真核生物中的氧化蛋白折叠

摘要

通过分泌途径的蛋白质通常依赖于二硫键来实现其成熟和功能。这些键通常对最终蛋白质结构的稳定性至关重要，半胱氨酸残基的错配会阻止蛋白质获得其天然构象并导致错误折叠。经典实验安芬森等人（1961年）提供了证据证明二硫键的形成是一个自发的过程，并且多肽本身足以在体外达到天然状态。然而，与蛋白质折叠的其他方面相比，二硫键折叠速度较慢，因为它依赖于需要电子受体的氧化还原反应。这些考虑暗示了二硫键折叠在体内是一个辅助过程，这一点通过在大肠杆菌显示出二硫键形成受损(Bardwell等人，1991年).

在真核生物中，ER中发生蛋白质氧化折叠。使用经典底物核糖核酸酶A的研究导致了蛋白质二硫键异构酶（PDI）的鉴定，PDI是一种蛋白质，可以重排不正确的二硫键，并在体外催化二硫键的形成和还原(Goldberger等人，1963年). 尽管PDI能够提高二硫键折叠的速率，但由于氧化二硫键形成反应，ER如何处理电子仍然未知。在过去的40年里，许多不同的因素被认为有助于维持内质网的氧化环境，包括还原硫醇的优先分泌和氧化硫醇的吸收，以及各种不同的氧化还原酶和小分子氧化剂(齐格勒和鲍尔森，1977年;Hwang等人，1992年;Carelli等人，1997年;Frand等人，2000年). 然而，由于缺乏遗传证据，这些与氧化折叠的生理相关性尚不清楚。

利用酵母进行遗传和生物化学研究的结合酿酒酵母以及最近的哺乳动物和植物系统，已经开始揭示这一基本蛋白质折叠过程背后的蛋白质和机制。保守的ER-1蛋白Ero1p在氧化折叠中起着与细菌周质蛋白DsbB类似的作用。Ero1p和DsbB都能特异性氧化一种硫氧还蛋白样蛋白（真核生物中为PDI，细菌中为DsbA），该蛋白在氧化当量向折叠蛋白的转移中起中介作用(Bardwell等人，1993年;Frand和Kaiser，1999年;Tu等人，2000年). 分子氧在原核生物和真核生物中都可以作为二硫键形成的终端电子受体(Bader等人，1999年;Tu和Weissman，2002年). 在厌氧条件下，DsbB–DsbA系统可以通过富马酸盐等替代电子受体支持二硫化物的形成(Bader等人，1999年). 然而，在细菌中，氧化折叠通过呼吸链方便地与分子氧偶联，而Ero1p利用黄素依赖反应将电子直接传递给分子氧(Tu和Weissman，2002年). 因此，Ero1p活性可能会产生活性氧物种（ROS），这可能是细胞氧化应激的另一个来源，表明其活性必须根据折叠负荷进行调节。此外，Ero1p对PDI的明显特异性可能使PDI的许多同源物保持还原状态，以便除蛋白质氧化外执行单独的氧化还原功能。本文将重点介绍Ero1p催化氧化折叠的机制及其更广泛的细胞生物学分支。

