基于Claudin-11/OSP的脑髓鞘与睾丸支持细胞紧密连接

摘要

T型右侧交叉（TJ）¹位于上皮细胞侧膜的最顶端，被认为是溶质通过细胞旁途径扩散的主要屏障（有关综述，请参阅施尼伯格和林奇，1992年;甘比纳，1987年,1993; Anderson和van Itallie，1995年）。在薄片电子显微镜下，TJ表现为一系列离散的明显融合部位，涉及邻近细胞质膜的外叶(法夸尔和帕拉德，1963年). 在冷冻断裂电镜下，TJ在原生质面（P面；朝外的细胞质小叶）中表现为一组连续的、网状的膜内链或纤维，在细胞外表面（E面；朝内的胞质外小叶；施泰赫林，1973年,1974). 最近的技术进步使人们能够鉴定几种与TJ相关的外周膜蛋白，如ZO-1(史蒂文森等人，1986年)、ZO-2(Gumbiner等人，1991年)、ZO-3(Balda等人，1993年;Haskins等人，1998年)，扣带蛋白(Citi等人，1988年)，7H6抗原(Zhong等人，1993年)和辛普利金(Keon等人，1996年)但直到最近才鉴定出TJ特异的整体膜蛋白，即TJ链的成分。

Occludin是一种具有四个跨膜结构域的65-kD完整膜蛋白，是第一个鉴定出的TJ链成分(Furuse等人，1993年;Ando-Akatsuka等人，1996年). Occludin被证明是TJ链本身的一种成分(藤本，1995;Furuse等人，1996年)并直接参与TJ的屏障功能(McCarthy等人，1996年;Balda等人，1996年;Chen等人，1997年; Wong和Gumbiner等人，1997年）。最近，闭塞素基因敲除成功，但令人意外的是，闭塞素缺乏的上皮细胞仍然显示出发育良好的TJ链网络，这表明存在尚未鉴定的TJ特异性整合膜蛋白(Saitou等人，1998年).

作为TJ链的第二和第三组分，从分离的肝脏连接部分鉴定出两种22kD的整合膜蛋白，每种蛋白具有四个跨膜结构域(Furuse等人，1998年a). 由于这两种蛋白质彼此显示出序列相似性（氨基酸序列水平上约38%相同），但与闭塞素无关，因此它们被命名为克劳丁-1和-2。当在培养的上皮细胞中表达时，这两种蛋白都靶向并并入先前存在的TJ链。此外，当将它们单独导入缺乏TJ的培养L成纤维细胞时，它们诱导稳定转染体之间形成发育良好的TJ链网络(Furuse等人，1998年b). 此外，数据库中的相似性搜索发现了许多与克劳丁-1和-2相似的序列，表明存在一个新的基因家族，即克劳丁家族(Morita等人，1999年). 迄今为止，我们已经鉴定出该家族的八个成员（claudin-1至-8），当引入培养的MDCK细胞时，这些成员集中在TJ。然而，Northern杂交显示，这些分子在中枢神经系统中没有大量表达。

在脊椎动物的大脑中，已知两种类型的细胞具有TJ或TJ样结构；血管内皮细胞和少突胶质细胞。在大脑的内皮细胞中，一个典型的TJ链网络发育良好，被认为是血脑屏障的负责者(鲁宾，1991). 在中枢神经系统的有髓神经纤维中，Ranvier的两个连续节点之间的每个节段由少突胶质细胞的细胞突起及其髓鞘板组成。对于沿着这些有髓轴突的跳跃性传导，轴突和周围髓鞘之间的细胞间隙必须电隔离。在偏执型区域，许多排胶质-轴突（隔状）连接在鞘细胞的末端环路和下面的轴突膜之间架起桥梁，这些连接被认为负责电密封（Raine，1984）。通过冷冻断裂电子显微镜观察到髓鞘板层之间存在约10 nm厚的线状链（Dermietzel等人，1974年，1980年；Reale等人，1975年;Schnapp和Mugnaini，1978年;Tabira等人，1978年). 这些股线平行于轴突轴，径向穿过髓鞘，髓鞘由所谓的髓鞘径向成分组成(彼得斯，1961年,1964;Dermietzel，1974年). 由于这些链与上皮细胞和内皮细胞中的TJ链表现出非常相似的形态学特征，因此放射成分也被认为直接参与分离髓鞘内的细胞外室(Mugnaini和Schnapp，1974年;Gumbiner和Louvard，1985年). 然而，由于尚未在这些链中检测到任何TJ特异性蛋白，尤其是闭塞素或克劳丁，因此尚不清楚这些链是否不仅在形态上而且在生理上可视为TJ链。

