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公共科学图书馆-医学。2008年1月；5（1）：e8。
2008年1月22日在线发布。 数字对象标识：10.1371/日志.pmed.0050008
PMCID公司：PMC2211560型
PMID：18215105

雷帕霉素对复发性PTEN缺乏性胶质母细胞瘤患者的I期抗肿瘤作用

蒂姆·F·克劳西,#1 吉本浩司,#2,¤ 菲奥安·恩吉恩布,#1 凯文·布朗,三 朱莉·丹,2 朱少军,2 特立·休厄,4 陈一南（音）,4 王伟,5 大卫·扬金,三 琳达·刘,6 尼尔·马丁,6 唐·贝克尔,6 马文·伯格斯奈德,6 黎广德,1 理查德·格林,7 汤姆·奥格尔斯比,5 迈克尔·科莱托,5 杰夫·特伦特,三 史蒂夫·霍瓦特,8 保罗·米舍尔,#2,4 英戈·K·梅林霍夫,#4和查尔斯·索耶斯#9,*
罗伯特·J·威尔，学术编辑
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景

关于如何将分子工具纳入早期临床试验，以评估靶点调节，测量抗肿瘤活性，并为更有可能受益的患者丰富临床试验人群，癌症药物开发界有很多讨论。以分子为重点的小型临床研究有望尽早确定最佳生物剂量和患者群体。

方法和发现

基于10号染色体（PTEN）缺失缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物使肿瘤对雷帕霉素哺乳动物靶点（mTOR）的抑制敏感的临床前证据，我们在复发性胶质母细胞瘤患者中进行了雷帕霉素的一期新辅助试验，其肿瘤缺乏抑癌基因PTEN的表达。我们的目的是评估胶质瘤患者每日服用雷帕霉素的安全性，确定肿瘤组织中抑制mTOR所需的雷帕霉素剂量，并评估雷帕霉素在PTEN缺乏的胶质母细胞瘤中的抗增殖活性。尽管所有患者的肿瘤内雷帕霉素浓度足以在体外抑制mTOR，但肿瘤细胞中的mTOR抑制程度（通过核糖体S6蛋白磷酸化降低测量）差异很大。雷帕霉素治疗1周后，14名患者中有7名患者的肿瘤细胞增殖（通过Ki-67染色测定）显著降低，并与mTOR抑制程度相关(第页=0.0047，Fisher精确检验），但不是肿瘤内雷帕霉素浓度。从Ki-67无应答者中获得的肿瘤细胞在体外对雷帕霉素保持敏感性，表明对生化mTOR抑制的临床耐药性不是细胞内固有的。雷帕霉素治疗导致7名患者Akt激活，可能是因为失去了负反馈，这种激活与术后雷帕霉素维持治疗期间较短的进展时间有关(第页<0.05，对数秩检验）。

结论

雷帕霉素对PTEN缺陷型胶质母细胞瘤具有抗癌活性，值得单独或与PI3K通路抑制剂联合进行进一步的临床研究。新佐剂试验设计中使用的短期治疗终点确定了监测靶点抑制和负反馈对指导未来临床发展的重要性。

试用注册：http://www.ClinicalTrials.gov（临床试验）（编号NCT00047073）。

在一项I期临床试验中，Charles Sawyers及其同事研究了雷帕霉素在PTEN缺乏性胶质母细胞瘤患者中的作用。

编辑摘要

背景。

胶质母细胞瘤是一种高度恶性的脑肿瘤。与其他肿瘤一样，它可能由许多不同的分子变化引起。传统的化疗仅能控制这些肿瘤，无法治愈。治疗此类肿瘤的另一种方法是针对肿瘤中的特定分子变化。显然，这种靶向治疗只适用于靶向特定分子缺陷的患者。因此，传统的临床试验，包括各种不同的患者和具有不同基因改变的肿瘤，可能不适合测试靶向治疗的有效性。

在大约40%的胶质母细胞瘤患者中发现的一个特殊变化是一种被称为PTEN公司，起到抑癌基因的作用。什么时候？PTEN公司它被灭活后，以前的研究表明会使细胞对一类称为mTOR抑制剂的药物更敏感，其中之一是雷帕霉素（商标为西罗莫司）。mTOR是一种参与调节包括生长和增殖在内的许多细胞过程的蛋白质。目前正在测试对mTOR有活性的药物对其他癌症和免疫抑制剂的有效性。

为什么要进行这项研究？

这是一项I期研究，即在人类身上进行的最早类型的药物研究，目的是研究雷帕霉素在胶质母细胞瘤复发后接受手术的选定患者组中的安全性，这些患者的肿瘤不表达PTEN。此外，作者还希望评估将该药物作用的详细分子研究纳入此类第一阶段研究的可行性，以及这些分子研究是否可以预测患者对雷帕霉素的反应。

研究人员做了什么并发现了什么？

共有15名患者在手术前和手术后接受不同剂量的雷帕霉素治疗一周，直到有证据表明肿瘤正在进展。尽管有一些需要治疗的不良反应，但没有证据表明这些患者有非常严重的毒性。当手术后对患者的样本进行测试时，其中七个样本显示肿瘤细胞分裂速度降低，这种降低与mTOR的抑制程度有关。其中两名患者的扫描显示肿瘤质量减少。患者体内对雷帕霉素有耐药性的肿瘤细胞在组织培养中对雷帕霉素敏感，这表明缺乏反应是由于药物无法穿透肿瘤。雷帕霉素的第二个不幸影响是在一些患者中引起另一种细胞内蛋白Akt的激活；当这种激活发生时，患者从手术到疾病复发的间隔时间更短。

这些发现意味着什么？

第一阶段试验中的详细分子研究可以更好地了解这种靶向药物的工作原理。这些发现表明，雷帕霉素可以降低胶质母细胞瘤细胞的增殖率，这种降低似乎与药物穿透肿瘤和抑制mTOR的能力有关。然而，在一些患者中，第二条通路的激活可以加快疾病的进程，因此进一步的试验应该包括第二条途径的抑制剂。

其他信息。

请通过此摘要的在线版本访问这些网站http://dx.doi.org/10.1371/journal.pmed.0050008.

