CXCR4在维持外周血B细胞亚群和体液免疫中的作用

流式细胞术和磁性细胞分选（MACS）。

从骨髓、脾脏、淋巴结和腹膜腔中采集细胞。使用以下抗体：FITC-结合的抗CD3、抗CD11b和抗CD21；PE结合抗CD5、抗CD23和抗IgM；别藻蓝蛋白（APC）-Cy7偶联抗B220；链霉亲和素-PE-Cy7（全部来自eBioscience）；PE结合抗CD138；以及生物素化抗CXCR4和抗CXCR5（BD Biosciences）。使用LSR II（Becton Dickinson）进行分析。为了纯化脾脏B细胞用于Southern分析和趋化性分析，从突变和野生型小鼠中分离的脾细胞被生物素化抗B220标记，然后与链霉亲和素结合的磁珠结合。使用MACS（Miltenyi Biotec）对标记细胞进行分类。在Microsoft Excel软件上进行统计分析。

附件五测定。

在膜联蛋白V结合缓冲液（BD Biosciences）中用生物素化膜联蛋白Ⅴ标记脾细胞。然后用PE抗B220和FITC抗IgM（BD Biosciences）对细胞进行染色。生物素-膜联蛋白V通过结合链霉亲和素的APC显示。细胞在LSR II（Becton Dickinson）上进行分析。

趋化试验。

MACS纯化的B细胞在DMEM中重新悬浮，10%FCS在10⁷/毫升。将100μl B细胞装入一个5μM孔径的跨阱（Corning Costar）的上腔。将600μl含有或不含有500 ng/ml CXCL12（研发系统）的培养基填充到下室。在孵育3小时后，收集迁移至下室的细胞并进行计数。

免疫组织学。

小鼠脾脏在液氮中快速冷冻，并嵌入OCT包埋介质（Sakura Finetek）中。将8-μM切片风干并用丙酮固定。使用以下试剂进行染色：抗B220–Alexa 488或抗B220-Alexa 568（分子探针）、抗MOMA-1–生物素（BMA Biomedical）、抗IgM-FITC（BD Biosciences）、抗-IgD-FITC（Southern Biotechnology Associates，Inc.）、抗PNA-生物素（Vector Laboratories）、抗CD3-生物素（BD bioscience）、，链霉亲和素–Alexa 633和链霉亲和素–Alexa 568（分子探针）。

CXCR4防止B细胞前体过早迁移到外围。

中国人T细胞和髓细胞的发育和定位Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}小鼠不受B系特异性CXCR4失活的影响（未描述）。前/前（CD19）的产生⁺B220型^洛免疫球蛋白⁻)和不成熟（CD19⁺B220型^洛免疫球蛋白⁺)B细胞在Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}骨髓(图2B） ●●●●。骨髓中B细胞的高效生成Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /克里}小鼠并不奇怪，因为众所周知，CD19启动子活性随着B细胞发育的进展而增加，导致B前体细胞中不完全的Cre介导的缺失(33). 我们仅观察到约40%的Cxcr4号机组在B220中^洛免疫球蛋白⁻人口（未描绘）。

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图2。

B细胞前体的生成Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}老鼠。（A） 用流式细胞术分析不同发育阶段B细胞CXCR4的表达。从突变和对照小鼠的骨髓（BM）或脾脏（Spl）分离的细胞用B220、IgM和CXCR4抗体染色。B细胞前体（B220^洛)和成熟B细胞（B220^你好)并且在直方图中显示了门控B细胞上CXCR4的表达水平。实线表示野生型B细胞，虚线表示CXCR4缺乏的B细胞。（B） CD19的流式细胞术分析⁺这两个突变体的骨髓（BM）、外周血（PBL）和脾脏（Spl）中的门控种群(n个=7）和野生型控制(n个= 7). 不同发育阶段的B细胞可以通过B220和IgM的表达来定义。B细胞前体包括前B细胞和前B细胞是B220^洛免疫球蛋白⁻，未成熟B细胞为B220^洛免疫球蛋白^你好，成熟B细胞为B220^你好免疫球蛋白^洛。所示数字和标准偏差表示所示门中单元的百分比。

在骨髓中完成成熟过程的B细胞表达高水平的IgM，失去对骨髓基质的嗜性，并释放到循环中。鉴于CXCR4在保留骨髓中造血祖细胞方面的重要作用，推测B细胞前体的骨髓嗜性也涉及CXCR4信号。与此预测一致，我们观察到CXCR4在B细胞前体（B220）中表达最高水平^洛)并在成熟B细胞（B220）中下调^你好)能够排出骨髓(图2A、 顶部）。在Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}小鼠骨髓和脾脏中成熟B细胞的表面以及大部分B细胞前体的表面都没有CXCR4(图2A） ●●●●。与CXCR4失活相关，CXCR4是Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}小鼠表现出B细胞前体（CD19）的特征⁺B220型^洛免疫球蛋白⁻CD4细胞⁻CD8细胞⁻CD11b型⁻CD11c公司⁻;图2B和未描述）。这一发现扩展了先前的观察，即CXCR4对于保留骨髓中的造血祖细胞至关重要(25,27,28)并证明CXCL12是B细胞前体的亲骨髓因子。