在本研究中，我们分析了少突胶质细胞特异性蛋白（OSP）的表达和亚细胞分布，部分原因是它与claudin-1至-8的序列相似，部分原因在于它在大脑中大量表达。OSP cDNA首先通过减法克隆鉴定为在少突胶质细胞中表达的cDNA，但其产物尚未详细表征(Bronstein等人，1996年). 在这里，我们表明OSP应被视为克劳丁家族的一员，并且该分子是少突胶质细胞髓鞘中TJ链的一种特殊成分，有趣的是，也存在于睾丸的支持细胞中。

材料和方法

免疫荧光显微镜

在室温下，用1%甲醛在PBS中固定玻璃盖玻片上的L转染剂10分钟。用液氮冷冻小鼠大脑和睾丸，并在冷冻器上切下约10–20μm厚的冰冻切片，安装在玻璃载玻片上，空气干燥，并在4°C的95%乙醇中固定30分钟，然后在室温下用100%丙酮固定1分钟。如前所述，对这些样品进行免疫荧光显微镜检查(Furuse等人，1998年b;Morita等人，1999年). 使用荧光显微镜观察样本，蔡司Axiophot显微镜(卡尔蔡司公司。)或配备有蔡司Axiophot显微照相镜。对于每个立体图像（参见图。​图5），5)计算机累计30个光学截面（间隔0.3～0.4-μm）。

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图5

claudin-11/OSP和神经丝亚细胞分布的立体比较。用抗claudin-11/OSP pAb（红色）和抗神经丝mAb（绿色）对大脑皮层的冷冻切片进行双重染色，通过共聚焦显微镜进行检查，并生成立体图像。请注意，每个claudin-11/OSP阳性线性结构（红色）围绕着神经丝阳性轴突（绿色）呈柔和的螺旋状排列。棒材：（a）2μm；（b） 1微米；（c） 1微米。

结果

OSP作为Claudin家族成员Claudin-11的特征

使用先前报道的小鼠OSP核苷酸序列(Bronstein等人，1996年)，我们通过PCR扩增了编码小鼠OSP的全长cDNA，并证实其开放阅读框编码207个氨基酸的蛋白质，计算分子量为22.1kD。OSP与克劳丁的序列相似性很弱：它几乎与先前确定的克劳丁家族成员等距相关（克劳丁-1至-8；在氨基酸序列水平上与每个成员的～30%同源性）。如图所示。​图1，1OSP和claudin-1的比较表明，相同的氨基酸几乎均匀地分布在这些分子中。

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图1

用GENETYX程序比较小鼠OSP和claudin-1的氨基酸序列。同一性和同源性分别用|和：表示。四个假定的跨膜结构域用方框表示。它们在氨基酸序列水平上表现出31.7%的一致性。注意，相同的残基几乎均匀地分布在分子中，OSP和claudin-1分别以-H-V和-Y-V结尾。