  • 美国国家癌症研究所提供有关癌症各个方面的信息（英语和西班牙语）
  • 英国慈善机构癌症备份提供有关脑肿瘤的信息
  • 维基百科有一个页面mTOR公司（请注意，维基百科是一部免费的在线百科全书，任何人都可以编辑；有多种语言版本）

介绍

当一种新的抗癌药物首次进入临床时，其开发通常以经验为基础，确定最大耐受剂量，然后评估一系列疾病的临床活性。在分子靶向癌症治疗的时代，这种方法受到质疑，因为预计这些药物将主要对那些肿瘤依赖于新药物特异靶向的分子病变的患者有效[1–三]. 然而，以目标为中心的临床开发具有挑战性，因为必须建立明确定义、经验证的分子标准来选择临床试验患者。在大多数实体肿瘤患者中，无法接触肿瘤组织会带来更多困难。一种方法是进行小规模的试点研究，在预定的肿瘤切除之前给患者注射靶向药物，以确保在治疗期间能够接触到组织。这种新辅助研究已经成功地用激素类药物单独或与激酶抑制剂联合治疗乳腺癌[4,5]. 目前的技术允许分析小组织样本中的基因拷贝数、突变状态、mRNA和蛋白质表达，从而可以收集可指导进一步临床开发的高分子量数据集。我们使用这种方法研究了复发性胶质母细胞瘤患者分子定义亚群中的靶向药物雷帕霉素。

雷帕霉素哺乳动物靶点抑制剂（mTOR）已获得监管部门的批准，可作为治疗同种异体排斥反应的免疫抑制剂和治疗肾癌的抗肿瘤药物[6,7]. 雷帕霉素及其类似物（CCI-779，RAD001）在临床试验中显示了对多种人类癌症的抗肿瘤活性，但药物反应的分子决定因素目前尚不清楚[8]. 我们小组以前的工作[9]和其他[10–15]证明磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）途径的突变激活通过PTEN（第10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物）的丢失或丝氨酸/苏氨酸激酶Akt的激活使肿瘤细胞对临床前模型中mTOR抑制剂的抗增殖活性敏感。这些发现为探索mTOR抑制剂在PTEN缺陷型肿瘤患者中的抗肿瘤活性提供了理论依据。

胶质母细胞瘤是解决这个问题的一种模型疾病，因为约40%的患者发生PTEN失活。此外，抢救性手术切除通常是标准预先治疗（通常包括手术切除后辅以放疗和化疗）后复发患者的临床管理的一部分。第二次手术是收集肿瘤组织以评估术前治疗的分子效应的机会。事实上，其他人已经使用这种补救手术来确定消耗DNA修复蛋白AGT所需的O6-苄基鸟嘌呤的剂量，该蛋白与替莫唑胺耐药性相关[16]. 重要的是，在许多临床前模型中，mTOR抑制的抗肿瘤作用是细胞抑制性的，这增加了可能无法观察到肿瘤收缩的传统放射学临床终点的可能性。胶质母细胞瘤可能适合评估细胞抑制活性，因为这些肿瘤具有高度增殖性。因此，通过免疫组织化学分析可以检测到治疗对生长动力学的短期影响。最后，可以通过测量手术后肿瘤进展的时间来评估临床效益。基于这些原因，我们在接受挽救性切除的复发性PTEN阴性胶质母细胞瘤患者中进行了雷帕霉素新辅助临床试验，其主要目标是确定mTOR靶点抑制所需的剂量，并评估对肿瘤细胞的潜在抗增殖作用。

方法

参与者

第一阶段试验已注册http://www.ClinicalTrials.gov（临床试验）（#NCT00047073）（另请参阅http://www.cancer.gov/search/ViewClinicalTrials.aspx？cdrid=257255&version=patient&protocolsearchid=3718462). 临床试验方案（#02-03-078–11）由加州大学洛杉矶分校机构审查委员会批准。受试者仅限于组织学诊断为胶质母细胞瘤（GBM）的患者，有标准GBM治疗（手术、放疗、替莫唑胺）后疾病复发的影像学证据，有肿瘤组织PTEN丢失的证据（见下文），并且以前没有mTOR抑制剂治疗。其他入选标准包括年龄>18岁，Karnofsky绩效得分（KPS）≥60，预期寿命≥8周，骨髓功能（白细胞[WBC]）充足>3000/μl，中性粒细胞绝对计数>2000μl，血小板>100000/微升，血红蛋白>10 gm/dl），肝肾功能正常（血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶[SGOT]和胆红素<2.5×正常上限，肌酐<1.5 mg/dl），血浆胆固醇<350 mg/dl，血浆甘油三酯<400 mg/dl。在试验开始前，中断放射治疗和/或化疗≥4周（如果之前的治疗包括亚硝基化合物，则中断放射治疗或化疗≥6周）。参与临床试验的所有15名患者均书面同意参与这些评估。

干预措施

15名PTEN缺乏肿瘤患者也符合所有其他合格标准，在肿瘤复发时入选，在挽救性手术切除（S2）前接受新辅助口服雷帕霉素（2 mg、5 mg或10 mg/d）约1周（中位：6 d，平均：7.5 d）。手术恢复后，患者恢复每日新辅助剂量的雷帕霉素治疗，直到发现肿瘤进展的临床和/或放射学证据。

目标

第一阶段试验的主要目标如下：（1）在PTEN缺乏的胶质母细胞瘤中确定抑制mTOR所需的雷帕霉素剂量；（2） 在PTEN缺乏的胶质母细胞瘤中建立雷帕霉素的抗增殖活性；确定脑胶质瘤患者每日服用雷帕霉素的安全性。

成果

雷帕霉素对肿瘤组织中mTOR活性和肿瘤细胞增殖的影响。

为了量化匹配S1和S2样本中的mTOR活性，我们使用两种针对Ser235/236或Ser240/244的不同磷酸化抗体，通过免疫组织化学方法测量S6核糖体蛋白的磷酸化。为了确定雷帕霉素治疗7天是否有任何抗肿瘤活性，我们通过测量Ki-67标记指数来评估匹配S1和S2样品的增殖率。免疫组织化学（IHC）评分详见文本S1.

外周血和肿瘤组织中的雷帕霉素浓度。

加州大学洛杉矶分校医学中心临床实验室使用高效液相色谱/质谱（HPLC/MS）测定外周全血中的雷帕霉素浓度。SFBC Taylor（新泽西州普林斯顿市）采用以下方案对肿瘤内雷帕霉素水平进行定量：将质量介于50 mg和250 mg之间的新鲜冷冻组织样品在水中均质化，得到0.200 g组织/ml的组织匀浆浓度。以类似方式均质无雷帕霉素对照组织。将对照组织匀浆池的等分试样加入雷帕霉素至适当水平，制备校准剂。去甲氧基吡霉素用作内标物，并加入1.00 ml等分样品和标准品中（如果需要，用对照组织匀浆将样品预稀释至1.00 ml）。然后用1-氯丁烷提取匀浆。将提取物分离、干燥并重新配制至最终体积100μl。40μl提取物在正离子模式下通过液相色谱/常压化学电离/质谱/质谱（LC/APCI/MS/MS）进行分析。在50°C的温度下，使用Paradigm泵（Michrom Biorresources）在YMC ODS-AQ C18柱（Waters）、2.0×100 mm、5μm柱上进行色谱分析。流动相为20 mm乙酸铵和0.0005%乙酸水溶液、20 mm醋酸铵和0.00005%乙酸甲醇溶液。检测在Finnigan TSQ Quantum Ultra AM质谱仪上进行。

新佐剂和术后雷帕霉素的耐受性。

根据国家癌症研究所第2版普通毒性标准评估不良事件(http://ctep.info.nih.gov/reporting/index.html).

