果蝇属UTX是一种组蛋白H3 Lys27脱甲基酶，以RNA聚合酶II的延伸形式进行共沸^▿

摘要

组蛋白H3在赖氨酸27处的甲基化（H3K27甲基化）是一种染色质修饰，在沉默基因处富集，并由Polycomb（PcG）组蛋白介导(24,28). PcG蛋白是动物发育过程中稳定维持HOX基因沉默所必需的。相反，蛋白质的三唑（trxG）组介导H3的Lys4甲基化（H3K4甲基化），这与HOX基因开放染色质的维持有关，以确保这些基因在发育过程中的正确表达(28). 这些蛋白质在细胞记忆中的作用，以及组蛋白甲基化相对于其他组蛋白修饰的稳定性，导致假设H3K4和H3K27甲基化标记也稳定。然而，最近组蛋白赖氨酸去甲基化酶的发现导致了对许多组蛋白甲基化标记稳定性的重新评估(18,25,27).

以前，我们和其他人证明了三胸类基因小型影像光盘(盖子)编码一种含有JmjC结构域的组蛋白去甲基酶，去甲基化三甲基化的H3K4（H3K4me3）(9,22,26). While期间盖子在基因上被归类为trxG公司中的成员黑腹果蝇是Lid的人类同源物Jarid1D，已被发现与PcG蛋白相关(20)，表明负责维持Lys27甲基化和基因沉默的细胞机制部分通过激活的H3K4三甲基标记去甲基化而起作用。为了继续努力了解JmjC去甲基化酶的细胞和分子功能，我们一直在研究这些因子的生化和遗传特性。在本文中，我们描述了果蝇属UTX同源物，一种含有JmjC结构域的组蛋白去甲基酶，去甲基化H3K27me3，与Polycomb阻遏相关的标记。我们发现dUTX与转录活跃基因上的RNA聚合酶II（Pol II）密切相关，包括热休克位点，这表明H3K27对转录稳定基因上预先启动的Pol II的去甲基化可能起作用。

材料和方法

结果和讨论

最近，人类UTX蛋白已被证明具有H3K27去甲基化酶的功能(21). 为了了解这种酶的细胞和分子特性，我们鉴定了它的果蝇属同源，dUTX（图。​（图1A）。1安培). UTX最初被发现是哺乳动物Y染色体上一个普遍转录基因的X连锁同源物(14). 除了C末端JmjC结构域外，UTX和UTY还包含一个N末端结构域，其中含有几个四肽重复序列，这些重复序列是多种具有不同细胞功能的蛋白质中发现的多功能蛋白质结合模块(6). 值得注意的是，UTX最近被鉴定为三唑烷相关的MLL3和MLL4复合物的一种成分，它们介导赖氨酸4上H3的甲基化(5,16). 总之，这些发现揭示了Polycomb和trithorax蛋白通过组蛋白甲基化和去甲基化调节基因表达的复杂性。

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图1。

这个果蝇属UTX的同源物是一种H3赖氨酸27脱甲基酶。（A） 的域组织示意图果蝇属UTX（CG5640）及其人类同源物。UTX家族成员在C端有一个保守的JmjC结构域，在N端有5到6个四肽重复序列（TPR）。人类UTX和UTY分别是来自性染色体假常染色体部分的X和Y染色体连锁同源物，因此高度相似。由于这种X-Y对的Y连锁拷贝通常以更高的速率突变(13)，X连锁拷贝UTX可以被认为与果蝇属同源。与UTY或JMJD3相比，dUTX与UTX的总体序列一致性更高。（B） 重组dUTX在杆状病毒系统中的表达。从SF21细胞中纯化N-末端标记的dUTX。星号表示非特异性多肽。（C） 在以散装组蛋白为底物的组蛋白去甲基化试验中使用不同数量的重组dUTX（1和2μg），并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应混合物，然后用组蛋白甲基化不同位点的抗体进行Western印迹。1m，单甲基化；2m，二甲基化；3m，三甲基化。（D） 在JmjC结构域的预测铁结合位点中表达具有双重突变（H883A和E885A）的突变型dUTX（dUTXm）。按照面板B所述纯化重组dUTXm。（E）H3K27脱甲基酶活性与dUTX或dUTXm各2μg的比较。只有野生型dUTX才能去甲基化H3K27me3，这表明所观察到的酶活性是dUTX多肽固有的。

为了确定dUTX在体外是否是组蛋白去甲基化酶，使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达重组dUTX（图。​（图1B）。1B年). 当与总组蛋白混合时，dUTX特异性地去甲基化二甲基和三甲基但非单甲基化H3K27（图。​（图1C）。1摄氏度). 此外，在体外，dUTX不能去除其他抑制性染色质标记，如H3K9me3或H4K20me3，或与活性转录相关的甲基化标记的位点，例如H3K4me3和H3K36me3（图。​（图1C）。1摄氏度). 虽然H3K27的二甲基和三甲基形式主要存在于抑制染色质位点，但H3K17的单甲基形式存在于转录基因的编码区(三). Polycomb对结合三甲基形式的H3K27有强烈的偏好，这表明去甲基化到二甲基或单甲基形式可能会破坏Polycomm结合(10). 为了确保观察到的去甲基化酶活性是dUTX固有的，而不是一种铜纯化蛋白，我们设计了一个在JmjC结构域中具有双重突变的dUTX突变体，并在杆状病毒系统中表达（图。​（图1D）。一维). 纯化的突变酶缺乏催化活性，表明dUTX是H3K27脱甲基酶（图。​（图1E1E级).

