结果
Caf4p与Fis1p相关
利用多维蛋白质鉴定技术（MudPIT）鉴定Fis1p相关蛋白(Link等人，1999年;Graumann等人，2004年)，我们构建了一株含有内源性Fis1p和NH的酵母菌株2-末端串联亲和标签(A） ●●●●。全日空航空公司2-端子标记是必要的，因为FIS1系统当COOH最终标记（未发布数据）时，为非功能状态。我们首先设计了一个包含9XMyc/TEV的复合盒/URA3公司/TEV/他的8模块(A） ●●●●。在有针对性地集成到FIS1系统侧翼～50-bp烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶位点切除物之间的位点、自发和精确重组URA3公司该策略用于产生一株表达功能性Fis1p和NH的酵母菌株（DCY1557）2-端子9XMyc/TEV/His8标签（M9TH-Fis1p）。
M的构造
9
TH公司-FIS1系统和Caf4p/Mdv1p对齐。（A） 一辆9xMyc-TEV-URA3公司-TEV-His公司8用PCR扩增盒FIS1系统-靶向引物并整合到NH中2终点FIS1系统.弹出URA3公司通过侧翼TEV位点之间的重组盒产生M9TH公司-FIS1系统在内源性的控制下FIS1系统发起人。UTR：未翻译区域。（B） Mdv1p和Caf4p示意图。NH2-终端扩展（NTE）、线圈和WD40区域以百分比标识显示。总体一致性为37%，总体相似性为57%。
串联亲和纯化M9TH-Fis1p在两个独立的实验中进行了MudPIT分析（见材料和方法）。在这两个实验中都鉴定出了Fis1p（61.3%的覆盖率，14个独特肽；58.7%的覆盖度，9个独特肽）。Mdv1p是线粒体裂变途径的一个先前确定的成员，也是已知的Fis1p相互作用蛋白，在这两个实验中也被确定（22.1%覆盖率，12个独特肽；10.2%覆盖率，5个独特肽）。这些数据证实了我们的MudPIT程序可以保存和识别与线粒体裂变相关的Fis1p复合物。在这两个数据集中都没有观察到Dnm1p，这与之前的免疫沉淀实验一致(Mozdy等人，2000年). 完整的数据集如表S1所示（见http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200503148/DC1).
有趣的是，来自WD40重复蛋白Caf4p的肽在两个Fis1p MudPIT实验中都得到了鉴定（24.4%覆盖率，9个独特肽；8.5%覆盖率，3个独特肽）。咖啡四烯酸（YKR036C）首次在酵母双杂交筛选中鉴定出CCR4p相互作用蛋白(刘等人，2001). CCR4p是CCR4-NOT转录调节剂和细胞溶质二苯醚酶复合物的核心成分(Denis和Chen，2003年). Caf4p是Mdv1p在酿酒酵母（38%的同源性和57%的相似性），这两种蛋白质在其整个长度上表现出广泛的序列同源性(B） ●●●●。这两种蛋白质共享一个独特的NH2-终端扩展（NTE）（25.3%身份）、中心线圈（CC）域（19%身份）和COOH-终端WD40重复域（44.4%身份）。在MultiCoil预测程序中，Caf4p CC的得分明显弱于Mdv1p线圈（～1.0概率）（～0.3概率）(Wolf等人，1997年).
Caf4p与线粒体裂变机制的成分相互作用
我们寻求独立确认Fis1p和Caf4p之间的物理相互作用。在免疫沉淀实验中，Caf4p-HA或Mdv1p-HA在携带M染色体的菌株中从其内源性启动子表达三TH公司-FIS1系统（3XMyc/TEV/His8-FIS1系统)和已为删除CAF4类或MDV1型分别是。当M三TH-Fis1p为免疫沉淀，Caf4p-HA和Mdv1p-HA共沉淀约5%(A、 车道7和10）。
Caf4p和Mdv1p联合免疫沉淀实验。（A） 对携带所示HA和Myc标记结构的酵母进行裂解，并用抗Myc抗体进行免疫沉淀。用所示的抗Myc（9E10）和抗HA（12CA5）抗体通过免疫印迹分析总裂解物（标记为“裂解物”）和免疫沉淀样品（标记为”Myc IP“）。表达结构为：Caf4p wt（残基1–659）、Caf4pN（残基1-274）、Caf2p C（残基275–659。酵母背景为：（A）野生型，1-6道；咖啡4ΔM三TH公司-FIS1系统，7–9车道；多维数据集1ΔM三TH公司-FIS1系统，10–12车道；（B） 野生型，1-6车道；咖啡四烯酸ΔMDV1型-HTM，7–9车道；mdv1型ΔCAF4类-HTM，10–12车道；CAF4类-HTM，13–15车道；MDV1型-HTM，16–18车道。（B） 携带所示HA和Myc标记结构的酵母进行免疫沉淀，并按照A中的方法进行分析。免疫沉淀样品以10（A）和20（B）当量的裂解液样品装载。裂解液中的HA标记蛋白标有星号。HA标记的Caf4p C多肽与HA抗体检测的总裂解物印迹中的背景带共迁移。
先前的酵母双杂交分析确定，Mdv1p（残基1–300）的NTE/CC区域负责其与Fis1p的相互作用(Tieu等人，2002年). 我们通过共免疫沉淀检测到相同的相互作用(A、 车道11）。此外，我们发现Caf4p的类似区域（残基1–274）也与Fis1p相互作用(A、 车道8）。一个较短的Caf4p片段缺乏大多数预测的卷曲螺旋（残基1-250），与Fis1p的相互作用同样良好（未公布的数据）。相比之下，Fis1p未与Mdv1p或Caf4p的COOH末端区域结合(A、 车道9和12）。这些数据表明，Caf4p和Mdv1p可能通过涉及NTE域的共同机制与Fis1p相互作用。