真核生物氧化折叠机械的组成部分

虽然已经认识到氧化折叠依赖于电子受体，并且可能在体内被催化，但控制这一过程的生理机制直到最近才为人所知。酵母的遗传筛选鉴定出一种保守的ER膜相关蛋白Ero1p（ER氧化还原蛋白1）是氧化折叠机制的重要组成部分(弗兰德和凯撒，1998年;Pollard等人，1998年). 中的突变能源监管局1导致对还原剂DTT的敏感性以及通常在内质网中以还原形式包含二硫键的蛋白质的积累(弗兰德和凯撒，1998年;Pollard等人，1998年)，与缺乏DsbB功能的细菌的表型相似(Bardwell等人，1993年;Missiakas等人，1993年). 在人类中，有两种ERO1亚型，hERO1-Lα和hERO1-Lβ(Cabibbo等人，2000年;Pagani等人，2000年)缺乏酵母蛋白膜结合所需的约127个氨基酸的COOH末端尾部(Pagani等人，2001年). 在体内，Ero1p的膜结合可能使蛋白质保留在内质网中并促进共翻译二硫键的形成。Ero1p具有七个保守的半胱氨酸残基，可能参与催化电子转移(弗兰德和凯撒，1998年,2000;Pollard等人，1998年). 然而，Ero1p与任何氧化还原酶或其他已知蛋白质没有同源性。酵母Ero1p和hERO1-Lβ与ER中的折叠功能一致，是由未折叠蛋白反应（UPR）诱导的(弗兰德和凯撒，1998年;Pollard等人，1998年;Pagani等人，2000年). 缺氧刺激hERO1-Lα而非hERO1-Lβ的表达(Gess等人，2003年).

众所周知，PDI有助于形成二硫键。它已被证明在体外催化多种底物的二硫键形成、异构化和还原(弗里德曼，1989年)，但其在体内的作用尚不清楚。PDI是一种基本蛋白质，占ER中蛋白质的～2%，并含有两个硫氧还蛋白样Cys-Gly-His-Cys（CGHC）活性位点(Goldberger等人，1963年;Laboissiere等人，1995年). PDI的Cys-Gly-His-Ser（CGHS）活性位点突变体对DTT敏感的发现为PDI在体内形成二硫键中的作用提供了证据(Holst等人，1997年). 这种突变PDI不能作为蛋白质的氧化剂，但仍能催化蛋白质二硫化物的异构化。虽然这些观察结果表明PDI的基本作用是解读非天然二硫键(Laboissiere等人，1995年)该突变PDI的DTT敏感性表型表明，PDI通常在催化二硫键形成中发挥重要作用。此外，在ero1型-1突变体，PDI以减少的形式积累，表明Ero1p在内质网二硫键形成途径中作用于PDI上游(Frand和Kaiser，1999年).

最近，巯基氧化酶Erv2p被认为在与Ero1p平行的内质网氧化折叠中发挥作用(Gerber等人，2001年;Sevier等人，2001年;Gross等人，2002年). Erv2p是巯基氧化酶ERV/ALR家族的成员(Thorpe等人，2002年)已在许多亚细胞隔室中发现。虽然Erv2p可以补偿Ero1p过度表达时的缺陷(Sevier等人，2001年)并能在体外直接氧化蛋白质(Gerber等人，2001年)，在检查的条件下，删除ERV2型至多对增长的影响不大(Sevier等人，2001年;Tu和Weissman，2002年). 这些观察结果表明，Ero1p是蛋白质氧化的主要参与者，Erv2p作为巯基氧化酶的生理作用仅限于尚未检测的非必需蛋白质子集或生长条件。在酵母中，Erv2p（Erv1p）有一个基本同源物，定位于线粒体膜间隙(Lange等人，2001年). Erv1p的巯基氧化酶活性可能对适当的线粒体稳态和铁硫簇蛋白的组装很重要(利索斯基，1994年;Lee等人，2000年;Lange等人，2001年)也许是通过催化二硫键的形成，尽管线粒体膜间空间的氧化环境尚未得到很好的表征。有趣的是，ERV家族的痘苗病毒蛋白与病毒蛋白在宿主细胞溶质中组装期间形成二硫醚有关(Senkevich等人，2000年).