接下来，我们将COOH末端带有FLAG序列的编码OSP的cDNA导入培养的L成纤维细胞中，这些成纤维细胞缺乏TJs或克劳丁的表达(Furuse等人，1998年b). 用抗FLAG单克隆抗体稳定转染的免疫荧光显微镜显示，表达的FLAG-OSP以平面形式集中在细胞-细胞边界或薄细胞突起上（图。​（图2，2，a–d）。该单克隆抗体没有来自亲本L成纤维细胞的信号。然后，用戊二醛固定这些表达FLAG-OSP的稳定L转染子，并通过常规冷冻断裂电子显微镜进行检查（图。​（图22e） 。在这些细胞中，经常观察到TJ链/槽状结构以平行方式排列，而在亲本L细胞中没有检测到这些结构。这些股线与P面相关，并且大多与不同宽度的间隔空间不连续（图。​（图22e、 插图）。在E面上，发现了互补的连续凹槽，其中包含分散的颗粒（图。​（图22e、 插图）。OSP诱导的股线不经常分叉，并显示出相互平行的趋势。

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图2

表达FLAG-标记OSP的L转染体。（a–d）表达FLAG-OSP的稳定L转染体的免疫荧光（a）和相应的相位对比图像（b）。细胞用抗FLAG单克隆抗体染色。表达的FLAG-OSP以平面（箭头）或细细胞突起（箭头）的形式集中在细胞-细胞边界。在高倍镜下（c和d），在细胞-细胞接触面上，FLAG-OSP呈网状或粗线状聚集。（e） 表达FLAG-OSP的稳定L转染体细胞-细胞接触面的冷冻断裂图像。在低倍镜下，观察到大量TJ股/槽状结构。这些股线几乎没有分支，并且表现出相互平行的趋势。P面（顶部）和E面（底部）上的绳槽嵌入，放大倍数更高。棒材：（a和b）10μm；（c和d）4μm；（e） 500纳米；（插图）100 nm。

OSP的这些特征，即与claudins的序列相似性和在L成纤维细胞中诱导TJ链/槽样结构的能力，导致我们将OSP视为claudin家族的一员，并在咨询人类基因命名委员会后初步将其命名为claudin-11(http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenculature/). （在更新的人类基因数据库中，发现了至少15个克劳丁家族成员，所有这些成员都已被分配到克劳丁-1至-15。）

Claudin-11/OSP在脑内的表达和分布

接下来，我们通过Northern印迹法检测了claudin-11/OSP在各种组织中的表达。如图所示。​图3三A、 claudin-11/OSP mRNA在大脑和睾丸中大量检测到2.3kb的条带，在肾脏中仅微量检测到，表明这种claudin参与了大脑和睾丸的TJ形成。然后，为了检测claudin-11/OSP的亚细胞分布，我们使用与claudin-11/OSP的COOH末端20个氨基酸对应的合成肽作为抗原，在兔子体内生成了多克隆抗体（pAbs）。通过免疫印迹，一种亲和纯化的pAb（pAb CL11-2）特异性地识别了GST融合蛋白，该融合蛋白具有claudin-11/OSP的COOH末端细胞质结构域，但不识别claudin-1至-8的融合蛋白，其在大肠杆菌（图。​（图3三B） ●●●●。使用该pAb，我们首先检测了claudin-11/OSP在大脑中的亚细胞分布。当用抗-克劳丁-11/OSP pAb对小鼠脑冰冻切片进行免疫荧光染色时，可以在皮层中看到大量呈随机方向散布的强染色线性结构（图。​（图44a） ●●●●。在较深的区域，这些线性结构偶尔以平行方式排列，以形成厚束（图。​（图44b） ●●●●。在大脑中，已知TJ在血管内皮细胞中形成。由于这些TJ用抗闭塞素抗体染色呈阳性，我们随后用抗-克劳丁-11/OSP pAb和抗闭塞素单克隆抗体双重染色大脑冰冻切片。然而，如图。​图4，4claudin-11阳性线性结构与闭塞阳性内皮细胞TJ没有重叠。

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图3

克劳丁-11/OSP表达的Northern blots和抗-克劳丁-11/OSP pAb的特异性。（A） 小鼠多组织Northern斑点(克隆技术公司)用小鼠claudin-11/OSP的DNA片段进行了探测。Claudin-11/OSP mRNA在大脑和睾丸中大量检测到2.3kb的条带，在肾脏中仅检测到少量。（B） 总裂解物的免疫印迹大肠杆菌用claudin-1至-8和claudin-11/OSP胞质域表达GST融合蛋白（箭头所示）证实了抗claudin11/OSP pAb的特异性。条形图表示顶部200、116、97、66、45、31、21、15和10 kD的分子质量。