我们还使用酵母双杂交分析了Caf4p和Mdv1p与Fis1p和Dnm1p的相互作用(). 全长Caf4p和Caf4p的NTE/CC片段与Fis1p的细胞溶质部分（残基1-128）强烈相互作用，这与我们的免疫沉淀数据一致。正如之前报道的那样，Fis1p与全长Mdv1p和Mdv1的NTE/CC区域之间也观察到类似的相互作用(Tieu等人，2002年;Cerveny和Jensen，2003年). Mdv1p和Caf4p的WD40域与Dnm1p相互作用强烈。然而，全长Mdv1p相互作用较弱，未检测到全长Caf4p和Dnm1p之间的相互作用。这些结果表明，WD40结构域与Dnm1p的相互作用受到NH的调节和抑制2-Caf4p和Mdv1p的末端区域。
表一。
酵母双杂交试验中Caf4p和Mdv1p与Dnm1p和Fis1p相互作用
| | | | 咖啡厅4p
| Mdv1p公司
|
|---|
| | 鱼类1p | 丹麦1p | 重量 | N个 | C类 | 重量 | N个 | C类 |
|---|
| 鱼类1p | | − | − | + | + | − | + | + | − |
| Dnm1p型 | | − | + | − | − | − | − | − | − |
| 咖啡4p | 重量 | + | − | − | − | − | − | 虚弱的 | − |
| N个 | + | − | − | − | − | − | − | − |
| C类 | − | + | − | − | − | − | − | − |
| Mdv1p公司 | 重量 | + | + | − | + | − | + | + | − |
| N个 | + | − | − | + | − | + | + | − |
| C类 | − | + | − | − | − | − | − | − |
我们还检测到Caf4p和Mdv1p之间的同型和异型相互作用。约5%的Caf4p-HA和Caf4p-N-HA（残基1–274），但不是Caf4-C-HA（残基达275–659），与全长Caf4p-HTM共免疫沉淀(B、 车道13-15）。Mdv1p-HA和Mdv1-P-N-HA（残基1-300）水平相似，但与Mdv1\p-HTM免疫共沉淀的Mdv1-C-HA（残基团301-714）水平不同(B、 16–18车道）。当Caf4p-HTM沉淀时，共沉淀了约1%的Mdv1p-HA和Mdv1-p-N-HA，而不是Mdv1\p-C-HA(B、 车道10–12）。类似地，当Mdv1p-HTM沉淀时，共沉淀约1%的Caf4p-HA和Caf4p-N-HA，而不是Caf4pC-HA(B、 车道7–9）。此外，Caf4p和Mdv1p的NTE/CC区域在双杂交分析中相互作用(). 因此，Caf4p与裂变途径的所有三个成员相互作用，与NH相互作用2-末端区域介导与Fis1p、Mdv1p的相互作用，以及与Caf4p的同型相互作用。
Caf4p参与线粒体分裂
鉴于Caf4p与Fis1p、Mdv1p和Dnm1p相互作用，我们假设Caf4p与Mdv1 p一样是线粒体分裂装置的组成部分。咖啡4然而，Δ酵母显示出正常的线粒体形态，管状线粒体均匀分布在细胞皮层周围(). 在高温和葡萄糖以外的碳源（甘油或半乳糖；未公开数据）上也观察到野生型线粒体形态。鉴于此，这种观察并不令人惊讶CAF4类在全基因组线粒体形态突变缺失菌株筛查中未发现(Dimmer等人，2002年).
CAF4调节线粒体形态。表达线粒体靶向GFP的菌株在YP葡萄糖培养至中对数期并固定。细胞百分比(n个=400），线粒体具有野生型（A）、塌陷网状（B）或扩张网状形态（C和D）。扩散网表型包括形态分布，从包含一个或两个环的简单结构（C）到具有数十个环的复杂开窗线粒体（D）。对于野生型和咖啡4Δ菌株，野生型类别包括1%的碎片细胞。棒材，1μm。
我们接下来测试咖啡4当裂变机制的其他成分被删除时，Δ细胞在线粒体形态上显示出合成缺陷。线粒体融合导致线粒体分裂缺陷的酵母显示网状线粒体形态(Bleazard等人，1999年;Sesaki和Jensen，1999年). 这些线粒体网络可以具有扩散形态()或者它们会坍塌到牢房的一边(B） ●●●●。尽管FIS1系统,DNM1（DNM1）、和MDV1型都与线粒体分裂有关，我们发现多维数据集1Δ细胞的线粒体分布特征很容易与两者区分开来财务报表1Δ和dnm1Δ电池(). 在富含葡萄糖的培养基中，几乎所有财务报表1Δ或dnm1Δ细胞（分别占93%和90%）含有塌陷的线粒体网络。相比之下，不到一半mdv1型Δ细胞包含塌陷的网状结构，大多数细胞表现出扩张的网状结构。扩展网络的形态范围包括具有多个回路的互连管(C） 到具有复杂窗的网络(D） ●●●●。mdv1型Δdnm1Δ电池的行为与dnm1Δ细胞，葡萄糖中>90%的网状物塌陷(). 该观察结果表明dnm1Δ折叠净表型与mdv1型Δ传播网络表型。在富含半乳糖的培养基中（未公布的数据），所有菌株中有很大一部分含有传播网，但同样如此mdv1型Δ细胞具有比财务报表1Δ (45.5%),dnm1Δ（53%），或mdv1型Δdnm1Δ细胞（40.5%）。这些结果与之前的报告一致多维数据集1与dnm1半乳糖培养基中的Δ细胞(Cerveny等人，2001年). 然而，这项研究发现mdv1型Δ传播网络表型对dnm1Δ坍塌净表型(Cerveny等人，2001年). 这种差异的原因尚不清楚，但我们注意到mdv1型Δ形态在葡萄糖培养基中最为明显。
最有趣的是，我们发现mdv1型Δ咖啡4Δ细胞的线粒体净分布与上述两种细胞无明显区别dnm1Δ电池或财务报表1Δ单元。删除CAF4类在里面多维数据集1Δ细胞显著地将分布转移到几乎完全由崩溃的线粒体网络组成的区域（葡萄糖>90%，). 我们的结果支持一个模型，即线粒体分裂的部分减少导致线粒体网的主要扩散，而分裂的完全丧失最终导致网的崩溃。那就是，mdv1型Δ细胞保留残余线粒体分裂，而多维数据集1Δ咖啡4Δ细胞没有裂变，类似于dnm1Δ,财务报表1Δ，或mdv1型Δdnm1Δ细胞。哺乳动物细胞中似乎也存在类似的情况，弱的Drp1显性负等位基因导致传播网络的形成，而强的显性负等位点导致网络崩溃(Smirnova等人，2001年).