氧化当量转移的Ero1依赖途径

最近，利用纯化的Ero1p和PDI作为唯一的蛋白质组分，在体外重建了Ero1p-介导的二硫键形成(Tu等人，2000年). 即使在亚化学计量Ero1p到二硫化物浓度（例如，1:340）下，Ero1p-催化的氧化折叠过程比PDI催化的底物氧化折叠过程更快，且存在最佳谷胱甘肽氧化还原缓冲液(Tu等人，2000年). 此外，在体内和体外，这种Ero1p驱动的反应可以独立于谷胱甘肽发生(库佐和凯撒，1999年;Tu等人，2000年). 具有Cys-Gly-His-Ala（CGHA）活性位点的突变PDI是Ero1p催化反应的主要抑制剂，在体内外可以在这两种蛋白质之间捕获混合二硫键交联(Frand和Kaiser，1999年;Tu等人，2000年). 这些观察结果表明Ero1p通过二硫化物交换直接氧化PDI(Tu等人，2000年). PDI随后催化折叠蛋白中二硫化物的形成。Ero1p不能有效地作为折叠底物的直接氧化剂，因此依赖PDI转移氧化当量(Tu等人，2000年). 因此，氧化当量通过蛋白质传递发生转移：Ero1p到PDI再到蛋白质(图1). 这种重组系统可能被证明有助于重组含二硫蛋白的复性。Ero1p还可能通过氧化PDI，改变其构象，从而改变其对特定底物的亲和力，参与介导蛋白质向胞浆的逆转录易位(蔡和拉波波特，2002年).

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图1。

酵母ER中氧化蛋白折叠的示意图模型。ER中二硫键的形成是由Ero1p驱动的。结合FAD的Ero1p氧化PDI，PDI随后直接氧化折叠蛋白。然后，结合FAD的Ero1p将电子传递给分子氧，可能导致ROS的产生。在胞浆中合成的FAD可以很容易地进入内质网腔并刺激Ero1p的活性。二硫化物异构化和还原可以由PDI、Eug1p、Mpd1p、Mpd2p或Eps1p的四种同源物中的一些进行，此外PDI本身也可以进行。还原型谷胱甘肽（GSH）也可能有助于二硫化物的还原，从而产生氧化型谷胱甘酮（GSSG）。

PDI及其同系物在氧化折叠中的作用

尽管PDI能够催化一系列硫代二硫化物反应，但在体内PDI主要以氧化形式存在(Frand和Kaiser，1999年)这意味着其主要细胞功能是通过Ero1p途径氧化折叠蛋白。有趣的是，PDI有四种同源物(欧盟1,MPD1（MPD1）,MPD2型、和EPS1系统)在酵母中发现，在高等真核生物中发现了数十种以上。初步实验表明，酵母Ero1p在体外不能与其中几种PDI同源物相互作用（未发表的数据），这种特异性也可能扩展到人类系统(Mezghrani等人，2001年). 然而，从酵母中免疫沉淀出Ero1p和Mpd2p的Cys-Gly-His-Ala（CGHA）活性位点突变体之间的混合二硫键交联(Frand和Kaiser，1999年). 在hERO1-Lα和ERp44之间也分离出一个混合的二硫键交联(Anelli等人，2002年). 这些发现的一个复杂之处是，PDI及其同源物可以作为混合的二硫化物与它们正在折叠的蛋白质被捕获(Molinari和Helenius，1999年)因此，这些交互作用的功能相关性仍有待探索。

Ero1p不能与几个PDI变体相互作用，这表明它可以区分PDI及其同源物。这种区分可以使不同的PDI相关蛋白作为专用的二硫键异构酶或还原酶发挥作用，这需要其硫氧还蛋白样活性位点中的半胱氨酸残基以还原形式存在(图1). PDI本身可能也有助于体内二硫键异构化和还原。在细菌系统中，研究表明，这些PDI相关蛋白的作用取决于它们是否能与上游氧化酶或还原酶相互作用，而不是取决于其活性位点的氧化还原电位。例如，蛋白质DsbC的二聚化可防止DsbB氧化，并使其发挥专用异构酶的作用(Bader等人，2001年). 破坏二聚化的DsbC突变体被DsbB氧化，可以充当蛋白质氧化剂DsbA的作用(Bader等人，2001年). 此外，周质膜蛋白DsbD通常维持DsbC的还原状态，将胞浆硫氧还蛋白的还原能力传递给DsbC(Rietsch等人，1997年). 一些真核生物PDI同源物也可以通过上游还原酶以还原形式保存。解决这些PDI相关蛋白如何以及是否与Ero1p相互作用，有助于深入了解其细胞作用和功能决定因素。