CXCR4缺陷的B细胞前体向脾卵泡的CXCL13非依赖性归巢。

CXCR4缺陷的CD19⁺B220型^洛免疫球蛋白⁻仅在脾脏中发现细胞。淋巴结、腹膜腔和派尔氏结（未描述）上均未发现。它们是淋巴系而非树突状细胞系，因为它们体积小，表达B系特异性标记CD19，但不表达CD4、CD8、CD11b和CD11c（未描述）。这些B细胞不是PNA^你好GC细胞，但可能是B细胞前体，因为它们表达低水平的B220和表面Ig(图3A、 右侧，未描绘）。为了检查CXCR4缺陷的B细胞前体在脾脏内的定位，对脾脏切片进行染色，以同时显示B细胞滤泡（B220⁺免疫球蛋白⁺免疫球蛋白D⁺)和B细胞前体（B220⁺免疫球蛋白⁻免疫球蛋白D⁻). 野生型和突变型小鼠的整体脾脏结构无法区分(图3A、 左）。我们观察到，大多数CXCR4缺陷的B细胞前体定位于脾脏滤泡中Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}老鼠(图3A、 中间）。

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图3。

B细胞前体的定位Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}老鼠。（A） 用FITC抗IgM、FITC抗-IgD和Alexa 568–抗B220抗体对脾切片进行免疫荧光染色（左，放大10倍；中，放大40倍）。右侧，流式细胞术显示正常动物外周的B细胞表达B220和IgM或IgD，突变体中的B细胞前体可以检测到，因为它们只表达B220，而不表达IgM和IgD。（B） CXCR5在骨髓和脾B细胞亚群中的表达。骨髓细胞和脾细胞分离自Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 镉19 ^{+ /Cre公司}和Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^+/+小鼠，并用抗CXCR5、抗B220和抗IgM染色。成熟B220的B细胞亚群^你好，不成熟B220^洛免疫球蛋白⁺B细胞和B细胞前体B220^洛免疫球蛋白⁻被封锁。直方图显示了这些亚群的CXCR5表达水平。实线表示野生型B细胞上的CXCR5水平，虚线表示缺乏CXCR4的B细胞上。野生型脾B220的CXCR5水平^你好细胞，在两个直方图中都显示为黑色实线，代表阳性指标。B220上非特异性大鼠IgG的背景染色⁺单元格显示为阴影直方图。（C） 脾细胞Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}通过最适浓度为1μg/ml CXCL13的跨阱试验分析小鼠的CXCL13反应性。输入和迁移的细胞用PE抗CD19、FITC抗IgM和APC抗B220染色。通过流式细胞术测定输入和迁移细胞群的组成。显示了脾B细胞在不同发育阶段的迁移百分比。数据来自三个重复进行的实验。

B细胞进入初级淋巴滤泡依赖于CXCR5信号(16). 接下来，我们研究了CXCR4缺陷的B细胞前体在脾B细胞滤泡中的归巢是否由CXCR5介导。对野生型和突变小鼠脾脏B细胞的流式细胞术分析表明，CXCR5在B细胞前体细胞上几乎检测不到，并且随着B细胞成熟的进程而增加(图3B） ●●●●。当通过跨阱实验测量CXCL13介导的趋化性时，我们观察到对CXCL13的反应性与不同B细胞亚群上的CXCR5水平一致(图3C） ●●●●。总之，这些数据表明，缺乏CXCR4的B细胞前体向脾滤泡的募集是一个独立于CXCL13和CXCR5的过程，可能涉及其他趋化因子及其受体。

