括哪些家庭成员。这种变化的等位基因频率在约旦人群中为0.08%，在2004年染色体评估后在其他人群中未发现。由于这是一种常染色体隐性疾病，很小一部分人群可能以杂合子状态携带这种变化，尽管在我们的小组中，携带这种变化的单个样本可能是来自所研究家族的携带者。
蛋白质分析
这个ZCD2型一种非常小的135-aa蛋白的基因编码，其分子量估计为15278Da(). 它有一个预测的跨膜结构域和一个CDGSH型的锌指结构域，位于羧基末端附近。这个锌指与另一个人类基因编码的蛋白质中的结构域相似(ZCD1型)对于许多单细胞生物中的蛋白质，其功能都是未知的。来自狗、小鼠、大鼠、鸡、两种青蛙、两种鱼类和黑腹果蝇已确定。该蛋白高度保守，在所有脊椎动物物种中具有70%的同源性和82%的相似性(). 人类和果蝇属蛋白质有46%相同，68%相似。虽然在所有物种中只有四个丝氨酸和/或苏氨酸位点是保守的，但在人类蛋白质中发现了几个丝氨酸和（或）苏氨酸和一个酪氨酸磷酸化位点，包括果蝇属(). 该蛋白质在氨基酸25–29（[E/D][S/T]XXX）处有一个单一的β-肾上腺素能受体激酶位点，21氨基酸32–34和67–69处的两个PKA/PKC激酶基序（[R/K]X[S/T]），22和单个CK2（以前是酪蛋白激酶2）磷酸化位点（[S/T]XX[D/E]）23氨基酸34-37，包含最后一个位置的突变。
九种植物ERIS氨基酸序列的比较。图中显示了人类序列，其他物种中相同的氨基酸用破折号表示。星号（*）代表该物种中缺失的氨基酸。粗体氨基酸表示预测的保守磷酸化位点（β-肾上腺素能受体激酶底物在25-29；PKA/PKC激酶底物基序在32-34和67-69；CK2底物基模在34-37）。约旦家庭ERIS中突变的谷氨酸由箭头指示。带下划线的氨基酸代表假定的跨膜结构域。双下划线氨基酸突出了蛋白质的锌指结构域。未标记的箭头表示cDNA中与拼接连接相对应的区域。
失聪突变筛查
虽然WFS是一种隐性疾病WFS1型该基因与非综合征性听力损失和伴有听力损伤的视神经萎缩有关。9–11六个家庭WFS1型突变导致低频感音神经性聋，9另外还有一个家庭患有渐进性听力损失，低频段听力损失轻微，但所有频率的听力损失均为渐进至中度。10WFS患者的听力损失主要涉及高频，这在WFS2影响的家庭中也可以观察到。三,12确定是否ZCD2型在一个受听力损失影响的人群中，我们对377名先证者进行了基因突变筛查ZCD2。在这个队列中没有发现突变，所以看起来ZCD2型非综合征性耳聋并不常见。只有一名先证者有低频感音神经性听力损失，因此尚待确定ZCD2型与这部分听力损失有关。
表达研究
通过对来自多种人类组织的RNA进行RT-PCR，观察到大多数组织中都有表达，包括大脑和胰腺。在软骨、胎肝和骨骼肌中未观察到表达().