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图4

claudin-11/OSP在小鼠脑内的分布。小鼠大脑、皮层区域（a和c）和深层区域（b和d）的冰冻切片分别用抗-克劳丁-11/OSP pAb（a和b）单染或用抗-克罗丁-11/OSP-pAb（c和d为绿色）和抗闭塞素单抗（c和d为红色）双染。在皮层区域（a和c），可以看到大量染色强烈的线性结构随机分布，而在较深区域（b和d），这些claudin-11/OSP阳性结构偶尔平行排列，形成粗束（箭头）。这些claudin-11/OSP阳性线性结构与闭塞阳性内皮细胞TJ（c和d）没有重叠。棒材：（a和b）10μm；（c和d）5μm。

然后，用抗claudin-11/OSP pAb和抗神经丝mAb对大脑皮层冰冻切片进行双重染色，共焦显微镜检查，计算机生成立体图像（图。​（图5）。5). 在高倍镜下，每个claudin-11/OSP阳性线性结构都围绕着神经丝状阳性轴突呈柔和的螺旋状排列。这些图像表明，这些claudin-11/OSP信号来自单个轴突周围的髓鞘。

如前所述（Dermietzel等人，1974年，1980年；Reale等人，1975年;Schnapp和Mugnaini，1978年;Tabira等人，1978年)对戊二醛固定的小鼠大脑进行的常规冷冻断裂电子显微镜检查显示，所谓的少突胶质细胞的层间链在轴突周围呈缓和的螺旋状排列（图。​（图66a） ●●●●。与表达claudin-11/OSP的L转染体中的TJ链类似（见图。​图2），2)，这些层间链与P面相关，并且大多不连续，中间有不同宽度的间隙（图。​（图66a、 插图）。当用抗claudin-11/OSP pAb对来自未固定大脑或视神经的冷冻骨折复制品进行免疫标记时，这些层间链被特别标记（图。​（图6，6、b和c）。此外，如图。​图7，7当大脑的超薄冷冻切片与相同的pAb孵育时，髓鞘的横切面被放射状标记，这可能与所谓的髓鞘放射状成分相对应(彼得斯，1961年,1964;Dermietzel，1974年).

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图6

少突胶质细胞中claudin-11/OSP在层间链的定位。（a） 小鼠大脑用戊二醛固定，然后进行常规冷冻断裂分析。在髓鞘的每个薄片中观察到所谓的层间链（箭头）。轴浆的星号横向断裂图像；M、 髓鞘横向断裂图像。层间链的插图，放大图像。（b和c）快速冷冻小鼠大脑（b）或视神经（c），无需化学固定，然后进行冷冻断裂分析。用抗claudin-11/OSP pAb标记冷冻骨折复制品。层间链（箭头）用pAb（10-nm金粒子）特异性标记。注意，横向断裂的髓鞘也用pAb（箭头）标记，并且这种标记模式非常类似于图。​图7。7轴浆的星号、横向断裂图像；M、 髓鞘横向断裂图像。棒材：（a）100 nm；（b和c）200纳米。

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图7

claudin-11/OSP在髓鞘放射状成分的定位。（a和b）小鼠大脑的超薄冷冻切片用抗claudin-11/OSP pAb标记。请注意，髓鞘的横切面是特别径向标记的（10-nm金颗粒；箭头）。星号，轴浆横切面；M、 髓鞘横切面。条形，100 nm。