我们通过在latrunculin A的存在下重新分析线粒体形态来测试这个模型，latrunculan A破坏了肌动蛋白细胞骨架。由于线粒体持续分裂，肌动蛋白细胞骨架的破坏导致线粒体网络迅速断裂(Boldogh等人，1998年;Jensen等人，2000年). Latrunculin A治疗能迅速将一部分塌陷的蚊帐分解为蔓延的蚊帐(Jensen等人，2000年;Cerveny等人，2001年)，并允许更仔细地检查线粒体网络中的连接程度。类似地，在哺乳动物细胞中，由显性负性Drp1过度表达引起的线粒体网络崩溃可以通过微管解聚剂诺可唑传播(Smirnova等人，2001年). 野生型和咖啡4用latrunculin A处理的Δ酵母显示线粒体断裂(). 80%mdv1型经latrunculin A处理的Δ细胞含有部分线粒体网络(E、 局部网）与主要在latrunculin A中处理的坍塌网或扩展网相比，其互连程度更低，窗户更少dnm1Δ或财务报表1Δ单元。95%的latrunculin A–经过处理mdv1型Δ咖啡四烯酸Δ单元显示塌陷网络或高度开窗的扩展网络，与dnm1Δ或财务报表1Δ细胞(). 因此，在肌动蛋白细胞骨架被破坏后，mdv1型Δ酵母显示线粒体形态分布，表明线粒体分裂存在不完全缺陷。相反，mdv1型Δ咖啡4Δ酵母的线粒体形态与财务报表1Δ和dnm1型Δ酵母。我们的结论是CAF4类介导低水平的线粒体分裂mdv1型Δ单元。
CAF4类介导残余裂变mdv1型
Δ
细胞。顶部：用200μM latrunculin A（+）或载体（−）处理在YP葡萄糖中生长的中对数培养物60分钟。对于每个菌株，200个细胞被分为以下表型类别：野生型（A）、碎片和短管（B）、折叠网（C）、扩展网（D）或部分网（E）。显示的数字是百分比。碎片和短小管类别包括一系列形态，从完全碎片（如B所示）到碎片和短管的混合物。（F–H）延时电影中显示裂变事件的静态图像mdv1型用200μM latrunculin A处理的Δ酵母。在随后的五幅图像序列中，第一帧中的装箱区域被放大。箭头表示裂变事件。用外膜标记物OM45-GFP观察线粒体。棒材，1μm。
接下来我们监测了线粒体网络mdv1型Δ细胞通过延时显微镜评估线粒体分裂水平。在初步实验中，我们发现mdv1型Δ细胞迅速参与了融合事件，这使得裂变的明确记录变得困难。由于latrunculin A降低融合水平，从而延长游离线粒体末端的存在，我们监测了latrunculan A处理的线粒体动力学mdv1型Δ细胞携带外膜标记OM45-GFP。10个中的8个mdv1型Δ细胞，我们在30分钟的记录时间内观察到至少一次裂变事件(，F–H；视频1和2，请访问http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200503148/DC1). 由于这些细胞线粒体网络的复杂性和快速重排（见视频1和2），这些数字可能低估了裂变的实际水平。相比之下，在8个多维数据集1Δ咖啡4Δ单元。我们得出结论CAF4类介导线粒体裂变事件显著促进了mdv1型Δ单元。
线粒体分裂被Caf4p或Caf4p片段的过度表达所阻断
因为Mdv1p或Mdv1 p片段的过度表达抑制线粒体分裂(Cerveny和Jensen，2003年)，我们接下来测试了Caf4p过量生产的影响。在富含半乳糖的培养基中，GalL启动子控制下的Caf4p-HA表达高于内源性水平约20倍（未发表数据）。在23.5%的细胞中形成线粒体网(C） ●●●●。另外38%的细胞具有中间表型，我们称之为“连接小管”，由完全互连的线粒体网络组成，其中未检测到小管末端(B） ●●●●。NH的过度表达2-与Fis1p相互作用的末端片段（残基1-250；未发表的数据）也有类似的作用（9%扩散网络，33%连接小管；)表明线粒体网状结构的形成可能是由于对Fis1p功能的显性负效应所致。线粒体表型的相似分布是由20倍的Mdv1p-HA（7.5%的扩展网络和24.5%的互连小管）和Mdv1-HA NH的过度生产造成的2-末端片段（5%的扩展网络和39%的互连小管；未发表的数据）。这些数据证实Caf4p与线粒体裂变装置相互作用。
Caf4p过度表达阻止线粒体分裂。携带pRS416 GalL载体的野生型酵母（DCY1979）在富含葡萄糖或半乳糖的培养基中培养180分钟并固定。细胞被分为以下表型类别：野生型（A）、连接小管（B）或带小管的扩张网（C）。显示的数字是百分比(n个= 200). 通过连续稀释裂解产物的Western blot（未描述），估计半乳糖培养物中的过度表达导致表达量比内源性水平高20倍。棒材，1μm。
完全旁路抑制fzo1型Δ要求两者都损失MDV1型和CAF4类