ZCD2型WFS2的表达与疾病发病机制。A、，WFS2基因的RT-PCR，ZCD2、，在各种组织中(顶行)和GADPH公司控制(最下面一行).B、，用RT-PCR技术对两个对照个体（C1和C2）和一个受影响个体（A）的淋巴母细胞RNA进行检测ZCD2型cDNA引物。引物扩增全长cDNA；大带为551bp，小带为336bp。车道M是分子标记。C、，内含子-外显子边界的基因组序列显示突变(粗体和下划线)位于3′拼接受体位点的6bp范围内。下面，cDNA和氨基酸序列显示在外显子1和外显子2之间的边界处，与受影响个体的外显子1~3剪接在一起时出现的提前终止密码子相比。
疾病发病机制
突变的谷氨酸在所有物种中都是保守的，除了小鼠，在小鼠中有天冬氨酸残基(). 用天冬氨酸替换37位的谷氨酸残基不会破坏CK2磷酸化位点。此网站也位于果蝇，尽管序列是发散的（SFKD）。突变改变了单一保守CK2位点的保守谷氨酸，这将消除该位点的磷酸化。可以合理地得出结论，功能域的破坏将指示疾病的发病机制，但实际上，突变也会产生剪接突变。
成熟cDNA来自三个外显子。突变碱基位于第2外显子的5′端附近，距离内含子-外显子连接处有6个碱基。用引物扩增全长cDNA的RT-PCR在来自一名受影响个体和两名对照的淋巴母细胞RNA的模板上的表现表明，受影响个体的产物为336 bp，而对照组的产物为551 bp，其大小符合预期(). 对RT-PCR产物进行测序表明，336-bp的产物是外显子2在最终转录中被跳过的结果(). 这种较小的RT-PCR产物在其他组织类型的RNA中未观察到，可能不是剪接变体（数据未显示）。
异常剪接产物将编码外显子1的34个氨基酸，但外显子3的移码将在额外8个氨基酸后产生一个过早的终止密码子。这将消除75%的蛋白质，包括跨膜和锌指结构域。这种特殊的核苷酸变化并不存在于任何已知的剪接受体或供体区域；因此，这种改变很可能破坏了外显子剪接增强子（ESE）。
ERIS蜂窝定位
为了确定ZCD2、，人类基因在氨基（N-）或羧基（C-）末端用FLAG标记，并在小鼠P19和人类HEK293细胞中表达。N-FLAG蛋白定位于内质网，与已知内质网标记物calnexin共定位24(). 由于蛋白质的预测结构域和细胞定位，我们将其命名为ZCD2型-编码蛋白“ERIS”(e（电子）内质的第页小叶我膜间秒mall蛋白质）。
ERIS的定位和免疫沉淀。A、，pN-FLAG ZCD2转染P19细胞。在面板1中，转染细胞用DAPI染色。面板2显示ER标记calnexin(红色). 面板3显示pN-FLAG ZCD2(绿色). 只有一部分转染细胞显示pN-FLAG ZCD2表达。面板4显示了合并的图片，其中pN-FLAG ZCD2与ER中的calnexin共定位。B、，来自用pC FLAG ZCD2转染的HEK293细胞的细胞裂解物，使用抗WFS1抗体进行免疫沉淀(车道1)和抗FLAG抗体(车道2). 用抗WFS1抗体探测印迹的上半部分，用抗FLAG抗体探测印记的下半部分。通道1在100kDa处显示出强Wolframin带，但没有显示pC-FLAG ZCD2（17.5kDa）。在2号车道上观察到pC-FLAG ZCD2，没有Wolframin。19-kDa带代表免疫球蛋白G，而其他带代表抗体的非特异性结合。使用pN-FLAG ZCD2进行实验时，观察到相同的结果（数据未显示）。
ERIS与Wolframin无相互作用
确定ERIS是否与WFS1型-在表达N-FLAG和C-FLAG ERIS的细胞系中进行了编码蛋白、Wolframin和共免疫沉淀研究。Wolframin不与ERIS共沉淀().
钙2+测量
休息[钙2+]来自受影响个体的淋巴母细胞系与来自未受影响对照组的细胞系的i水平没有显著差异(). 当受到TG刺激时，一种已知的ER-Ca刺激物2+释放后，细胞内钙显著增多2+受影响细胞系中的释放比未受影响细胞株中的释放（图。–).