谷胱甘肽在氧化折叠中的作用

谷胱甘肽是真核细胞中主要的氧化还原缓冲液(Hwang等人，1992年). 胞浆中还原（GSH）与氧化（GSSG）谷胱甘肽的比率为～100:1(Hwang等人，1992年). 这种高度还原的环境不利于二硫键的形成。然而，在发生二硫化物形成的ER中，GSH:GSSG的比率在～3:1时氧化性更强(Hwang等人，1992年). 长期以来，人们认为分泌途径中丰富的GSSG是形成二硫化物的氧化当量的来源(Hwang等人，1992年). 然而，在体内和体外，Ero1p催化的二硫键的形成独立于谷胱甘肽进行(库佐和凯撒，1999年;Tu等人，2000年). 那么谷胱甘肽的作用是什么？

酵母中的遗传证据表明，谷胱甘肽对二硫键的形成是不必要的，相反，它在内质网中起着净还原剂的作用(库佐和凯撒，1999年). 在温度灵敏度抑制器屏幕中ero1型-1突变体，删除GSH1型，参与谷胱甘肽的生物合成，被发现强烈抑制ero1型-1表型(库佐和凯撒，1999年). 对这一观察结果的解释是，谷胱甘肽作为还原剂的缺失导致氧化的PDI和蛋白质的还原减少，这使得ero1型-1支持生长的氧化系统。单位Δ谷胱甘肽1菌株，CPY的氧化折叠按照正常动力学进行，但对氧化应激高度敏感，这与谷胱甘肽作为净还原剂的作用一致(库佐和凯撒，1999年).

ER中GSSG含量高的依据是什么？Ero1p不能直接将GSH氧化为GSSG(Tu等人，2000年). 然而，即使存在还原型谷胱甘肽（GSH），Ero1p和PDI也可以驱动折叠底物的氧化。随着时间的推移，体外观察到GSH介导的PDI和折叠蛋白中二硫化物的还原导致GSSG的逐渐生成(Tu等人，2000年) (图1). 因此，ER中GSSG的丰度可能是Ero1p活性的结果，ER中的GSH:GSSG氧化还原缓冲区代表Ero1p-介导的氧化和谷胱甘肽介导的还原过程的结果之间的平衡。Ero1p和PDI对氧化当量的动力学穿梭作用独立于整体氧化还原环境发生，这可以解释ER如何支持快速二硫键形成，同时保持还原或重排不正确二硫键的能力，可能通过谷胱甘肽和某些PDI同系物。

ER氧化电位的来源

那么，真核生物二硫键形成的氧化电位来源是什么？在细菌中，二硫键的形成通过醌的氧化与细胞呼吸相耦合(Bader等人，1999年). 周质膜蛋白DsbB在一轮二硫键形成后减少泛醌自身再氧化(Bader等人，1999年,2000). 然后泛醌被呼吸链再次氧化，分子氧充当终端电子受体(Bader等人，1999年). 采用生物化学和遗传学方法确定真核生物二硫键形成的氧化当量来源(Tu等人，2000年;Tu和Weissman，2002年). 使用酵母系统，去除候选氧化还原分子，以确定它们是否对体内氧化折叠很重要。与原核生物不同，酵母的氧化折叠不依赖于细胞呼吸，因为它不受泛醌或血红素缺乏的影响(Tu等人，2000年). 然而，酵母中核黄素的缺乏导致氧化折叠的显著缺陷(Tu等人，2000年). 此外音量控制器1将黄素单核苷酸（FMN）转化为黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），强烈抑制ero1型-1突变体(Tu等人，2000年). 这些观察结果有力地表明，酵母中的氧化折叠依赖于细胞FAD水平。