Claudin-11/OSP在睾丸中的分布

最后，用抗claudin-11/OSP单克隆抗体和抗闭塞素单克隆抗体对小鼠睾丸冰冻切片进行双重染色。如图所示。​图8，8a和b，claudin-11/OSP和clodin均以线性方式集中并精确地定位在TJ发育良好的邻近支持细胞侧膜的最基底区域。微血管内皮细胞呈闭塞阳性，但claudin-11/OSP阴性（图。​（图8，8、a和b）。免疫冷冻断裂电镜显示，claudin-11/OSP仅定位于发育良好的Sertoli细胞的TJ链上（图。​（图88c） ●●●●。

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图8

claudin-11/OSP在Sertoli细胞TJ链的亚细胞定位。（a和b）小鼠睾丸冰冻切片用抗-克劳丁-11/OSP pAb（a）和抗闭塞素单克隆抗体（b）双重染色。claudin-11/OSP和occludin均以线性方式集中并精确共定位在邻近支持细胞的侧膜的最基底区域（箭头）。注意，血管内皮细胞的闭塞素染色呈阳性，而克劳丁-11/OSP染色呈阴性（箭头所示）。小行星，曲精小管的中心。（c） 小鼠睾丸快速冷冻，无需化学固定，然后进行冷冻断裂处理。用抗claudin-11/OSP pAb标记冷冻骨折复制品。特征性Sertoli TJ仅标记有pAb（10-nm金颗粒）。棒材：（a和b）25μm；（c） 200纳米。

讨论

髓鞘的层间链（放射状成分）对少突胶质细胞的生理功能非常重要（参见Schnapp和Mugnaini，1978年). 尽管它们在冷冻断裂图像上的外观与上皮和/或内皮TJ的相似，但TJ特异性蛋白，尤其是闭塞素，尚未被证明定位于这些层间链。另一方面，我们最近发现了新的基因家族成员，克劳丁-1至-8，它们是TJ链的主要成分，并发现单个或多个克劳丁共聚在各种组织中形成TJ链(Furuse等人，1998年a，b；Morita等人，1999年). 然而，Northern印迹显示，与非神经元组织相比，它们在大脑中没有大量表达(Furuse等人，1998年a;Morita等人，1999年). 在这项研究中，我们发现OSP（少突胶质细胞特异性蛋白）显示出与claudins的序列相似性，尽管其同一性程度最多为~30%（见图。​图1）。1). OSP最初被鉴定为一种在少突胶质细胞中特异表达的蛋白质，但尚未对其进行详细表征(Bronstein等人，1996年). 我们已经证明，OSP能够在L成纤维细胞中形成TJ股状结构，并且仅局限于层间股。基于这些观察结果，我们得出结论，层间链可以被视为由新的克劳丁组成的TJ链的变体，即克劳丁-11/OSP。

如前所述，当claudin-1或-2在L成纤维细胞中单一表达时，TJ链被诱导，并通过其分支形成巨大的链网络(Furuse等人，1998年b). 相反，claudin-11/OSP诱导的股线在L成纤维细胞中几乎没有分支，并且显示出相互平行的趋势。有趣的是，层间链（以及支持细胞中的TJ链[Gilula等人，1976年])无分支并联运行（见图。​图66和​和8），8)而上皮细胞中典型的TJ链经常分支形成网络(施泰赫林，1973年,1974). 这些发现支持这样的观点，即claudin-11/OSP是层间链（以及Sertoli细胞中的TJ链）的主要组成部分，并且链的分支频率取决于每个claudin物种的固有性质。

