凋亡过程中Bax与线粒体裂变位点、Drp1和Mfn2的时空关联

Drp1的影响^K38A公司凋亡细胞中Bax动力学的研究

Drp1的主要负性抑制剂，Drp1^K38A型，被证明可以抑制各种刺激诱导的细胞凋亡过程中发生的线粒体断裂(Frank等人，2001年). 我们探讨了Drp1的作用^K38A公司Bax易位、病灶形成和线粒体断裂。

我们分析了Drp1的作用^K38A公司使用HeLa细胞对线粒体Bax易位的表达，其中WT Drp1（T-Rex-Drp1）和Drp1的表达^K38A公司（T-Rex-Drp1^K38A型)由四环素控制(图3A） ●●●●。四环素处理的T-Rex-Drp1、T-Rex-Drp1^K38A公司和对照载体转染细胞（T-Rex-V）与STS孵育5 h，分离并通过Western Blotting分析Bax的线粒体易位。图纸1^K38A公司不抑制Bax的线粒体易位(图3B） ●●●●。然而，T-Rex-Drp1^K38A公司与T-Rex-V或T-Rex-Drp1细胞相比，细胞对STS诱导的凋亡更具抵抗力(图3C） ●●●●。图纸1^K38A公司在与Bax和Drp1瞬时共转染的Cos-7细胞中，也没有抑制Bax向细胞膜的移位^K38A公司(图3D） ●●●●。

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图3。

图纸1^K38A公司导致Bax相关裂变中间产物的积累。（A） WT Drp1和Drp1的引入^K38A公司霸王龙-Drp1、霸王龙-Drp1^K38A公司和T-Rex-V细胞用1μg/ml四环素处理24 h，并分析WT Drp1、Drp1的表达^K38A型通过Western Blotting。（B） 霸王龙-Drp1，霸王龙-Drp1^K38A公司用1μg/ml四环素处理T-Rex-V细胞24 h，然后用1μM STS处理5 h，并用Western Blotting分析Bax向细胞膜的移位。（C） 生存力T-Rex-Drp1、T-Rex-Drp1^K38A公司，并按照材料和方法中的描述对T-Rex-V进行分析。数据表示两个实验的平均值±标准差，每个场的起始细胞数为100个。在每个时间点对每个样本的两个字段进行计数。（D） 用pcDNA 3.1-Drp1和pcDNA 3.1-Bax或pcDNA3.1-Drp1共同转染Cos-7细胞^K38A型和pcDNA 3.1-Bax（比率3:1），用1μM STS处理2 h，细胞分馏后，用Western Blotting分析重膜组分和胞浆。（E和F）细胞转染CFP-Bax、YFP-20和pcDNA3.1-Drp1（E）或CFP-Bax、YFP-20和pcDNA1-Drp1^K38A公司（F） （比例2:0.5:6），用1μM STS处理90分钟，并用共焦显微镜进行分析。箭头表示OMM内陷；可能代表以CFP-Bax团簇定位的裂变中间产物。棒材，20μm。（G） 高倍放大来自F的一些线粒体（G1和G2，对照；G3-6，STS处理细胞）。箭头显示Bax团的位置，可能代表早期裂变位置。（H和I）细胞转染CFP-Bax和pcDNA3.1-Drp1（H）或CFP-Bax和pcDNA1-Drp1^K38A公司（一） 用1μM STS处理90分钟，并通过电子显微镜分析Bax团簇的亚线粒体定位。I1中的箭头指向与Bax簇相关的膜泡化。I3中的箭头指向与Bax簇相关的收缩位点。棒材：（H，I1，I3嵌件，I4，I5）0.2微米，（I2）0.1微米，（I3）1微米。

我们还检查了Drp1的作用^K38A公司共聚焦显微镜观察Bax移位。将细胞与OMM、YFP-20标记物CFP-Bax共转染(Nechushtan等人，2001年)、和Drp1或CFP-Bax、YFP-20和Drp2^K38A公司然后进行STS治疗。如所示图3、E和F，图纸1^K38A公司没有抑制Bax簇的形成，这与Western blotting在图3、B和D然而，在过度表达Drp1的细胞中^K38A公司(图3F） 与过度表达WT-Drp1和Bax的细胞相比，Bax移位和簇形成与线粒体的大体形态变化无关(图3E） ●●●●。在存在Drp1的情况下，OMM的内陷和/或囊泡在空间上与CFP-Bax相关^K38A公司(图3G、 箭头），表明含有Bax或异常线粒体断裂尝试的区域的膜动力学增加。

获取Drp1效果的高分辨率图像^K38A型在Bax的空间分布上，Cos-7细胞与Drp1共转染^K38A公司或WT Drp1和CFP-Bax，用STS处理，用抗GFP抗体染色，并通过电子显微镜分析(图3、H和I). 在表达WT-Drp1的细胞中，Bax簇与一个或两个圆形线粒体紧密相连(图3H） ●●●●。在细胞中过度表达Drp1^K38A公司(图3一、 共聚焦显微镜观察到含有多簇Bax的线粒体(图3F） ●●●●。在Drp1在场的情况下^K38A公司，Bax簇在两个主要定位中被检测到；和OMM和线粒体收缩位点相关的芽样复合物。这些Bax病灶轮廓清晰，电子密度更高，表明蛋白质浓度高于周围细胞质，偶尔与膜泡有关(图3一、 1，箭头）。