真核生物中氧化折叠依赖于FAD的进一步证据来自于纯化Ero1p本身是一种新的FAD结合蛋白的发现(Tu等人，2000年) (图1). 当将FAD添加到纯化的Ero1p和PDI中时，这些成分一起可以在体外支持强大的氧化折叠(Tu等人，2000年). 虽然FAD对Ero1p的持续活性至关重要，但它并不是终端电子受体。每个结合FAD的Ero1p分子都可以支持多轮PDI氧化，而过量的游离FAD不能在厌氧条件下驱动Ero1p-催化的二硫化物的形成(Tu和Weissman，2002年). 这些观察结果表明，分子氧而不是FAD作为终端电子受体发挥作用(Tu和Weissman，2002年) (图1). 体外实验证实，Ero1p催化的二硫化物形成在厌氧条件下受到影响，并且Ero1p在其反应循环中直接消耗分子氧(Tu和Weissman，2002年). 此外ero1型-1在正常允许温度下的厌氧条件下，突变体是完全不可感染的(Tu和Weissman，2002年). FAD-结合Ero1p对分子氧作为终端电子受体的有效利用可以解释PDI摩尔浓度的氧化(吉尔伯特，1990年)尽管FAD浓度在低微摩尔范围内(Gliszczynska和Koziolowa，1998年). Ero1p可能在厌氧条件下使用替代的终端电子受体，尽管这些受体的身份仍然未知。

FAD在氧化折叠中的作用

氧化折叠对FAD的依赖性定义了这种多功能氧化还原分子在ER管腔中的新作用。Ero1p是第一个被描述的完全定位于内质网腔内的黄素蛋白，并且有人认为存在一个将FAD导入内质网腔的强大转运系统(Tu和Weissman，2002年). 在酵母中，体内氧化折叠对特异性游离细胞FAD水平高度敏感(Tu和Weissman，2002年). 这种敏感性可以在体外重现，因为Ero1p的活性变化很大，与生理FAD浓度的偏差很小(Tu和Weissman，2002年). 虽然Ero1p对游离FAD水平的这种敏感性对于黄素蛋白来说是不寻常的，但它可能提供了一种调节氧化折叠的方法（另见下文）。还需要进一步的工作来确定FAD如何调节Ero1p的活性，以及这是否是Ero1p的保守性质。

氧化折叠是细胞氧化应激的来源

分子氧作为二硫键形成的终端电子受体似乎是合适的，因为它的还原电位大于所有其他生物氧化剂。然而，分子氧向水的完全四电子还原反应动力学缓慢，还原中间体和副产物（如超氧物和过氧化氢）具有很高的反应性，并对大分子造成破坏。在细菌中，这个问题通过将氧化折叠与呼吸链耦合来解决(Bader等人，1999年)它由一系列复杂的膜电子传递蛋白组成，可有效地将分子氧还原为水。然而，由于真核生物中的氧化折叠和呼吸仅限于单独的细胞器（ER与线粒体），Ero1p氧化系统已进化为独立于呼吸的功能，并采用了基于黄素的氧化还原化学(Tu等人，2000年). 与醌类相比，FAD是一种相对较弱的氧化剂，因为其氧化还原电位较低，但与FAD结合的Ero1p能够快速将电子直接传递给O₂为真核生物二硫键的形成提供动力(Tu和Weissman，2002年).

Ero1p消耗的分子氧的去向尚不清楚。O的标准双电子还原₂产生过氧化氢（H₂O（运行）₂). 虽然在Ero1p催化二硫化物形成的过程中可以检测到过氧化氢的亚化学计量量，但它似乎没有释放出每形成一个二硫化物的化学计量量的过氧化氢(Tu和Weissman，2002年). 然而，在细胞水平上，最近的研究表明，不受控制的Ero1p氧化酶活性可能是氧化应激的重要来源。Harding等人（2003年）最近发现内质网应激可导致活性氧的急性生成。对缺乏跨膜激酶PERK的蠕虫内质网应激，PERK磷酸化eIF2α以减少内质网胁迫下的整体翻译(Harding等人，1999年)导致细胞内大量积累过氧化物，通过RNAi降低Ero1p功能在很大程度上消除了这种影响(Harding等人，2003年).