基因组研究。

使用Qiagen DNeasy Kit（Qiagene）从显微解剖的新鲜冷冻临床肿瘤样品中分离肿瘤细胞DNA。双向全长测序PTEN公司（外显子2-9）由Agencourt进行检测，并使用突变测量软件（Softgenetics）分析序列痕迹。为了确定基因拷贝数，将标记的肿瘤DNA与由约40000个寡核苷酸探针组成的安捷伦44A比较基因组杂交（CGH）微阵列杂交（安捷伦科技），并在安捷伦DNA微阵列扫描仪上进行扫描。原始日志2使用安捷伦特征提取9.1软件计算比率数据。日志2PTEN的比率是使用安捷伦CGH Analytics 3.4软件中实现的ADM1畸变调用算法生成的。阵列CGH方法的详细描述见文本S1.

样本大小

在首次手术切除后，对165名患者进行PTEN状态筛查，然后随访直至复发。15例PTEN免疫组化染色阴性的患者在计划的挽救性手术切除前接受雷帕霉素治疗约1周。来自9名在加州大学洛杉矶分校接受S1和S2手术但未接受雷帕霉素治疗的胶质母细胞瘤患者的肿瘤样本作为S1到S2的磷酸化S6和Ki-67染色比率变化的对照。为了进行额外的比较，还对来自另外12名患者的S2样本进行了Ki-67染色检测，这些患者的肿瘤PTEN染色降低，但没有接受雷帕霉素治疗。（后一组肿瘤没有匹配的S1样本）。

统计方法

由于进展时间（TTP）未经检测，我们能够使用（多元）线性回归模型将TTP与分子和临床变量联系起来。由于TTP高度偏斜，我们对其进行对数变换以满足线性回归模型的正态性假设。我们使用Kaplan-Meier图来可视化不同患者阶层的TTP分布，并使用对数秩来测试差异。为了测试不同患者组之间的中位数差异，我们使用了非参数组比较测试（Wilcoxon、Kruskal-Wallis测试）。例如，我们使用Wilcoxon检验比较不同患者和对照组的Ki67%。我们使用Fisher精确检验来测试列联表中行和列的独立性。

试剂

以下抗体用于IHC：抗PTEN（6H2.1，#ABM-2052，层叠生物科学；1:400稀释）、抗Ki-67（MIB-1，M7240，DakoCytomation；1:100稀释）、抗磷蛋白Ser235/236 S6（91B2，#4857，Cell Signaling；1:50稀释）、反磷蛋白Ser240/244 S6（#2215，Cell信号；1:200稀释），抗磷酸-PRAS 40（#44–1100G，Biosource；1:200稀释）、抗磷酸Ser473 Akt（736E11，#3787，Cell Signaling；1:50稀释）、反磷酸Thr389 p70 S6激酶（#9205，Cell信号；1:100稀释）和抗磷酸Ser1108 eIF4G，1:400（#2441，Cell Signaling，1:400稀释）。使用0.01M柠檬酸盐缓冲液在烤箱中pH6.0进行抗原提取30分钟，过氧化物酶活性用3%过氧化氢在水中猝灭。将初级抗体稀释在PBS/2%牛血清白蛋白/2%正常马血清（用于抗PTEN）或TBS/0.1%吐温/5%正常山羊血清（用于磷酸化位点特异性抗体）中，并在4°C下放置过夜。以1:200稀释度应用生物素化二级抗体（Vector）45分钟，并使用亲和素-生物素复合物（Elite ABC，Vector，30分钟）。使用Vector NovaRed作为酶底物，以可视化特定抗体定位。对于Ki-67染色，使用1mM EDTA缓冲液（pH 8.0）在高压微波炉（功率水平：80%）中进行抗原回收13分钟。所有载玻片均用哈里斯苏木精进行复染。

结果

以组织为基础的短期终点新辅助性胶质母细胞瘤试验的设计

我们进行这项单臂研究的主要动机是通过设计一项小型临床试验，重点是使用短期终点测量抗肿瘤活性，来追踪mTOR抑制剂在PTEN阴性肿瘤模型中引人注目的临床前活性。为了提高基于临床前假设的成功概率，我们根据对首次切除（S1）获得的组织的分析，将登记限制在肿瘤有PTEN丢失证据的复发性胶质母细胞瘤患者(图1). 资格也仅限于那些计划接受挽救性手术切除（S2）的患者，以便肿瘤组织可以用于评估mTOR抑制和肿瘤细胞增殖的终点，以及肿瘤内雷帕霉素浓度。通过强制每个患者获得治疗前和治疗后样本，该试验设计允许患者内部比较分子终点，从而增强了检测小样本量变化的统计能力。为了确保任何S1到S2的变化都可以归因于雷帕霉素治疗，我们使用来自9名未接受雷帕霉素的胶质母细胞瘤患者（对照组）的S1和S2样本进行了一组相同的测量。

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临床试验设计

第一阶段临床试验的受试者仅限于初次肿瘤切除（“手术1”）标本经免疫组织化学检测为PTEN缺乏的患者。在放疗和化疗（即“肿瘤复发”）的标准治疗失败后，入选患者。在预定的挽救性肿瘤切除术（“手术2”）之前，患者接受了短疗程（平均7.5天）的雷帕霉素口服治疗。术后恢复使用雷帕霉素，直到患者出现治疗失败的临床和/或影像学证据。雷帕霉素对肿瘤细胞增殖和肿瘤组织中mTOR信号传导的影响是通过将挽救性切除（“手术2”）期间收集的肿瘤组织与初始肿瘤切除（“手术1”）期间收集的相同肿瘤样本进行比较来确定的。时间进展（TTP）被定义为雷帕霉素治疗开始和术后治疗失败之间的间隔。