酵母分裂突变体能够抑制线粒体融合缺陷细胞的甘油生长缺陷(Bleazard等人，1999年). 的确，MDV1型最初被鉴定是因为它能够抑制携带温度敏感菌株的甘油生长缺陷fzo1型或毫克1等位基因(Fekkes等人，2000年;Mozdy等人，2000年;Tieu和Nunnari，2000年;Cerveny等人，2001年). 删除MDV1型此前有报道称，它可以抑制fzo1型Δ细胞的效率低于删除DNM1（DNM1）(Cerveny等人，2001年). 为了进一步验证我们的假设mdv1型Δ细胞只有部分线粒体分裂损失，我们比较了线粒体分裂的效率mdv1型Δ和dnm1Δ突变抑制fzo1型Δ单元。对二倍体进行孢子化、基因型分析，并通过连续稀释法对其在甘油平板上相对于葡萄糖平板的生长能力进行评分(). 如预期，所有为野生型，没有fzo1型Δ孢子在甘油平板上生长。共17页mdv1型Δfzo1型Δ孢子测试表明，7个孢子在甘油上没有检测到生长，另外4个孢子生长很差，在甘油上的细胞存活率小于1%。剩下的6个孢子中，只有3个在甘油的作用下存活率超过20%。超过一半dnm1Δfzo1型Δ孢子在甘油平板上生长旺盛，细胞存活率在20%至50%之间。最重要的是，三重突变体多维数据集1Δ咖啡4Δfzo1型Δ孢子比mdv1型Δfzo1型Δ孢子，所有孢子都生长在甘油上，大多数细胞存活率在20%到50%之间。明显增强的旁路抑制fzo1型Δ依据mdv1型Δ咖啡4Δ双突变与mdv1型Δ突变提供了遗传证据mdv1型由于Caf4p的活性，Δ细胞保留了残余的线粒体分裂。
甘油生长缺陷的抑制
fzo1型
Δ单元。通过YP甘油和YP葡萄糖平板上的连续稀释法对所示基因型的单个孢子进行分析，以确定在含甘油培养基上的存活率。每个点代表单个孢子的活力。为了清楚起见，将存活率为1%或更低的孢子标绘为1%。
Caf4p以Fis1p依赖的方式定位于线粒体
接下来我们试图确定Caf4p的亚细胞定位。在高纯度线粒体制剂中检测到Caf4p(Sickmann等人，2003年)在全基因组分析中产生的Caf4p-GFP融合定位于线粒体(Huh等人，2003年). 我们确认了Caf4p-GFP的线粒体定位，但没有进一步研究，因为GFP融合蛋白在表达时没有功能CAF4类位点（未公布的数据）。相反，我们使用免疫荧光来定位由内源性位点表达且具有功能的Caf4p和Mdv1p的Myc标记版本（称为Caf4p-HTM和Mdw1p-HTM）。Caf4p-HTM和Mdv1p-HTM显示出清晰的线粒体定位(). 当细胞在富含葡萄糖的培养基中生长时，Caf4p-HTM和Mdv1p-HTM都显示出基本上均匀的线粒体分布，偶尔出现强度增加的区域。在富含半乳糖的培养基中，Caf4p-HTM和Mdv1p-HTM在线粒体上以点状分布(，M–R）。Caf4p-HTM与Dnm1-GFP punta部分共定位(，S–U）。在财务报表1Δ细胞生长在葡萄糖或半乳糖培养基中，Caf4p-HTM和Mdv1p-HTM都主要存在于胞浆中(D–F和J–L）。然而，在一些细胞中，线粒体的残留定位水平较低（例如。，，D–F）。在财务报表1突变酵母，过度表达的GFP-Mdv1p是弥散的细胞溶质，但也保留一些线粒体定位(Tieu和Nunnari，2000年;Tieu等人，2002年). 总之，这些数据表明，Caf4p和Mdv1p的正常线粒体定位在很大程度上取决于Fis1p，尽管在缺乏Fis1p的情况下可能会出现一些低水平的残余定位。
Caf4p和Mdv1p的线粒体定位需要Fis1p。免疫荧光（红色，中间面板）用于在野生型（A–C、G–I和M–U）和fis1Δ细胞（D–F和J–L）。Caf4p-HTM和Mdv1p-HTM由内源性基因座表达，具有功能性。线粒体标记有线粒体靶向GFP（A-R，左，绿色）。大多数Dnm1p-GFP点状物与Caf4p-HTM（S–U）共定位。两个信号的叠加显示在合并图像中（右侧）。注意，Caf4p和Mdv1p在野生型细胞中定位于线粒体，但在fis1Δ细胞。细胞在YP葡萄糖（A-L）或YP半乳糖（M-U）中生长。显示了去卷积z堆栈的代表性最大强度投影。棒材，1μm。（五） 通过亚细胞分离分析Caf4p-HTM和Mdv1p-HTM。用野生型抗Myc抗体（左）和fis1Δ（右）酵母。PGK（3-磷酸甘油酸激酶）是一种细胞溶质标记物，而孔蛋白是线粒体外膜标记物。
我们还通过亚细胞分离评估了Caf4p-HTM的定位。我们在线粒体颗粒中发现了大量Caf4p和Mdv1p(五） ●●●●。Mdv1p以前曾被证明存在于线粒体部分(Fekkes等人，2000年;Tieu和Nunnari，2000年;Cerveny等人，2001年). 然而，在财务报表1Δ酵母这两种蛋白质表现为细胞溶质蛋白质(五） ●●●●。这些数据支持我们的免疫荧光研究，并证实Mdv1p和Caf4p通过与Fis1p的结合定位于线粒体。
Caf4p将Dnm1p-GFP募集到线粒体