H3K27甲基化通常与转录沉默的稳定维持有关。因此，确定dUTX的基因组分布很有意义。针对C末端肽制备抗-dUTX抗体，并测试其对全长dUTX的反应性。该抗体识别感染病毒的SF21细胞中的dUTX果蝇属UTX杆状病毒（图。​（图2A）。2安培). 为了帮助验证抗体的特异性，我们使用了从日本国立遗传学研究所获得的dUTX靶向RNAi转基因系。与控制唾液腺多烯染色体相比，使用抗dUTX抗血清进行敲除的免疫染色水平显著降低（图。2B至G). 该RNAi系还用于评估成年苍蝇提取物中H3K27甲基化水平。在归一化为总H3水平后，在成年苍蝇的总组蛋白中观察到H3K27甲基化适度富集（图。​（图2H）。2小时). 然而，我们无法通过免疫荧光检测到第三代星体幼虫多烯染色体上H3K27甲基化水平的显著变化（数据未显示）。这可能表明除dUTX外，其他因素也参与体内H3K27去甲基化，或者dUTX可能在发育过程中的特定位点发挥作用。

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图2。

体内脱甲基酶活性。（A） Western blot证明抗dUTX抗体（α-dUTX）可识别全长dUTX蛋白。用dUTX杆状病毒感染SF21细胞，并用亲和纯化的识别dUTX的兔多克隆抗体进行检测。将来自未感染（−）和dUTX病毒感染（+）细胞的两种不同数量的全细胞提取物加载到凝胶上。（B到G）dUTX抗体用于证明在RNAi后dUTX蛋白水平的降低果蝇属第三颗星幼虫。用抗dUTX抗体（D和G）对对照（B到D）或RNAi（E到G）幼虫的唾液腺进行免疫染色。对照和dUTX击倒幼虫的HP1水平相当（C和F）。（B和E）相应的相控图像。（H） dUTX敲低的苍蝇中H3K27甲基化水平升高。增加总组蛋白含量的蛋白质印迹盖子用H3K27甲基化抗体和总组蛋白H3抗体检测RNAi敲除（RNAi ON）或对照（RNAi OFF）果蝇。

由于dUTX染色似乎发生在带间区域，通常是活性转录的位点，我们用识别Pol II延长和暂停形式的抗体对染色体进行联合染色（图。3A至H). 与伸长型RNA聚合酶（Ser2-磷酸化C末端结构域[CTD]）有非常广泛的共定位，与参与但暂停型RNA聚聚酶（Ser5-磷酸化CTD）有较小程度的共定位。虽然Lys4去甲基化酶Lid也存在于带间区域，但它与RNA聚合酶的伸长形式没有共定位(22)，证明了这些酶的不同生物学作用。

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图3。

用RNA聚合酶II的伸长形式（A到D）对dUTX进行克隆化，与接合但暂停的形式（E到H）形成对比。（B） 负责RNA聚合酶延伸形式的Ser2-磷酸化CTD。（C和G）dUTX在多线染色体上的免疫定位。（D） 面板B和C的合并，显示Ser2-磷酸化Pol II和dUTX的共定位。（F） 为Pol II参与但暂停的Ser5-磷酸化CTD支付费用。（H） 面板F和G的合并，仅显示部分同位化。（A和E）相应的相控图像。

测试dUTX是否可以在激活后被招募到基因中，类似于我们和其他人测试的其他延伸因子(1,4,11,12,31)我们将hsp70基因作为模型诱导基因。在热休克前和热休克5min后对Schneider 2细胞进行染色质免疫沉淀。针对dUTX和RNA聚合酶的抗体都能在热休克后提高hsp70基因的水平（图。​（图4A）。4A级). 与Schneider 2细胞的染色质免疫沉淀结果一致，dUTX在多基因染色体上的主要热休克位点（烟团）高度富集（图。4B至E). 此外，我们证明细胞提取物中的dUTX存在于与Pol II相关的复合物中（图。​（图4F4楼).

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图4。

dUTX被招募用于热休克基因。（A） 热休克（无热休克[NHS]）前和热休克（HS）5分钟后，用dUTX或RNA聚合酶（单克隆抗体8WG16）从Schneider 2（Dmal-2）细胞进行染色质免疫沉淀。热休克基因的引物1 kb用于测量热休克基因对dUTX和Pol II的补充。Rp49水平显示用于比较。免疫沉淀物中回收的输入DNA的百分比显示为年轴。误差条表示两个实验的范围。（B到E）dUTX在果蝇属唾液腺。（B） 相位对比图显示了主要热休克部位的肿胀，如箭头所示。（C到E）dUTX（C）和Pol II（D）的伸长、Ser2-磷酸化形式在B组所示的三个热休克位点上共定位（E）。（F）使用两种不同的dUTX抗体或免疫前血清（Pre-Im）进行免疫沉淀分析果蝇属核提取物。用单克隆抗体8WG16检测Pol II与dUTX的相互作用。

H3K27脱甲基酶与RNA聚合酶延伸形式的共定位是意料之外的，但这标志着我们对组蛋白修饰调节基因表达的机制知之甚少。最近发现人类UTX与trithorax家族成员相关，这与dUTX在转录基因中的作用一致(5,16). 虽然没有直接证据表明Lys27在编码区中去甲基化，但最近的一项研究发现了大量具有暂停聚合酶的基因，这很有趣(15). 洛林茨和舒贝尔(23)推测Polycomb组蛋白可能是这些聚合酶暂停的原因。在这种情况下，我们发现Lys27去甲基酶与RNA聚合酶的延伸形式共定位，这表明去甲基化可能是激活这些基因的途径中的关键步骤。

附录

在综述这篇文章的同时，一些小组报告了UTX和相关酶JMJD3在人类中的脱甲基酶活性(2,7,17,19,32).

致谢

脚注

参考文献