表达四环素诱导的WT-Drp1和Drp1的细胞系的建立^K38A公司

使用四环素调节表达系统（T-Rex系统；Invitrogen）。WT Drp1和Drp1的cDNA^K38A公司将pcDNA4/TO构建物转染到稳定表达pcDNA6/TR质粒（T-Rex-HeLa）Tet阻遏物的HeLa细胞系中。稳定表达四环素诱导的WT-Drp1和Drp1的T-Rex-HeLa细胞系^K38A公司在pcDNA4/TO中，使用玉米霉素（100μg/ml）和速溶菌素（5μg/ml）通过双重选择生成。WT Drp1和Drp1的表达水平^K38A公司在添加四环素（1μg/ml）后24小时通过Western Blotting进行检测。WT Drp1和Drp1表达水平较高且可比较的克隆^K38A公司本研究采用四环素严格控制。

表达质粒和转染

与氰基荧光蛋白（CFP-Bax）连接的Bax和OMM的标记物，以及与黄色荧光蛋白（YFP-20）连接的Bax的COOH末端的20个氨基酸，已在前面进行了描述(Nechushtan等人，1999年). Mfn2-YFP是根据前面描述的GFP构造构建的(桑特尔和富勒，2001年). Drp1和Drp1^K38A公司表达载体已在前面进行了描述(Smirnova等人，1998年；Frank等人，2001年). Drp1被重新克隆到pEYFP-C1中以产生pEYFP-Drp1（YFP-Drp1）。

Fis1的人类同源物(Mozdy等人，2000年)OMP 25和synaptojanin 2A(内莫托和德卡米利，1999年)使用RT-PCR从胎儿人脑mRNA（Stratagene）中克隆，并亚克隆到pEYFP-C1载体（BD Biosciences）中。Mito-YFP（BD Biosciences）和Mito-DsRed2（BD生物科学）显示线粒体。

使用FuGENE 6（Roche）转染细胞，并在12–15小时后按个别实验所示进行处理。

共焦显微镜

使用LSM 510显微镜，使用63×1.4 NA Apochro物镜（蔡司）拍摄图像。CFP、YFP、DsRed2或Mitotracker Red CMXRos（Molecular Probes，Inc.）的激发波长分别为413、514和543 nm。

在一些实验中，通过绘制每个通道的像素值，沿着通过光学截面绘制的线，重建每个通道的信号强度。多通道图像被分割成单个通道，并导出到国家卫生研究院图像软件。沿相应图片中所示的线条测量像素强度。使用Microsoft Excel将获得的数字绘制在直线上的位置上。

免疫细胞化学

按指示处理在2孔室载玻片中生长的细胞，用冷丙酮：甲醇（1:1）在−20°C下固定4分钟，用0.1%Triton X-100、0.05%脱氧胆酸在PBS中渗透20分钟，然后用3%BSA、0.1%Trito X-100在PBS内封闭45分钟。用小鼠抗Bax（6A7）单克隆抗体探测细胞(徐和友乐，1998)、亲和纯化抗人Mfn2抗体、亲和提纯抗人Drp1多克隆抗体(Frank等人，2001年). Zymed Laboratories针对内部肽序列（（C）-KNSRRALMGYNDQVQRPIPLTPAN）提出Mfn2蛋白特异性兔多克隆抗体（未发表数据）。线粒体用抗丝裂原单克隆抗体（癌基因）染色。接下来，用PBS清洗细胞，用山羊抗小鼠Alexa Fluor 488和山羊抗兔Alexa Fuor 594抗体（Molecular Probes，Inc.）进行染色，用慢褪色光防褪色试剂盒（Moleclecular Probes，Inc）进行安装，并用共聚焦显微镜进行分析。在一些实验中，线粒体在固定前用200 nM Mitotracker CMXRos（Molecular Probes，Inc.）染色30分钟。

电子显微镜

如前所述，为了检测内源性或过度表达的Bax、抗Bax（6A7）或抗GFP衍生的颜色变异蛋白，使用3E6抗AFP（Qbiogene）抗体预埋免疫-EM(Nechushtan等人，2001年).

细胞分离和免疫印迹

刮取细胞，在PBS中清洗，并将其重新悬浮在裂解缓冲液中（10 mM Hepes/KOH，pH 7.4，38 mM NaCl补充1 mM PMSF，1μg/ml抑肽酶和1μg/ml亮氨酸蛋白酶）。2000年细胞均质和离心克持续10分钟以去除未被破坏的细胞和细胞核。上清液在13000离心克持续15min，将颗粒用作膜组分，上清液用作细胞液。对于总提取物，细胞被刮掉，用PBS清洗，并重新悬浮在SDS-PAGE样品缓冲液中。取一份样品以测定蛋白质浓度。蛋白质在10%-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶（Invitrogen）上分离，转移到PVDF膜（Immobilon-P；Millipore）上，并与抗Bax单克隆抗体（克隆1F6；徐和友乐，1998)或抗Drp1单克隆抗体（克隆8；BD Transduction Laboratories），然后是HRP结合的抗小鼠二级抗体。通过ECL（Amersham Biosciences）检测印迹。

细胞活力

T-Rex-Drp1、T-Rex-Drp1^K38A公司，并将T-Rex-V细胞接种在含有55μm CELLocate微电网盖玻片（Eppendorf）的2细胞室（Nunc）上。用四环素（1μg/ml）处理24小时后，再使用1μM STS，在指定的时间点对同一区域内附着的细胞数量进行计分。

作者感谢J.Barrick提供的技术援助，V.Tanner Crocker和S.Chang为EM、R.Raju和M.Dalakas提供的援助，感谢C.Blackstone对手稿的批判性阅读，感谢A.van der Bliek为Drp1构建物提供的帮助，感谢M.Suzuki为Fis1克隆人提供的帮助。

这项工作得到了美国国立卫生研究院神经疾病和中风研究所的支持，以及米托科尔向M.T.富勒慷慨捐赠的支持。