为了理解线粒体分裂的机制，阐明Dnm1p是如何被募集到线粒体中的至关重要。鉴于Mdv1p与Fis1p和Dnm1p都相关，线粒体上的Dnm1b组装对Mdv1 p几乎没有依赖性是令人困惑的(Fekkes等人，2000年;Mozdy等人，2000年;Tieu和Nunnari，2000年;Tieu等人，2002年;Cerveny和Jensen，2003年). 随着确认Caf4p是裂变机器的一个组成部分，我们重新检查了这个问题。我们构建了一个全功能的Dnm1p-GFP等位基因，并用反卷积显微镜分析了其定位模式(). 与以前的报告类似(Otsuga等人，1998年)，Dnm1p-GFP主要存在于与线粒体相关的点状细胞中（平均每细胞16.9个线粒体点状细胞与3.3个细胞溶质点状细胞）(和，A–C）。删除CAF4类或MDV1型单独使用对这种定位几乎没有影响（每个细胞分别有15.4个线粒体和5.2个胞质，13.7个线粒体和5.1个胞质；和，D–I）。在所有这些菌株中，Dnm1p点的大小和强度相对均匀。
表二：。
Dnm1-GFP点状定位的量化
| 线粒体 | 细胞质的 |
|---|
| 野生型 | 16.9 (± 5.5) | 3.3 (± 2.1) |
|
咖啡4Δ | 15.4 (± 5.2) | 5.2 (± 2.6) |
|
mdv1型Δ | 13.7 (± 5.0) | 5.1 (± 3.0) |
|
财务报表1Δ | 4.9 (± 2.7) | 9.6（±4.3） |
|
mdv1型Δ咖啡4Δ | 4.8 (± 2.5) | 10.4 (± 3.9) |
Fis1p通过Mdv1p或Caf4p介导Dnm1p-GFP定位。将Dnm1p-GFP（中间，绿色）和mito-DsRed（左侧，红色）在指定基因型酵母中的定位进行比较。合并的图像显示在右侧。显示了去卷积z堆栈的代表性最大强度投影。
相反，财务报表1Δ突变体显示出显著的缺陷，大多数泪点现在是胞质的（4.9线粒体对9.6胞质）(和，J–L）。如前所述，一小部分Dnm1p仍定位于线粒体财务报表1Δ电池(Tieu等人，2002年;Cerveny和Jensen，2003年)这表明Dnm1p可能通过第二种途径被招募，可能是通过线粒体脂质的内在亲和力或未知的线粒体结合伙伴。重要的是，在中发现了Dnm1p本地化中的类似缺陷mdv1型Δ咖啡4Δ细胞（每细胞4.8个线粒体vs.10.4个细胞溶质）(和，M–O）。在两者中财务报表1Δ和mdv1型Δ咖啡4Δ细胞，Dnm1p-GFP形成一些大的聚集物和许多不太强烈的斑点。使用针对Dnm1p-HTM蛋白的免疫荧光也获得了类似的结果（未公布的数据）。这些数据清楚地表明，Caf4p或Mdv1p足以有效地将Dnm1p补充到线粒体，而Caf4p对于Fis1p非依赖Mdv1的Dnm1p补充是必不可少的。
讨论
CAF4类和MDV1型在线粒体分裂中发挥类似作用
通过对Fis1p进行亲和纯化和质谱分析，我们确定Caf4p是线粒体分裂机制的一种新成分。我们的生化和遗传特征表明CAF4类功能与MDV1型线粒体分裂。在生化上，这两种蛋白质都与Fis1p和Dnm1p相互作用。Caf4p和Mdv1p共享由NTE、中央CC和COOH终端WD40 repeat组成的通用域架构。NH2-末端区域介导齐聚和与Fis1p的结合，而COOH-末端WD40区域介导与Dnm1p的相互作用。此外，Caf4p和Mdv1p均以Fis1p依赖的方式定位于线粒体。
遗传学上，两者都是MDV1型和CAF4类在线粒体分裂途径中起积极作用。mdv1型Δ细胞因线粒体分裂而严重受损，但残余水平的分裂是由以下因素介导的CAF4类通过观察发现，这种残余裂变活动mdv1型Δ酵母的线粒体形态缺陷较之财务报表1Δ或dnm1Δ酵母。相反，mdv1型Δ咖啡4Δ酵母显示主要是线粒体网络崩溃，与财务报表1Δ和dnm1Δ单元。线粒体的时间推移成像mdv1型Δ细胞确实揭示了核裂变的残余水平mdv1型Δ咖啡4Δ单元。这些结果直接支持了我们的结论，即mdv1型Δ电池与mdv1型Δ咖啡4Δ，财务报表1Δ和dnm1Δ细胞主要是由于裂变速率的差异。Dnm1p在线粒体皮质分布中的拟议作用也可能在一定程度上促成形态学差异(Otsuga等人，1998年). 这个mdv1型Δ突变是甘油生长缺陷的弱抑制剂fzo1型Δ细胞。这个mdv1型Δ咖啡4Δ双突变能更有效地抑制这种表型。基于这些物理相互作用和遗传数据，我们得出结论，Caf4p可能以与Mdv1p相似的方式促进线粒体分裂。
为什么有两种蛋白质在线粒体分裂中表现出相似且部分冗余的作用？这个问题特别有趣，因为咖啡4Δ酵母具有正常的线粒体形态，表明Caf4p的破坏不会导致线粒体裂变的重大损失。第一，CAF4类在尚未测试的条件下，可能在线粒体分裂中发挥更重要的作用。其次，两种介导Fis1p和Dnm1p相互作用的蛋白质的存在将提高细胞精确调节线粒体分裂速率的能力。Caf4p和Mdv1p之间的异型和同型相互作用可能提供额外的调控层。最后，Caf4p可能在另一途径中具有额外功能。先前的双杂交研究表明，Caf4p参与CCR4-NOT复合物，该复合物被认为参与转录和/或mRNA加工的调节(刘等人，2001).