Cxcr4淋巴器官中B细胞室的改变^{飞行/飞行}抄送19^+/Cre公司老鼠。

Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}小鼠的总脾细胞和CD19数量相当⁺细胞为野生型小鼠（总细胞数：1.5×10⁸对照组±0.5，1.2×10⁸突变株为±0.3；CD19编号⁺小区数：4.8×10⁷对照组±0.9，4.1×10⁷± 0.3;n个= 7). 然而，CXCR4缺陷的B细胞前体过早归巢到脾脏导致未成熟B细胞池（B220⁺CD21型⁻CD23型⁻)在突变小鼠中(图4A） ●●●●。因此，由MZ B细胞（CD21）组成的成熟B细胞室的总细胞数^你好CD23型^洛)和滤泡B细胞（CD21^洛CD23型^你好)减少至野生型小鼠中观察到的约65%(图4A） ●●●●。中成熟B细胞室的收缩Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 镉19 ^{+ /Cre公司}脾脏不太可能是由于B细胞前体将MZ和滤泡B细胞移出，因为IgD的数量^你好免疫球蛋白^洛脾红髓或外周血中成熟B细胞无增加。为了排除成熟B细胞减少是由B细胞前体和成熟B细胞之间竞争脾脏中的支持性小生境而导致的细胞死亡增加引起的可能性，我们通过膜联蛋白V染色检测了每个B细胞群中的细胞凋亡。我们检测到大量凋亡细胞（膜联蛋白V⁺)在B220中^洛免疫球蛋白⁺但与野生型小鼠中相应的B细胞群相比，成熟B细胞的细胞死亡并未增加(图4B） ●●●●。有趣的是，CXCR4缺陷的未成熟B细胞（B220）的比例^洛免疫球蛋白⁺)脾脏中发生的凋亡是骨髓中野生型未成熟B细胞凋亡的四倍，反映出脾脏是支持B细胞前体生存和分化的较宽松环境。总之，这些数据表明，大部分CXCR4缺陷的B细胞前体在完成脾脏初级卵泡的分化过程之前死亡，从而导致脾脏成熟B细胞室减少Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}脾脏。

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图4。

外周淋巴器官B细胞亚群的改变Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}老鼠。（A） 脾细胞用B220、CD21和CD23抗体染色。B220中CD21和CD23的表达⁺显示了选通人口。未成熟B细胞（CD21⁻CD23型⁻)，滤泡B细胞（CD21^洛CD23型^你好)和MZ B细胞（CD21^你好CD23型^洛)以多边形显示，每个选通人口的平均百分比(n个= 5). （B） FACS分析检测脾B细胞亚群的细胞死亡。来自野生型对照和Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /克里}用抗B220、抗IgM和膜联蛋白V对小鼠进行染色⁺)B细胞被装箱并显示为平均百分比(n个= 4). （C） 小肠的代表性切片显示对照组中派尔氏结的结构(n个=3）和突变小鼠(n个= 5). B细胞用抗B220染色，T细胞用抗CD3标记。箭头表示突变小鼠的T细胞面积增大或异位B细胞滤泡（放大10倍）。（D） 从3个月大或6个月大的小鼠中分离腹膜细胞。淋巴细胞门内的细胞通过抗B220、抗IgM、抗CD5和抗CD11b染色显示。B2电池（B220^你好CD5（CD5）⁻)，B1电池（B220^你好CD5（CD5）⁺)，和T细胞（B220⁻CD5（CD5）^你好)显示在标有百分比的门中。（E） 野生型（封闭栏，n个=5）和突变小鼠（开放栏，n个= 7).

为了分析B细胞归巢到其他次级淋巴组织是否需要CXCR4信号，我们检测了成熟B细胞在淋巴结、派尔氏结和腹膜腔中的分布。在淋巴结中未发现成熟B细胞的细胞密度和定位发生重大变化（未描述）。小肠派尔氏结的数量和分布在Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}老鼠。成熟的CXCR4缺陷的B细胞可以有效地归巢到派尔氏结的初级卵泡中。然而，B细胞滤泡变得更加分散。在5只突变小鼠中总共检测到20个派尔斑，其中18个在其固有层深处有异常的B细胞滤泡Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}肠道，其中6个显示T细胞区扩大(图4C） ●●●●。

在腹膜B细胞室中也观察到明显的变化Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}老鼠。腹膜B细胞可分为两个主要群体。尽管传统B2人群（CD5⁻CD11b型⁻B220型^你好免疫球蛋白^洛免疫球蛋白D^你好)体腔由成熟的再循环B细胞补充，B1细胞池（CD5⁺CD11b型⁺B220型^洛免疫球蛋白^你好免疫球蛋白D^洛)主要由胎肝前体发育而来，并由持续的自我更新维持(34). 年轻时Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}小鼠腹腔内的B2细胞数量正常，而与野生型对照组相比，B1细胞数量略有减少(图4D） ●●●●。老年人Cxcr4号机组 ^{飞行/飞行} 抄送19 ^{+ /Cre公司}小鼠，不仅在B1（2.4倍），而且在B2腹膜亚群（三倍；图4E） ●●●●。

我们感谢Ivo Lieberam在显微镜方面的帮助，感谢Hua Gu、Kathryn Calame和Klaus Rajewsky对手稿的批判性审查。

邹永瑞（Y.-R.Zou）是皮尤学者和艾琳·戴蒙德（Irene Diamond）免疫学助理教授。这项工作也得到了DANA基金会的支持。

作者没有相互冲突的经济利益。