使用先前报道的半定量评分系统来评估肿瘤细胞相对于邻近血管内皮细胞PTEN表达的肿瘤患者PTEN缺失[17,18]. 我们从165名胶质母细胞瘤患者中筛选了初次手术（S1）时获得的肿瘤样本，随后在我们的研究所进行神经肿瘤护理。在67/165（40.6%）的肿瘤中，PTEN免疫反应完全（43/165）或部分（24/165）消失。15名PTEN缺乏肿瘤患者也符合所有其他资格标准（参见方法,文本S2和第3章)，在肿瘤复发时登记，每天口服新佐剂雷帕霉素（2mg、5mg或10mg）约1周（中位：6d，平均：7.5d）(表1)抢救性手术切除前（S2）。使用匹配的S1和S2样本评估雷帕霉素对肿瘤细胞增殖和mTOR活性的影响。手术康复后，患者恢复每日新辅助剂量雷帕霉素治疗，直到发现肿瘤进展的临床和/或影像学证据。

表1

雷帕霉素研究患者的临床特征

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雷帕霉素组织和血液水平及肿瘤组织中S6激酶的抑制

因为雷帕霉素是一种大环内酯类天然产物，其大小可以阻止其在血脑屏障中的分布，所以我们通过质谱法测量了在S2获得的一份肿瘤组织中雷帕霉素的浓度。在14个肿瘤中的14个肿瘤（患者11的组织不足）中检测到雷帕霉素，浓度范围为0.3–36.3 nM(图2A） ●●●●。已知在体外PTEN缺失细胞系中具有抗增殖活性的雷帕霉素浓度通常为~1 nM[9,11].

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雷帕霉素跨越血脑屏障并阻断肿瘤组织中的mTOR

（A） 根据雷帕霉素剂量队列（每天2 mg、5 mg或10 mg）分组肿瘤组织（填充方块）和外周血（空圆圈）中的雷帕霉素浓度。由于冷冻肿瘤材料不足，无法确定患者11的肿瘤内雷帕霉素浓度。术前最后一次服用雷帕霉素的剂量是在开颅当天，并在手术后24小时内采集外周血。

（B） 免疫组织化学法定量肿瘤组织中的mTOR活性。左边的卡通描绘了mTOR信号通路中导致丝氨酸235/236和丝氨酸240/244处S6核糖体蛋白磷酸化的S6激酶1分支。右边的面板显示了免疫印迹法（顶部）和IHC（底部）在测定雷帕霉素患者1、2和3肿瘤组织中S6磷酸化方面的比较。患者1、2和3的S2和S1之间丝氨酸235/236磷酸化的倍数变化分别为0.45、1.01和0.45（参见图S2A） ●●●●。

（C） S2和S1之间S6磷酸化的变化(年-轴：S2样本中S6磷酸化与S1样本中的S6磷酸化之比），适用于所有有匹配S1和S2样本的患者（14/15名雷帕霉素患者和9/9名未服用雷帕霉素的患者）。S6磷酸化由IHC使用针对丝氨酸235/236（左）和丝氨酸240/244（右）的磷酸化位点特异性抗体测定。请参阅图S1和S2系列有关单个肿瘤的IHC评分方法和结果的详细信息。第页-使用Kruskal-Wallace检验来确定各组的平均S2/S1比率的差异值。

为了量化mTOR活性，我们通过免疫组织化学方法测量了S6核糖体蛋白的磷酸化。S6是S6激酶1（mTOR作用的下游效应器）的直接底物，在临床前研究中广泛用作mTOR抑制的药效学读数。为了确保特异性，我们使用了两种针对Ser235/236或Ser240/244的不同的磷脂酶抗体(图2B） ●●●●。这两个位点都被S6激酶1直接磷酸化，但Ser235/236也可以被p90核糖体S6激酶（RSK）和其他激酶磷酸化[19]. 所有测量值均通过从石蜡包埋组织中切下的每张幻灯片中2500-5000个肿瘤细胞的数字读数进行量化(图S1). 我们试图使用针对S6激酶1（直接mTOR位点）的Thr389的磷酸化位点特异性抗体和真核生物起始因子4G（丝氨酸1108）来评估mTOR活性，但我们手中石蜡切片上这些抗体的性能特征不足以进行可靠的量化（未公布的数据）。

对于2mg队列中的三名患者，S1和S2的足够冷冻组织可用于直接比较S6磷酸化的免疫印迹和IHC测量(图2B） ●●●●。虽然免疫印迹法测得的pS6降低幅度更大，但这两种方法一致，从而保证了IHC方法可以在整个样本集中使用。患者1和3的总核糖体S6水平也降低，这与S6的翻译依赖于mTOR的事实一致。

当整体检查时，与匹配的S1样品相比，所有三个队列S2样品中的S6磷酸化水平在两个磷酸化位点均降低（S2/S1比率<1.0，图2C） ●●●●。相反，对9名未接受雷帕霉素治疗的胶质母细胞瘤患者的S1和S2样本进行的类似分析显示S6磷酸化没有变化。在比较两种抗体的性能时，值得注意的是，当使用丝氨酸235/236抗体测量时，三名患者S2样本中S6磷酸化增加（或无变化）（患者2、5和13）(图S2B） 而同样的样品显示使用丝氨酸240/244抗体降低了S6磷酸化(图S3A和表2). 这个悖论可以用235/236位点的mTOR依赖性磷酸化来解释[20,21]并建议240/244位点可能是mTOR活性评估的首选终点。值得注意的是，pS6磷酸化程度与肿瘤内雷帕霉素浓度无关。事实上，一些肿瘤组织中药物浓度足够的患者pS6的降低幅度相对较小（例如，患者2、12和15）(表2)表明一些患者/肿瘤对mTOR抑制表现出明显的生化抵抗（下文将进一步讨论）。

表2

雷帕霉素治疗患者队列中的分子和临床参数

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肿瘤细胞增殖的抑制与mTOR的抑制程度相关

为了确定雷帕霉素治疗7天是否有任何抗肿瘤活性，我们通过测量Ki-67标记指数来评估匹配S1和S2样品的增殖率。雷帕霉素治疗患者的S2样本的标记指数明显低于匹配的S1肿瘤（中位数：2.1%对21.3%，第页<0.005（Wilcoxon试验），而未服用雷帕霉素的患者的相同S1/S2比较没有变化(图3A） ●●●●。因为这些未经治疗的患者没有被选为PTEN缺乏症患者，所以我们对另外12名非研究患者进行了增殖检测，这些患者的肿瘤与PTEN状态相匹配。（来自这12名患者的匹配S1样本不可用于患者内比较。）这些PTEN阴性S2样本（无雷帕霉素）中的Ki-67标记指数与来自对照患者的S1和S2样本相当，并且显著高于来自雷帕霉素治疗患者的S2样本(图3A） ●●●●。值得注意的是，Ki-67标记指数的降低归因于一半（7/14）的患者几乎完全抑制了肿瘤细胞的增殖(图3B） 提示该患者群体中至少有两个亚群（雷帕霉素敏感型和雷帕霉素耐药型）。