细胞内钙2+测量值。A、，平均基础[Ca无差异2+]野生型和突变型细胞间的i水平观察(n个=30–37;P（P）=.49).B、，平均值[Ca2+]当用2 mM TG刺激时，i增加，突变细胞中的i明显大于野生型细胞(n个=8; 星号[*]表示重要性[P（P）=.03]). 图中还显示了[Ca的代表性单电池测量值2+]i突变型的变化(C类)和野生型(天)TG刺激的细胞。
讨论
大多数WFS病例似乎是由WFS1型但是，在许多研究中，已经有证据表明遗传异质性。12,25–27我们已经证明锌指基因的突变，ZCD2、，也会导致WFS。在所研究的三个无血缘关系的约旦家庭中都发现了相同的错义突变。通过单倍型分析，很明显这些家族有共同的祖先。12尽管错义突变发生在保守氨基酸处，但核苷酸变化的实际发病机制已被证明影响mRNA剪接。突变导致外显子2被跳过，从而导致移码导致终止密码子提前，导致超过75%的蛋白质丢失，包括假定的跨膜结构域和锌指结构域。尽管突变在功能上影响剪接，但围绕突变位点的10 bp并不能证明ESE的一致性。一些定义最好的ESE共享两个功能之一。一类ESE显示高嘌呤含量（⩾80%），尽管已知该区域内的特定序列很重要；第二类ESE富含A/C。28 ZCD2型在突变附近的序列中编码60%的嘌呤，该区域并不特别富含AC。事实上，突变用C替换了G。众所周知，大量序列可以作为ESE发挥作用，但不符合任何特定序列。我们在中确定了一个功能性ESEZCD2型不符合ESE的已知类别。
我们没有发现ZCD2型在一个由377名非综合征性耳聋多发家庭患者组成的大队列中。Dominant mutations in theWFS1型在患有低频感音神经性耳聋或进行性耳聋的DFNA6/14受累家庭中已报告该基因。9,10在377名先证者中，240名为常染色体隐性遗传，84名为显性听力损失，53名为杂合子，原因是基因突变GJB2型基因。尽管大多数人有严重听力损失，但14人有高频听力损失，只有1人有低频听力损失。ZCD2型似乎一般与非综合征性听力损失无关，但它是否与低频听力损失有关，类似于WFS1型基因。
ZCD2型有一个相当广泛的表达谱，包括胰腺和大脑这两个受疾病影响的组织。由于转录物可以从淋巴母细胞衍生的RNA中扩增，因此也可能在血细胞谱系中表达。使用质谱法进行的表达研究人类蛋白质参考数据库（加入编号17413）表明ZCD2型血小板中的转录物。17这与这些家族中描述的出血表型相关。
虽然我们没有在组织切片上进行原位杂交，但这些实验是在小鼠的矢状切片上进行的Zcd2号机组成绩单（登录号1500009M05Rik）作为脑图谱项目。29该基因在成年小鼠大脑的多种结构中均有表达，包括大脑皮层、梨状区、海马锥体细胞、杏仁核中央、延髓、脑桥、丘脑、脑干上下丘、浦肯野细胞层和小脑齿状核。有趣的是Zcd2号机组小鼠和Wfs1型在大鼠大脑中。7这些大脑区域主要控制记忆、情绪和运动技能。已知患有WFS的患者有神经并发症，如小脑共济失调和肌阵挛，以及精神疾病。4
对WFS患者的磁共振成像研究显示脑干、小脑、视神经、束和交叉变性。30死后研究了少数受WFS-影响的大脑。这些研究显示了特定脑干结构的退化，也显示了更广泛的病理学。31,32许多其他区域的神经退化Zcd2型也观察到了。这些包括上下丘、丘脑（脑干）、脑桥核、浦肯野细胞和脑桥。还观察到耳蜗神经丢失和耳蜗核轻度丢失。一般来说，WFS中的神经退行性变似乎与ZCD2。因为感觉神经元、胰岛β细胞的缺失、下丘脑的缺失或发育不全可以解释主要的临床症状，ZCD2型这些组织中的表达需要进一步检查。
ERIS是一种非常小但很保守的蛋白质。间接免疫荧光研究表明该蛋白定位于内质网。ERIS在氨基末端没有预测的内质网信号序列，但有一个跨膜结构域。已证明跨膜蛋白利用其第一个跨膜结构域直接进入内质网。33另一个主要预测域是带有CCHH指的CDGSH型锌指结构域。锌填充结构域现在已知能够结合核酸、脂质和蛋白质。34在表达N-或C-FLAG ERIS的细胞系中进行的Wolframin联合免疫沉淀研究表明，Wolframine不与ERIS共沉淀或相互作用。
已经对Wolframin进行了很好的研究，表明它定位于内质网并在调节[Ca2+]一、。尽管[Ca2+]受WFS2影响的淋巴细胞和对照淋巴细胞之间的i水平没有显著差异，[Ca显著增加2+]当TG刺激受影响细胞时，可以观察到受影响细胞中的i。TG是已知的肌（内质网）钙的抑制剂2+ATP酶，导致ER-Ca2+流出。35这与ERIS在[Ca中的作用一致2+]i表达该基因的细胞内的稳态。最近，有证据表明WFS1型HEK293细胞中Ca的增加较低2+当TG添加到培养基中时，表明钙水平较低2+在ER中（[Ca2+]急诊室)在不含Wolframin的细胞中。36测量Ca的速率2+回到内质网的运动表明该速率降低，表明沃尔夫拉明在内质网钙中的作用2+吸收。36需要进行额外的研究，以确定TG刺激的Ca是否更大2+WFS2影响细胞中的释放是由于较高的[Ca2+]急诊室.