有趣的是，少突胶质细胞中的TJ链（层间链）与支持细胞中的克劳丁11/OSP共享一种特殊的克劳丁物种。在睾丸中，支持细胞中发育良好的TJ链（即所谓的支持连接）紧密保护生精细胞免受外界环境的影响，外界环境被称为血液-睾丸屏障(Dym and Fawcett，1970年;罗素和彼得森，1985年). 与大脑类似，Northern印迹分析表明睾丸不大量表达claudin-1至-8(Furuse等人，1998年a;Morita等人，1999年). 因此，在睾丸中，claudin-11/OSP很可能是TJ链的主要成分，TJ链起到了紧密屏障的作用，而在大脑中，少突胶质细胞的层间链也起到了屏障作用，将髓鞘内的细胞外室紧密隔离。在中枢神经系统中，神经元也受到外部环境的密切保护，但这种血脑屏障是由脊椎动物血管内皮细胞中的TJ链建立的(鲁宾，1991). 然而，在昆虫等无脊椎动物中，中枢神经系统神经鞘的TJ(Lane等人，1994年)据报道，胶质细胞的和/或褶状隔膜连接（可能是无脊椎动物的TJs等效物）直接参与血神经屏障(Lane等人，1977年;Juang和Carlson，1992年;Baumgartner等人，1996年). 进一步讨论这个问题还为时过早，但在未来的研究中考察claudin-11/OSP和其他claudin之间的系统发育关系将是一件有趣的事情。

支持细胞连接最初被称为“支持细胞的连接特化”(Flickinger和Fawcett，1967年)和其他上皮细胞中典型的TJ不同(Gilula等人，1976年). 这些支持细胞连接的特征是（a）平行于连接膜的离散细丝束，（b）位于细丝层更深的内质网池，以及（c）没有广泛吻合的平行排列的链。然而，最近关于ZO-1定位的研究结果(Byers等人，1991年;巴尔达和安德森，1993年)，辛普利金(Keon等人，1996年)和闭塞素(Moroi等人，1998年)在Sertoli连接处表明，这种特化是在许多其他上皮中发现的TJ的变体。这项研究，即第11条/OSP在Sertoli交界处的发生，最终支持了这一观点。

这里我们应该讨论的另一个问题是claudin-11/OSP和其他claudin之间细胞质尾部的序列差异。所有第1条至第8条在COOH终点以-Y-V结尾(Furuse等人，1998年a;Morita等人，1999年)，而只有第11条/OSP以-H-V结尾。从这个意义上讲，第11条/OSP与其他条款有着相当遥远的联系。Shaker K中的COOH端子-E-S/T-D-V图案⁺神经外膜蛋白中的通道（-ETDV）/NMDA R2亚基（-ESDV）和-E-Y-Y-V基序分别与Dlg/PSD-95家族蛋白和LIN-2/CASK的PDZ结构域结合(Kim等人，1995年;Komau等人，1995年;Hata等人，1996年;Niethammer等人，1996年). 考虑到三种含有PDZ的MAGUK家族蛋白ZO-1、ZO-2和ZO-3仅集中在上皮细胞和内皮细胞中TJ链的细胞质表面(史蒂文森等人，1986年;Gumbiner等人，1991年;Balda等人，1993年;Itoh等人，1993年;Willott等人，1993年;Jesaitis and Goodenough，1994年;Haskins等人，1998年)，预计claudin-1至-8中的COOH末端-Y-V与MAGUK家族蛋白质的一些PDZ结构域结合，以将其招募到TJ链。迄今为止，闭塞素被认为是ZO-1和ZO-2的膜结合伙伴(Furuse等人，1994年;Itoh等人，1999年)，但研究表明，即使在闭塞不足的TJ链中，ZO-1（以及ZO-2；未公开的数据）仍被招募(Saitou等人，1998年). 这些发现与上述预期一致，并导致进一步推测，claudin-11/OSP的COOH末端-H-V与其他claudin的ZO-1、ZO-2和/或ZO-3具有明显的亲和力。实际上，ZO-1和ZO-2并不集中于少突胶质细胞的层间链（数据未显示；参见Saitou等人，1997年).

在这项研究中，我们发现，尽管claudin-11/OSP的氨基酸序列与之前鉴定的八种claudin相当多样化，但它有能力在L成纤维细胞中诱导TJ链，并构成少突胶质细胞的层间链以及睾丸中支持细胞的TJ链。包括靶向基因断裂在内的claudin-11/OSP的分子操作不仅将更直接地揭示这种独特的claudin家族成员在大脑和睾丸中的生理功能，而且还将揭示一些髓磷脂相关以及精子发生相关疾病的病因。

致谢

本文中使用的缩写

脚注

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