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雷帕霉素抑制PTEN缺乏GBM亚群肿瘤细胞增殖

（A） 雷帕霉素治疗前（S1）和治疗中（S2）GBM的Ki-67标记指数与未服用雷帕霉素患者的肿瘤样本进行比较（详见正文）。方框图内的水平线显示中值。方框的下端和上端分别对应于第25个和第75个百分位。晶须延伸至95%范围。使用Wilcoxon非参数组比较检验来计算第页-不同患者组之间的差异值。

（B） 14/15名雷帕霉素患者S1和S2之间肿瘤细胞增殖的变化。方框内的水平线表示中值。方框的上下边界分别对应于第25个和第75个百分位。晶须延伸至95%范围。患者14的石蜡块不足以进行量化。来自患者1、3、8、9、11和13的S2样本的Ki-67标记指数中值为0（以星点表示）。N.S.表明，根据Wilcoxon检验，Ki-67标记指数的差异在0.05水平上没有统计学意义。

（C） 雷帕霉素治疗患者S2肿瘤样本中S6抑制程度与Ki-67反应的关系。第页-通过Fisher Exact试验确定pS6抑制的不同阈值。

（D） 来自体内S6反应（患者1和3）或耐药（患者2和12）肿瘤的短期培养物的体外雷帕霉素反应。所示为用载体、0.3 nM雷帕霉素和3 nM雷帕霉素处理8 h后全细胞裂解物的S6和p85（负载）免疫印迹。

在检测雷帕霉素敏感性的分子决定因素时，我们注意到mTOR抑制的程度与Ki-67反应高度相关，使用>对两个检测的磷酸化位点中的至少一个S6磷酸化的50%抑制(第页<0.0047）（费希尔精确测试）(图3C） ●●●●。在比较两种抗体时，pSer235/236的变化与Ki-67反应的相关性在统计学上更为显著，尽管由于其他激酶的磷酸化作用，该位点被认为对S6K1活性的特异性不如pSer240/244[20]. 这一发现可能反映了这些不同磷酸化位点输入的真正生物差异，也可能是由于抗体检测mTOR抑制定量差异的相对敏感性。[在我们手中，pSer240/244抗体的染色强度通常低于pSer235/236抗体。]

尽管该分析强调了实现充分mTOR抑制的重要性，但它未能解决这样一个事实，即在一些患者中，肿瘤内的雷帕霉素浓度足够高并没有转化为mTOR的抑制。这种生化抵抗可能是细胞内的（药物靶点突变、药物外排泵在肿瘤细胞中的表达等）或宿主相关的（药物与血清蛋白结合、在特定细胞类型或组织中的隔离等）。为了区分这两种类型，我们检测了四名研究患者（其中两名对雷帕霉素敏感，另两名对其耐药）在培养基中短期繁殖后S2处移除的肿瘤细胞的敏感性。如果临床雷帕霉素耐药是细胞内的，这些细胞在体外也应该具有类似的耐药，而如果宿主机制发挥作用，则应恢复敏感性。值得注意的是，在0.3和3.0 nM浓度下，雷帕霉素敏感性（患者1和3）和雷帕霉素抗性（患者2和12）样品中S6磷酸化受到同等抑制(图3D） 表明在这些患者中抑制mTOR的失败不是细胞内固有的。相反，数据表明，尽管在切除的脑肿瘤组织中达到了足够的浓度，但在一些患者中，雷帕霉素向肿瘤细胞的传递受到损害。一种可能性是基于雷帕霉素在红细胞中被隔离的事实[22]这是因为在这些耐药患者中观察到的雷帕霉素瘤内高浓度反映了高血管性肿瘤中的红细胞聚集。事实上，耐药患者的肿瘤显示出丰富的血管标记物CD31免疫组化染色(图S4)但样本量太小，无法得出明确结论。另一种解释包括患者之间血脑屏障渗透或肿瘤静水压的变化。

胶质瘤患者每日服用雷帕霉素的安全性

术前雷帕霉素治疗期间未观察到3级或4级毒性。特别重要的是，没有围手术期出血并发症。15例患者中有5例在术后雷帕霉素治疗期间发生3级不良事件（低钾血症、高胆固醇血症和细胞减少），这些不良事件在支持性护理下得到处理，不需要中断治疗(表S1).

雷帕霉素诱导的Akt激活对临床结果的影响

Akt通路的生理激活部分由mTOR效应分子S6激酶1参与胰岛素受体底物1（IRS1）磷酸化的负反馈回路调节(图4A）[23–26]. 雷帕霉素对mTOR的抑制可以消除这种负反馈，并在一些癌细胞株和肿瘤样本中激活Akt，但潜在的临床影响尚不清楚[8,27,28]. 我们使用针对丝氨酸/苏氨酸激酶Akt（丝氨酸473）及其下游底物PRAS 40（苏氨酸246）的磷酸化位点特异性抗体评估了雷帕霉素治疗患者S1和S2样本中的Akt活性，后者是Akt活动的生物标记物(图4A） ●●●●。PRAS40最近也被证明能抑制mTOR，这种抑制作用可通过Akt磷酸化来缓解[29–31]. 14名患者中有7名（50%）具有统计学意义(第页<0.05，Wilcoxon试验）S2样品中PRAS40磷酸化增加(图4B） ●●●●。值得注意的是，一名患者（11）在S2时PRAS40磷酸化（和pS473 Akt）显著降低(图4B） ，这可能反映了雷帕霉素在长期暴露后对TORC2-mTOR复合物（涉及pS473-Akt激酶）的潜在抑制作用[32,33].