线粒体分裂的修正模型
目前的线粒体裂变模型表明，Mdv1p在裂变途径中作用较晚。一种模型提出了一种两步路径，Fis1p首先以独立于Mdv1p的方式招募Dnm1p。然后，Mdv1p与Fis1p一起在招募后步骤中充当分子适配器，以促进Dnm1p的裂变(Shaw和Nunnari，2002年;Tieu等人，2002年;Osteryoung和Nunnari，2003年). 第二个模型还提出，Mdv1p在Dnm1p招募后起作用，组织活跃的裂变复合体(Cerveny和Jensen，2003年).
我们的研究揭示了Mdv1p和Caf4p在线粒体分裂早期的新作用。Fis1p通过Mdv1p或Caf4p招募Dnm1p到线粒体裂变复合体，后者充当分子适配器。我们的实证表明，Dnm1p招聘mdv1型Δ酵母依赖于Caf4p功能。在缺乏Mdv1p和Caf4p的情况下，Fis1p无法招募Dnm1p。
尽管Mdv1p和Caf4p在裂变途径的早期起作用，但有证据表明，至少Mdv1 p在裂变激活中起到了后续作用，正如之前提出的那样(Shaw和Nunnari，2002年;Tieu等人，2002年;Cerveny和Jensen，2003年). 在咖啡4Δ细胞，Mdv1p招募Dnm1p到裂变复合物中，裂变发生在明显正常的水平。然而，在mdv1型Δ细胞，Caf4p同样能够将Dnm1p募集到裂变复合体中，但线粒体裂变严重受损。因此，Mdv1p和Caf4p可以独立招募Dnm1p，但由Mdv1 p招募的复合体似乎更为活跃。这些观察结果表明，Dnm1p本身的募集不足以发生裂变。事实上，对Dnm1p动力学的研究表明，大多数Dnm1ppuncta不会导致裂变(Lesses-Miller等人，2003年). 我们对Caf4p作为裂变机制的一部分的鉴定澄清了线粒体裂变的早期步骤。未来的研究需要定义裂变所需的Dnm1p补充以外的额外步骤。
材料和方法
培养基和酵母遗传技术
酵母菌株列于表S1中。采用标准遗传技术和酵母培养基。如前所述，制备补充有2%葡萄糖、3%甘油、2%棉子糖或2%半乳糖的SC和YP培养基(Guthrie和Fink，1991年). YJG12和DCY1557在w303背景中。所有其他菌株均为S288C背景。图1:：KanMX6,mdv1：：KanMX6,咖啡馆4:：KanMX6、和dnm1：：KanMX6是从MATa公司删除库（Open Biosystems）。
质粒构建
M9TH盒生成如下。底漆Eg258（见表S3，网址：http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200503148/DC1)和Eg259被用来放大URA3型来自pRS416（Stratagene）。Eg260和Eg4，一个FZO1型使用反向引物扩增TEV/His8来自EG704的模块（pRS414+9XMyc/TEV/His8-FZO1型). 的3′端URA3公司产品与TEV/His的5′端重叠18 bp8产品。这种重叠允许它们退火在一起，并用引物Eg258和Eg4在第二个PCR中扩增。这个URA3公司/TEV/他的8该产品作为EcoRV/SalI片段克隆到pRS403中FZO1型序列），产生EG928。用EG704中的Eg256和Eg260扩增9xMyc/TEV，并融合到URA3型（Eg258/259产品）与Eg256和Eg259混合放大。将所得产物作为EcoRV/EcoRI片段克隆到EG928中，得到EG940（pRS403+9xMyc/TEV/URA3公司/TEV/他的8). EG940转化为pRS403+3xMyc/TEV/URA3公司/TEV/他的8用Xba1消化，得到EG957。
构造的HA标记版本CAF4类和CAF4类碎片，CAF4类序列经PCR扩增结束3Δ基因组DNA（开放生物系统）。首先CAF4类用引物Eg313和Eg314扩增出3′非翻译区（UTR），并将其克隆为KpnI/SalI片段到pRS416中，得到pRS417+CAF4类3英尺UTR。用Eg327和Eg328扩增3XHA，并将其作为SalI/XhoI片段克隆到SalI位点以生成pRS416+3XHA/CAF4类3英尺UTR。这个咖啡四烯酸使用Eg312和Eg317将5′UTR克隆为SacI/SpeI片段，得到pRS416+CAF4类5′UTR/3XHA/3′UTR。全长咖啡四烯酸用Eg316和Eg315扩增并克隆为SpeI/XhoI片段到SpeI/SalI位点，得到EG1041。CAF4类N（残基1–274）和C（残基275–659）分别用Eg316/Eg353和Eg315/Eg352扩增，并克隆为SpeI/XhoI片段，得到EG1045和EG1043。四个独立克隆在残基110处编码谷氨酰胺，在残基111处编码精氨酸。全长CAF4-HA型能够补充咖啡4Δ英寸咖啡4Δmdv1型Δ酵母，表明其具有功能。
构造的HA标记版本MDV1型和MDV1型碎片，MDV1型序列通过PCR扩增结束3Δ基因组DNA。首先MDV1型用引物Eg323和Eg324扩增3′UTR，并将其克隆为SacI/SalI片段，克隆到pRS416中。按照说明添加了3XHA盒式磁带CAF4-HA型，产生质粒pRS416+3XHA-MDV1系列3英尺UTR。这个MDV1型用引物Eg320和Eg322扩增5′UTR，克隆为SacII/SpeI片段，得到pRS416+MDV1型5′UTR/3XHA/3′UTR。全长多维数据集1使用引物Eg109和Eg321进行扩增，并作为SpeI/XhoI片段克隆到SpeI/SalI位点，得到EG1047。MDV1型N（残基1–300）和C（残基301–714）分别用Eg323/Eg326和Eg321/325扩增，并克隆为SpeI/XhoI片段，得到EG1051和EG1049。全长多维数据集1-HA补充了线粒体形态缺陷mdv1型Δ单元。