这些观察结果表明，Ero1p可能是细胞内ROS的重要组成部分。一个简单的计算表明了这个假设的合理性。假设所有蛋白质中的约1/3是分泌蛋白质，每翻译约500个氨基酸必须形成一个二硫键。如果每翻译一个氨基酸消耗大约相当于三个ATP(史崔尔，1995年)然后每～1500 ATP形成一个二硫键。ATP产生的ROS发生频率为1–2%(史崔尔，1995年)，如果每减少一个氧分子产生大约四到五个ATP，那么每呼吸产生500个ATP，就会产生一到两个ROS分子。假设每形成一个二硫化物就产生一个活性氧分子，Ero1p介导的氧化可能占蛋白质合成过程中产生的细胞活性氧的约25%，最近的一项研究表明，这是细胞能量消耗的主要来源(Princiotta等人，2003年). Ero1p产生的ROS显著，但呈亚化学计量，这可能是检测方法的局限性(Tu和Weissman，2002年). Ero1p产生活性氧的机制和程度有待进一步探讨。尽管如此，很明显，二硫键的形成可能是活性氧的重要来源，特别是在特殊分泌细胞中。许多分泌蛋白也含有大量的二硫化物，它们的正确形成可能需要多个氧化、还原和再氧化循环。此外，Ero1p活性是细胞内氧化谷胱甘肽（GSSG）的主要来源(库佐和凯撒，1999年;Tu等人，2000年)，这是氧化应激的另一个来源。

因此，Ero1p活性可能是氧化应激的重要来源，需要适当调节氧化折叠和ER中还原剂系统的功能。细胞将蛋白质氧化与其折叠负荷联系起来可能很重要，因为如果不控制氧化折叠，ER可能会过度氧化，导致蛋白质错误折叠，产生活性氧和氧化谷胱甘肽，以及以还原当量的形式徒劳消耗能量。这种氧化当量的产生也可能需要加以控制，以便于维持PDI同系物，也许PDI本身的一部分以还原形式存在，并将与二硫化物形成相关的氧化应激引起的固有毒性降至最低。UPR诱导是调节氧化折叠的一种机制，但可能有更直接的调节手段。由于Ero1p氧化系统对细胞内游离FAD水平具有高度响应性，因此控制Ero1p可用的游离FAD的水平可能是根据细胞需要调节氧化折叠的翻译后机制。尽管是推测性的，但值得注意的是RIB1级控制核黄素生物合成的第一步，是UPR的目标(Travers等人，2000年). 此外，初步实验表明，酵母中的游离FAD水平可以根据其生长阶段和条件而变化（未公布的数据）。或者，内质网中的游离FAD水平可以由FAD特异性转运体控制。

结论

总之，虽然先前的氧化折叠研究侧重于内质网的体氧化还原电位，但现在很明显，真核生物二硫键的形成是通过蛋白质接力将氧化当量动态穿梭到折叠底物上进行的。由于Ero1p驱动的氧化机制与体氧化还原环境隔离，还原谷胱甘肽和某些PDI同系物可能有助于异构化和还原不正确的二硫键。氧化折叠通过FAD依赖机制与分子氧的强还原电位耦合，但潜在后果是产生有毒活性氧物种。事实上，Ero1p可能是细胞氧化应激的重要促因，并建议必须根据ER上的折叠负荷仔细调整其活性。控制Ero1p可用的游离FAD水平可能是根据细胞的营养或代谢状态调节氧化折叠的一种手段。未来的工作将揭示内质网如何为分泌蛋白正确折叠所需的多种氧化还原过程保持最佳环境。

笔记

B.P.Tu目前的地址是德克萨斯州达拉斯哈里·海恩斯大道5323号犹他州西南医学中心生物化学部，邮编75390-9038。

本文中使用的缩写：FAD，黄素腺嘌呤二核苷酸；蛋白质二硫异构酶；活性氧；未折叠蛋白反应。

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