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雷帕霉素治疗肿瘤亚群中Akt信号的诱导

（A） mTOR抑制剂治疗期间肿瘤组织中Akt活化的测定。左侧面板是一幅动画，展示了PI3k-Akt通路的mTOR/S6K1依赖反馈回路。右侧面板显示雷帕霉素治疗期间Akt-底物PRAS40（苏氨酸246）磷酸化的变化与Akt磷酸化的改变相对应（丝氨酸473）。在雷帕霉素治疗期间，患者2和患者5的肿瘤显示pAkt和pPRAS40免疫染色增加，而患者11的肿瘤显示雷帕霉素的相同标记物减少。

（B） 14/15名雷帕霉素患者S1和S2之间PRAS40磷酸化的变化。方框内的水平线表示中值。方框的上下边界分别对应于第25个和第75个百分位。晶须延伸至95%范围。患者14的石蜡块不足以进行量化。N.S.表明，根据Wilcoxon检验，pPRAS40染色强度的差异在0.05水平上没有统计学意义。

（C） Kaplan-Meier分析说明pPRAS40诱导与肿瘤时间进展之间的关系。

由于Akt的激活可能会减弱雷帕霉素的抗肿瘤活性，因此我们研究了pPRAS 40诱导与雷帕霉素治疗术后维持期的时间进展之间的关系。pPRAS40的诱导与更短的进展时间显著相关(第页=0.049，对数秩检验）(图4C） ●●●●。考虑到只有14名患者导致了这种情况第页-值得一提的是，一项针对更多患者的研究可能会带来更具统计可靠性的结果。相反，时间-进展和年龄之间没有统计学意义上的关系(第页=0.57），Karnofsky性能状态(第页=0.91），登记前肿瘤复发次数(第页=0.12），肿瘤中雷帕霉素水平(第页=0.45）或血浆(第页=0.25），丝氨酸240/44抑制S6磷酸化(第页=0.42）或丝氨酸235/236(第页=0.65），丝氨酸240/244下S6的基础磷酸化(第页=0.24）或丝氨酸235/236(第页=0.54），或Ki-67响应(第页=0.42）（全部第页-通过Logrank测试确定的值）。pPRAS40诱导仍是一个独立的显著预测因子(第页<0.05），即使在多元回归模型中调整了年龄和KPS。

为了探索在mTOR抑制剂治疗期间哪些基因损伤可能与PRAS40诱导有关，我们将雷帕霉素治疗（S2）期间收集的肿瘤细胞DNA与由约40000个寡核苷酸探针组成的CGH微阵列杂交。总的来说，我们的数据集显示了胶质母细胞瘤中常见的许多染色体畸变[34]包括7号染色体的频繁扩增、10号染色体的丢失以及EGFR、PDGFRA、CDK4和MDM2的局部扩增(图S5). 与未经pPRAS40诱导的肿瘤相比，经pPRA40诱导的肿瘤更常见的表现为MDM2（4/7 vs 1/5）和受体酪氨酸激酶EGFR或PDGFRA（4/7对1/5）的局部扩增(图S6). 虽然由于样本量小，这些观察结果缺乏统计能力，但值得注意的是，据报道，EGFR可诱导乳腺癌细胞中IRS1的表达，IRS1是mTOR/S6K1负反馈回路的介质[35]. 此外，PDGFR是mTOR负反馈的另一个靶点，可以通过增强PDGFRβ的表达来克服[36].

S1和S2 PTEN状态的比较

分子生物标记物用于临床试验合格性的一个关键问题是，在治疗干预之前获得的组织样本是否可以用于准确评估复发肿瘤。我们通过使用本研究中15名患者的S1和S2样本比较PTEN状态来解决这个问题。虽然资格是根据半定量手册PTEN评分确定的[17,18]之后，我们使用数字图像量化软件改进了PTEN评分方法。在对44例存档胶质母细胞瘤样本的两种评分方法进行比较时，我们发现两种评分法之间具有较高的Spearman相关性（rho=0.82，第页= 8.6 × 10−12) (图S7A） ●●●●。当应用于研究患者时，数字方法证实S1样本中的PTEN免疫反应与S2样本（所有样本得分均小于35）相当，并可用于推断复发时的PTEN状态(图S7B） ●●●●。

为了探索PTEN表达缺失的分子基础，我们寻找PTEN公司从所有可用的（13/15）冷冻肿瘤样本中显微解剖肿瘤细胞DNA中的突变和/或基因丢失。3/13（23.1%）的肿瘤中存在错义突变PTEN公司编码序列。其中一个突变（R173C）以前曾在胶质母细胞瘤中被描述，另外两个错义突变（H61Y，V217F）映射到其他人类癌症样本中先前报告的密码子(http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/宇宙). 9/13（69.2%）肿瘤显示DNA拷贝数丢失（log2比率≤−0.3）PTEN公司基于寡核苷酸阵列的比较基因组杂交测定的至少一个肿瘤小份中的位点(表S2). 至少一个PTEN公司因此，在10/13（76.9%）的肿瘤中发现等位基因失活，证实我们的研究人群确实富含PTEN缺陷型胶质母细胞瘤。我们未能识别PTEN公司突变和/或PTEN公司在一些PTEN缺乏的肿瘤中，IHC导致的DNA拷贝数丢失可能是由于PTEN沉默的表观遗传机制、不完全的测序覆盖PTEN公司基因（外显子1和5′非翻译区[UTR]未测序）或使用异质性肿瘤样本时这些方法的不敏感性（IHC试验中PTEN缺乏的定义是肿瘤细胞的>20%）[37].

讨论

雷帕霉素和其他mTOR抑制剂在一系列临床前模型中显示出作为抗癌药物的巨大潜力，但使用传统的放射照相和临床反应标准在单药试验中很难证明令人信服的临床活性[38]. 潜在的解释包括这些药物在实验室中的主要细胞抑制作用，剂量和时间表的不确定性，以及缺乏根据临床前定义的分子表型在最可能有反应的患者亚群中评估药物的研究。本研究的目的是根据我们小组和其他研究小组最初得出的临床前发现，直接评估雷帕霉素在PTEN肿瘤有缺陷的患者中的作用，并在这些模型中显示出mTOR依赖性[9–15]. 在设计临床实验时，我们试图验证PTEN分析在患者选择中的应用，记录肿瘤组织中mTOR的抑制（对脑癌特别重要），并获得抗肿瘤活性的初步证据。根据PTEN丢失的高频率（～40%）、挽救性手术切除时收集肿瘤组织的临床机会以及这些肿瘤的高增殖指数选择胶质母细胞瘤，为评估抗肿瘤效果提供了可靠的终点。其目的是生成可用于后续试验中更集中的假设检验的信息。

在本研究中，165例患者在首次手术切除后进行PTEN状态筛查，然后随访直至复发。15例PTEN免疫组化染色阴性的患者在计划的挽救性手术切除前接受雷帕霉素治疗约1周。通过比较初始手术样本（手术1或S1）和挽救性切除样本（手术2或S2）中这些指标的免疫组化测量值，确定雷帕霉素对肿瘤细胞mTOR抑制和肿瘤增殖指数的短期影响。雷帕霉素治疗使14名患者中的7名患者的肿瘤细胞增殖受到实质性抑制，这与肿瘤组织中mTOR抑制的最大程度相关。根据临床前研究预测[27,28]雷帕霉素在某些情况下也导致Akt的激活，并且这种激活与更短的肿瘤进展时间显著相关。