半乳糖诱导的Caf4p表达载体EG1133（Caf4p-HA）、EG1135（Caf4-HA，残基251-659）和EG1136（Caf4-HA，残基1-250）通过替换CAF4类EG1041、EG1043和EG1045中含有来自p413 GalL的SacI/ClaI GalL启动子片段的5′UTR(Mumberg等人，1994年)包含插入XbaI和EcoRI位点之间的起始密码子。
pRS403+GPD/mito-GFP（EG686）是通过首先从p413GPD中克隆GPD启动子而产生的(Mumberg等人，1995年)作为SacI（钝）/SpeI片段进入pRS403（Stratagene）的SmaI/SpeI位点，生成EG128。接下来，来自pYES-mtGFP的HindIII（钝）/NotI mito-GFP片段(Westermann和Neupert，2000年)插入EG128，用SpeI（钝）/NotI线性化。通过将DsRed亚克隆到EG686的BamHI和NotI位点，用DsRed-取代GFP，生成pRS403+GPD/mito-DsRed（EG823）。利用引物Eg151和Eg154对OM45进行PCR扩增，将其克隆为XhoI/XbaI片段，并将XbaI/BamHI GFP片段克隆到pRS416的XhoI/BamHI位点，得到pRS416+OM45-GFP（EG252）。
酵母菌株构建
安·M9TH公司-FIS1系统通过扩增9XMyc/TEV产生菌株/URA3公司/TEV/他的8来自EG943的盒式磁带（pRS403-9XMyc/TEV/URA3公司/TEV/他的8)使用FIS1系统-靶向引物Eg261和Eg262并转化YJG12。URA3公司+通过PCR筛选转化子以确保正确整合（8个阳性中有2个），并在YPD中培养过夜以允许丢失URA3公司，并镀在5-FOA板上。通过Western blotting筛选菌落表达M9TH-Fis1p（16例阳性中有9例）。该菌株在64%的细胞中表现出野生型形态，在其余细胞中表现为中度缺陷。使用相同的策略生成M三TH公司-FIS1系统来自pRS403-3XMyc/TEV/URA3型/TEV/他的8模板（EG957），用于S288C背景下的后续实验。该菌株（DCY2192）在89%的细胞中显示出野生型形态，在其余细胞中显示轻度缺陷。DCY2192交叉至mdv1型Δ和咖啡4Δ菌株（开放生物系统MATa公司删除库）并形成孢子以生成M三TH公司-FIS1 mdv1型Δ（DCY2302）和M三真实航向-FIS1咖啡馆4Δ（DCY2305）。
fzo1:：HIS5通过转换生成HIS5型(克鲁弗酵母)用FZO1型靶向引物Eg9和Eg10。mito-GFP被整合到吕2Δ0用NarI消化的EG686（pRS403+GPD/mito-GFP）转化位点。mito-DsRed被整合到吕2Δ0用HpaI-消化的EG823转化位点（pRS403+GPD/mito-DsRed）。dnm1Δ：：HIS5通过转换生成HIS5型(S.kluyveri公司)用DNM1（DNM1）-靶向引物Eg57和Eg58。
染色体CAF4类-HTM是通过使用His转换DCY1979生成的8/2电动汽车/9XMyc/HIS5型盒式磁带(Seol等人，1999年)用…放大CAF4类靶向引物Eg284和Eg285。染色体MDV1型-HTM是用同一个用MDV1型靶向引物Eg80和Eg81。两者CAF4类-HTM和MDV1型-HTM功能正常，因为70%CAF4类-HTM公司mdv1型Δ酵母展示传播线粒体网络，95%MDV1型-HTM酵母细胞显示野生型线粒体形态。
DNM1（DNM1）-GFP通过扩增GFP产生/HIS5型来自pKT128(Sheff和Thorn，2004年)带有Eg342和Eg343。将该产物转化为DCY1626（带有mito-DsRed的野生酵母），生成DCY2370。DCY2370被交叉至财务报表1Δ和mdv1型Δ咖啡4Δ菌株产生DCY2404(DNM1（DNM1）-GFP公司财务报表1Δ），DCY2414(DNM1（DNM1）-GFP公司咖啡四烯酸Δ），DCY2417(DNM1（DNM1）-GFP公司mdv1型Δ）和DCY2418(DNM1（DNM1）-GFP公司mdv1型Δ咖啡4Δ).
串联亲和纯化MudPIT
来自2升培养物的颗粒（OD600生长在YPD中的～1.5）基本上按照之前所述的HPM标记双步亲和纯化制备(Graumann等人，2004年)，进行了以下修改。使用真菌蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich），在20 k时清除裂解产物克在室温下用GST-TEV蛋白酶从9E10珠中分离3小时。第二步用40μl Magne-His珠（Promega）进行亲和。如前所述，通过多维色谱结合Deca XP离子阱质谱仪（ThermoElectron）对样品进行蛋白质水解和分析(Mayor等人，2005年). 如前所述，样品从三相毛细管柱的强阳离子交换相逐步释放(Graumann等人，2004年).