这种疾病的症状是由神经元和胰岛β细胞变性引起的。[加利福尼亚州2+]急诊室不仅对信号传导很重要，而且对新合成的蛋白质的折叠和加工也很重要，这些蛋白质已被证明是Ca2+-依赖性反应。37,38细胞系和动物WFS1型不足表明内质网应激会触发未折叠蛋白反应（UPR），损害细胞周期进展，并增加胰腺β细胞的凋亡。39,40沃尔科特-雷利森综合征（MIM226980)是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，其症状之一是婴儿期糖尿病，由EIF2AK3，编码翻译起始因子2-α激酶3，一种在UPR中重要的激酶。41新合成蛋白质的折叠和加工需要高钙2+水平；因此，高阶正常[Ca2+]急诊室可能不会损害蛋白质折叠并触发UPR。
高[Ca2+]急诊室已经证明具有多种不同的细胞效应。它可以增加钙2+心肌细胞释放速率常数42,43; 可以影响赖氨酸受体的敏感性，赖氨酸是一种主要的内质网钙2+释放通道44,45; 并能抑制钙2+并影响小鼠胰腺腺泡细胞和大鼠背根神经节感觉神经元的摄取速度。46,47有趣的是，小鼠早老素-1阿尔茨海默病突变的敲除显示增加了[Ca2+]急诊室.48在这些小鼠的海马神经元中，谷氨酸诱导的氧化应激和线粒体功能障碍增强，导致兴奋毒性神经元坏死细胞死亡的阈值降低。49线粒体也是钙的重要组成部分2+信号，因为它们可以快速隔离钙2+在初始Ca之后2+在恢复阶段，通过渗透性过渡孔（PTP）缓慢释放。50,51用Ca超载ER2+通过钙超载提高神经酰胺诱导凋亡的敏感性2+线粒体和细胞色素的释放c、，通过形成PTP。52,53干扰Ca2+体内平衡似乎使细胞容易发生多种形式的细胞死亡。
目前已经证明WFS至少由两种不同的基因引起，WFS1型和ZCD2。它们都编码ER蛋白，似乎影响细胞钙2+平衡。WFS1型也与非综合征性听力损失和视神经萎缩有关。ZCD2型在这些疾病的个别病例中可能很重要。这两个基因是否位于同一通路中，以及每个基因使用何种特定机制导致神经和胰腺变性，还有待确定。
致谢
我们感谢Lin Li博士和B.Todd Webb博士的技术援助。我们感谢参与这项研究的家庭。我们感谢国家糖尿病、内分泌学和遗传学中心的工作人员为采集样本和细胞株提供了便利。共聚焦显微镜在弗吉尼亚联邦大学神经生物学和解剖学系显微镜设施进行，部分由美国国立卫生研究院（NIH）-美国国立神经疾病和中风研究所中心核心拨款5P3ONSO47463支持。K.A.和H.E.-S.由国家糖尿病、内分泌和遗传学中心以及高级科学技术委员会资助；L.S.S.和M.Z.由NIH拨款RO1 DK46409RS支持；美国糖尿病协会拨款1-03-RA-80支持C.H.和R.S。
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