这项新佐剂雷帕霉素试验的主要发现是使用短期终点的抗肿瘤活性证据，对实现充分靶点抑制的重要性的新见解，以及评估PI3-激酶/mTOR联合治疗以解决负反馈的临床证据。这三项研究结果都将指导mTOR抑制剂在该疾病中的未来临床开发。Ki-67反应数据表明，雷帕霉素对PTEN缺失患者亚群具有明显的抗肿瘤活性。除了对肿瘤细胞增殖的影响外，两名患者也有放射反应的证据。患者8因并发上呼吸道感染接受了延长疗程的新佐剂雷帕霉素治疗（25天），术前磁共振成像显示肿瘤消退>50%(图S8A） ●●●●。患者11在雷帕霉素治疗的术后阶段影像学表现持续改善，在开始雷帕霉素后538天死亡，无肿瘤复发迹象(图S8B） ●●●●。患者8的经验可能证明延长新辅助治疗时间是合理的，以便在随后的试验中获得所有患者的放射反应数据。当我们的试验正在进行时，一项关于mTOR抑制剂CCI-779的单臂II期研究报告称，65例复发性胶质母细胞瘤患者中有20例（36%）的影像学表现有所改善[39]. 值得注意的是，这些患者没有进行PTEN状态的前瞻性评估（没有分子选择标准），CCI-779是根据第一阶段的经验每周而不是每天进行的，根据该计划确定了最大耐受剂量[40,41]. 根据我们对反应所需mTOR抑制程度的研究结果（如下所述），该时间表提出了对非治疗日内假定缺乏靶点覆盖的担忧。尽管如此，这两项试验都显示了抗肿瘤活性的证据，这为进一步研究mTOR抑制剂提供了信心。PTEN缺失在定义敏感性方面的作用可以通过试验设计来确定，在试验设计中，所有患者最初都合格，但PTEN阴性与PTEN阳性的患者数量足够多，以便进行子集分析。

虽然直观，但我们发现mTOR抑制程度和Ki-67反应之间的相关性并没有从临床前研究中得到预期。雷帕霉素处理异种移植物和其他小鼠模型系统时，S6磷酸化几乎完全被抑制；因此，大多数对反应的研究都集中在确定影响肿瘤细胞mTOR依赖性的遗传病变（Pten、Akt、Tsc、Vhl等）上[38,42]. 该试验中令人惊讶的发现是，尽管使用的雷帕霉素剂量足以使肿瘤内nM水平降低，但这种剂量并不能在所有患者中转化为mTOR抑制。通过对抢救性手术中分离出的肿瘤细胞进行体外分析，我们确定这些患者的耐药性不是细胞固有的。与雷帕霉素耐药的外部机制一致，我们对S2肿瘤样本的基因组调查未能确定mTOR途径（FKBP12、S6激酶1、RAPTOR、RHEB、Akt）中基因内的显著拷贝数变化，这可能解释了体内观察到的雷帕霉素耐药性。这一结果与其他激酶抑制剂（慢性髓细胞白血病、胃肠道间质瘤和EGFR-依赖性肺癌）的耐药机制形成对比，后者通常通过肿瘤细胞中激酶靶点的突变发生[43]如果能够实现更显著的mTOR抑制，则更大比例的PTEN阴性胶质母细胞瘤可能对雷帕霉素敏感。

更具挑战性的问题是，是否可以制定策略来改善雷帕霉素直接向肿瘤细胞的传递，并在所有患者中最大限度地发挥mTOR抑制作用。由于其他疾病的耐受性问题（粘膜炎、血小板减少症），口服显著增加的每日剂量是不太可能的解决方案。侵袭性方法，如对流增强输送或植入含药物的晶片，已被用于化疗药物治疗胶质母细胞瘤患者，可能会被考虑。或者，更好地理解在选定患者中未能实现mTOR抑制的原因可以找到解决方案。例如，如果这些患者中的雷帕霉素由于肿瘤血管增强而被隔离在红细胞中，抗血管生成药物如贝伐单抗（已知对胶质母细胞瘤有活性）[44]可以防止隔离，并允许更有效的药物输送。所有这些方法的评估都需要对mTOR活性进行定量评估，并强调需要开发广泛有用的临床工具来定量分析靶点抑制。短期内，可以使用PET示踪剂，如3′-脱氧-3′-18F-氟胸腺嘧啶（FLT），识别早期Ki-67应答者，这些示踪剂可以无创地读出增殖[45]. 尽管这种鉴定本身不会改善雷帕霉素向肿瘤细胞的递送，但它至少可以鉴定雷帕霉素递送似乎有问题的肿瘤亚群。这里的成功也将消除抢救性手术的必要性，并可能大大扩大患者参加大型试验的资格。

从这里报道的时间-进展曲线和CCI-779研究中，似乎没有什么疑问，需要联合治疗才能产生显著的临床效果。当然，挑战在于从几乎无限的可能性中选择最有希望的第二种药物。根据我们和其他人早期的工作，联合阻断EGFR/mTOR是一个合理的选择，因为PTEN缺失预示着EGFRviii突变患者对EGFR抑制剂的耐药性[18,46–48]. 另一种可能性是联合阻断PI3K/mTOR，以防止雷帕霉素诱导的Akt激活，这种激活是由负反馈丢失引起的[27,28]. 我们研究中的时间-进展分析表明，这些患者的预后较差，因此作用于Akt上游的抑制剂可能有助于预防这种并发症。事实上，在临床前模型中，一种双重PI3K/mTOR抑制剂已显示出优于纯mTOR抑制剂[49].

尽管本文报道的发现与胶质母细胞瘤中的mTOR抑制剂直接相关，但这意味着这些药物将在通过PTEN缺失、PI3K p110α突变、Akt基因扩增或其他机制导致PI3K/Akt通路失调的广泛癌症中具有活性。最近，mTOR抑制剂在PTEN丢失频率较低的转移性肾癌中显示出临床活性[50]. 这种疾病敏感性的分子基础尚不清楚，但von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制因子的缺失和随后mTOR依赖性HIF-1α的表达是一种假定的机制[51]. 基于与上述胶质母细胞瘤相似的原因，基于mTOR的联合治疗也正在考虑用于肾癌。这里描述的新佐剂临床试验设计应该可以很容易地推广到其他癌症，在这些癌症中，可以在计划的肿瘤手术切除之前定时给药，这种方法与最近国家通过新的试验设计加速临床开发的努力是一致的[52].