免疫沉淀
CAF4类-HA（EG1041），CAF4类-HA残基1–274（EG1043），以及CAF4类-HA残基275–659（EG1045）在菌株DCY1979（野生型）和DCY2305（M型）中表达三TH公司-FIS1咖啡馆4Δ).MDV1型-HA（EG1047），MDV1型-HA残留物1–300（EG1049），以及多维数据集1-HA残基301-714（EG1051）在DCY1979或DCY2302（M）中表达三真实航向-FIS1 mdv1型Δ). 培养物在选择性SD培养基中生长，并在OD时收获600～0.8。20外径600在存在真菌蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich）的情况下，在500μl冰溶缓冲液（50 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，0.1 mM EDTA和0.2%Triton X-100）中用玻璃珠（40 s，使用涡旋混合器，4次）溶解细胞单位。通过5 krpm离心5 min和14 krpm离心15 min来清除裂解液。此时，采集了全部裂解液样品。将400μl澄清的裂解液与20μl 9E10-结合蛋白a–Sepharose珠（Sigma-Aldrich）珠体积混合90分钟。用1ml裂解缓冲液洗涤四次珠。沉淀用100μl SDS缓冲液在95°C下洗脱5分钟。用9E10杂交瘤上清液（抗Myc）或12CA5腹水液（抗HA）进行SDS-PAGE Western blotting。
酵母双杂交分析
pGAD载体转化为PJ69-4α。pGBDU载体转化为PJ69-4a(James等人，1996年). 指示的载体在YPD平板上进行交配，每个载体使用两个转化子（每个组合总共四次交配）。通过SD-leu-ura板的复制电镀选择二倍体。通过复制电镀SD-leu-ura-lys-ade并在30°C下孵育4 d来检测相互作用。
线粒体形态学分析
线粒体靶向GFP（mito-GFP）用于监测线粒体形态。DCY1979（野生型），DCY1945(咖啡4Δ），DCY1984(咖啡4Δmdv1型Δ），DCY2009(财务报表1Δ），DCY2128(mdv1型Δ），DCY2155(mdv1型Δdnm1Δ）和DCY2312(dnm1Δ）培养过夜，1:20稀释到新鲜培养基中，并在30°C下培养4小时。通过调节培养物至3.7%甲醛并在30°C下培养10分钟来固定培养物。用1 ml PBS冲洗细胞4次，并对线粒体形态进行评分。对于咖啡四烯酸过表达研究，质粒p416 GalL/CAF4类-透明质酸（EG1133），p416加仑/CAF4类-HA残基251–659（EG1135）或p416 GalL/CAF4类-HA残基1–250（EG1137）转化为DCY1979。培养物在选择性SRaff中培养过夜，在新鲜YPD或YPGal中稀释1:20，并在30°C下培养3h。采集样品进行西方分析，并按照上述方法固定剩余培养物。
对于latrunculin A处理，过夜YPD培养物在新鲜YPD中以1:20的比例稀释，并培养3小时。然后，在30°C下用200μM latrunculan A或等量的载体（DMSO）处理培养物1小时。然后按照上述方法固定培养物。
对于延时成像，将过夜SGal培养物在新鲜YPGal中稀释为1:20并生长3 h。将细胞造粒，再悬浮在新鲜培养基中，并嵌入含有200μM latrunculin A的1%低熔点琼脂糖中。
旁路抑制试验
将DCY2002和DCY2343产孢并在YPD板上解剖。采集孢子，在30°C的3ml YPD中培养过夜，造粒，并重新悬浮至OD600～1.0英寸YP。在YPD和YP甘油上发现3μl 1:5系列稀释液，并分别在30°C下培养2天和4天，以测定甘油上生长的细胞比例。PCR检测基因型。
差速离心
酵母菌株CAF4类-HTM（DCY2055），CAF4类-HTM公司财务报表1Δ（DCY2094），MDV1型-HTM（DCY2053），以及MDV1型-HTM公司财务报表1Δ（DCY2097）在YPD中生长并在OD时收获600∼1.2. 用酶将100个OD单位的细胞进行球状成形，并在小间隙Dounce均质器中进行溶解（0.6 M山梨醇和10 mM Tris，pH 7.4）。将裂解液以2.9 krpm的速度旋转两次，持续5分钟。将等分的第二上清液保存为总裂解液样品。将第二份上清液以10 krpm的速度旋转10分钟，并将等分上清液保存为细胞液样本。将颗粒重新悬浮，并再次以10 krpm的速度旋转10分钟。最后一份颗粒的等分部分保存为线粒体颗粒。装载相等的细胞当量用于蛋白质印迹分析。总组分和线粒体组分之间的孔蛋白强度差异很可能是由于线粒体组分中的模糊蛋白质较少所致。
成像
使用100×Plan-Apochromat，NA 1.4油浸物镜在显微镜（Axiover 200M；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）上采集图像。使用AxioVision 4.2软件控制的ORCA-ER相机（Hamamatsu）在RT上采集Z堆栈图像（静态图像的间隔在0.1至0.2-μm之间，延时图像的间隔为0.3至0.4-μm）。每隔30秒或40秒采集图像30分钟进行延时实验。使用Axiovision 4.2执行迭代去卷积，并且对于静止图像使用Axiovision 4.2生成最大强度投影，对于延时图像使用图像J生成最大强度投影。中的荧光图像–在Adobe Photoshop CS中覆盖有差异干涉对比图像（设置为50%不透明度）。
免疫荧光
基本上如前所述，对细胞进行免疫荧光处理(Guthrie和Fink，1991年)进行了以下修改。用3.7%甲醛固定培养物15分钟。在15分钟阻断步骤中，吐温20（0.5%）被纳入阻断缓冲液（PBS，1%BSA）中。用9E10杂交瘤上清液和Cy3-偶联抗小鼠二级抗体对细胞进行染色。一次和二次孵育后，用封闭缓冲液清洗5分钟，用含有0.5%吐温20的封闭缓冲液冲洗5分钟，再用封闭缓冲液洗两次5分钟。所有孵育均在室温下进行。GelMount（Biomeda）用作固定培养基以保留荧光。