支持信息

图S1

免疫组织化学染色数字评分：

用Ki-67、磷酸化S6核糖体蛋白（S6RP）、磷酸化-PRAS40和PTEN抗体对每个肿瘤的邻近组织切片进行染色（未公布数据）。每张幻灯片选择五个区域进行数字评分，每个区域代表大约500-1000个肿瘤细胞。图像转换和评分使用软成像系统软件进行。每个样本的2500–5000个细胞内的免疫反应分布以方框图形式绘制。S6免疫反应中的“折叠变化”(表2和图S2)计算S2中染色得分与S1样品中染色得分的比值。

（135 KB PDF格式）

图S2

匹配S1/S2肿瘤组织对中Ser 235/236的S6磷酸化：

（A） pSer 235/236 S6的代表性IHC染色结果。所示为具有生物化学mTOR抑制剂耐药性的肿瘤（患者2）与对雷帕霉素具有显著mTOR抑制的肿瘤（病人8）的比较示例。

（B和C）来自雷帕霉素临床试验队列中的14名患者（B）和9名在S2之前未接受雷帕霉素治疗的胶质母细胞瘤患者（C）的匹配S1/S2肿瘤样本中Ser 235/236的S6磷酸化的定量。有关IHC评分方法的更多信息，请参阅图S1和文本S1.

（1.2 MB PPT）

图S3

匹配S1/S2肿瘤组织对中Ser 240/244处的S6磷酸化：

（A）雷帕霉素临床试验队列中14例患者的匹配S1/S2肿瘤样本和（B）S2之前未接受雷帕霉素治疗的9例胶质母细胞瘤患者的匹配S2/S2肿瘤标本中基于IHC的S6磷酸化Ser 240/244定量。

（206 KB PPT）

图S4

雷帕霉素治疗的低（患者1和3）与高（患者5和15）肿瘤内雷帕霉素浓度肿瘤的代表性肿瘤组织切片的CD31免疫染色：

箭头表示CD31 IHC阳性的瘤内血管。

（159 KB PDF格式）

图S5

阵列CGH S2样本中基因组畸变的频率：

对从新鲜冷冻肿瘤样本（S2）中显微切割的基因组DNA进行基于寡核苷酸微阵列的CGH（aCGH）分析。使用CGH分析软件（安捷伦）使用ADM1算法对像差进行评分（参数列于文本S1)，并进行筛选以仅保留带有日志的畸变2比率小于−0.3或大于0.3。DNA拷贝数的频率增加（每个染色体的零轴右侧为红色），基因组中所分析样本的丢失（轴左侧为绿色）以分析样本的百分比表示。

（56 KB PDF格式）

图S6

pPRAS40反应分层的基因拷贝数改变：

使用Cluster和TreeView软件绘制雷帕霉素治疗后活检的CGH数据（可在http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm). DNA拷贝数损失用绿色表示，而增加用红色表示。根据IHC测定的雷帕霉素治疗后是否存在pPRAS40的显著诱导，对患者样本进行分层（见图4B和表2).

（53 KB PDF格式）

图S7

雷帕霉素研究患者临床肿瘤样本与44例存档胶质母细胞瘤组织样本PTEN表达的IHC评分：

（A） 两种PTEN IHC评分方法的比较(x个-轴：手动评分；年-轴：图像引导数字评分）。手动评分将肿瘤细胞中PTEN的表达与相邻内皮细胞中PTEN的表达进行比较，并将评分设为0（肿瘤细胞中不存在）、1（肿瘤细胞相对于内皮细胞减少）和2（肿瘤细胞染色与内皮细胞相似）。数字PTEN评分基于通过图像引导软件评分系统确定的PTEN免疫反应的绝对值(图S1). 数字PTEN评分由一名不了解手动PTEN评分的独立评审员确定。

（B） 雷帕霉素研究组在雷帕霉素治疗前（S1）和治疗期间（S2）肿瘤的平均数字PTEN IHC评分。

（18 KB PDF格式）

图S8

2/15名研究患者对雷帕霉素的放射反应：

两名患者对单剂雷帕霉素有临床反应的磁共振成像结果。

（A） 由于并发上呼吸道感染，患者8接受了延长的雷帕霉素术前疗程（25天），磁共振成像显示肿瘤消退>50%。

（B） 患者11术后16个月影像学表现稳定，死亡时无肿瘤复发迹象。

（72 KB PDF格式）

表S1

雷帕霉素相关不良事件：

（11 KB PDF格式）

表S2

PTEN公司副本编号（日志2肿瘤组织中的比率）和错义突变：

从显微切割的肿瘤细胞中提取基因组DNA。不适用：没有新鲜冰冻肿瘤小份供分析。日志2比值≤−0.3与DNA拷贝数损失一致。

（13 KB PDF格式）

文本S1

补充方法：

（42 KB文档）

文本S2

协议：

（254 KB文档）

文本S3

联合检查表：

（59 KB文档）

致谢

我们感谢Peter Lamb（Exelixis）对pPRAS40免疫组织化学的帮助。

缩写

CGH公司比较基因组杂交
GBM公司胶质母细胞瘤
国际控股公司免疫组织化学
KPS公司行为状态评分
mTOR公司雷帕霉素的哺乳动物靶点
PTEN公司10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物
S1（第一阶段）手术1
S2系列手术2
TTP公司进展时间

脚注

？当前地址：日本福冈九州大学医学研究生院神经外科。

作者贡献。TFC、PN、JT、PSM、IKM和CLS设计了研究。TFC、KY、PN、KB、JD、SZ、TH、YC、WW、DY、LL、NM、RG、TO、MK和CLS收集数据。TFC、KY、PN、KB、TH、DY、SH、PSM、IKM和CLS对数据进行了分析。TFC、PN、LL、NM、DB、AL、RG和CLS登记患者。TFC、KY、PN、KB、DY、PSM、IKM和CLS参与了论文的撰写。

基金。这项由研究者发起的临床试验的资金由Doris Duke基金会和Howard Hughes医学研究所（CLS）、加速脑癌治疗（IKM）、Goldhirsh基金会（CLS）、国家癌症研究所（CA108633至PSM）、国家神经疾病和中风研究所（NS050151至PSM）、，加州大学洛杉矶分校GCRC（M01-RR0865）和脑肿瘤基金合作组织。哈里·奥尔高尔基金会通过多丽丝·乌尔曼脑瘤研究技术基金会、加州大学洛杉矶分校亨利·E·辛格尔顿脑癌项目、纪念西吉·齐林的齐林家族基金会、大脑艺术、纪念黎明钢铁的罗文家族基金会提供了进一步的资金支持，和约瑟夫·德隆基金会纪念马克·沙克曼。资助者在研究设计、数据收集、数据分析、出版决定或手稿准备过程中没有扮演任何角色。

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

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文章来自PLOS医学由以下人员提供普洛斯