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EMBO J。2003年10月15日；22(20): 5551–5560.
数字对象标识：10.1093/emboj/cdg516
预防性维修识别码：PMC213771型
PMID：14532127

单核细胞超乙酰化染色质蛋白HMGB1引导其分泌

蒂齐亚娜·博纳尔迪,1,2 法比奥·塔拉莫,1 保拉·斯卡菲迪,三 丹尼斯·费雷拉,4 安娜丽莎·波尔图,1,5 安吉拉·巴奇,1 安娜·鲁巴特利,4 亚历山德拉·阿格雷斯蒂,1,6和马可·比安奇三，6
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

高迁移率组1蛋白（HMGB1）是一种染色质成分，当坏死细胞泄漏时，会引发炎症。HMGB1也可由活化的单核细胞和巨噬细胞分泌，并作为炎症的晚期介质发挥作用。核蛋白的分泌需要严格控制的迁移计划。我们在这里显示，在所有细胞中，HMGB1活跃地穿梭于细胞核和细胞质之间。脂多糖激活后，单核细胞和巨噬细胞广泛乙酰化HMGB1；此外，休眠巨噬细胞中HMGB1的强制过乙酰化导致其重新定位到胞浆中。细胞溶质HMGB1随后默认浓缩到分泌溶酶体中，并在单核细胞接收到适当的第二个信号时分泌。

关键词：组蛋白/HMGB/炎症/NLS/NES/败血症

介绍

高迁移率族蛋白1（HMGB1）是真核细胞核中高度保守的成分（由Bustin，1999年;Thomas和Travers，2001年;阿格雷斯蒂和比安奇，2003年). HMGB1几乎无处不在，其含量仅为核心组蛋白的10倍，为106每个典型哺乳动物细胞的分子数。它具有三分结构，由两个同源的DNA结合域、HMG盒和天冬氨酸和谷氨酸的C末端域组成。

在大多数细胞中，HMGB1位于细胞核中，作为一种结构蛋白，可以弯曲DNA。DNA弯曲促进由几个转录因子组成的复合物的形成，以及核小体的滑动(Bonaldi等人，2002年). 的表型嗯1敲除小鼠证实了HMGB1作为转录调节器的功能重要性：它们出生后不久死亡，糖皮质激素受体的转录控制出现缺陷(Calogero等人，1999年).

我们最近发现，当细胞膜在坏死过程中失去完整性时，HMGB1被动地从细胞中泄漏出来(斯卡菲迪等., 2002). 细胞外间隙中存在核蛋白是细胞死亡的良好迹象；此外，凋亡细胞即使失去细胞膜的完整性（晚期凋亡或继发性坏死），也会保持HMGB1与染色质的牢固结合，并且不会释放HMGB1。这样，细胞外HMGB1是坏死的可靠指标，也是炎症的直接触发因素(斯卡菲迪等., 2002)以及有受体的细胞的各种反应(安德森等., 2000;德格里斯等., 2001;菲乌萨等., 2002;萨平顿等., 2002).

值得注意的是，HMGB1也可以由单核细胞、发育中的神经元和一些其他类型的细胞分泌（由米勒等2001年b月). 巨噬细胞和单核细胞分泌HMGB1，作为对脂多糖（LPS）、IL-1或TNF激活的延迟反应(王等., 1999)：因此，他们使用HMGB1作为促炎细胞因子。

核蛋白的分泌带来了巨大的挑战。HMGB1缺乏分泌信号肽，并且不穿过ER–高尔基体系统。我们最近发现，单核细胞的激活导致HMGB1积聚到显示分泌溶酶体特征的细胞质小泡中(加德拉等., 2002). 分泌溶酶体为钙2+-调节分泌细胞器，尤其是造血细胞中丰富的分泌细胞器。在造血细胞中，分泌细胞器通过将其内容物动员到外部环境中来响应触发信号，从而参与炎症和免疫反应(布洛特和格里菲斯，2002年). 溶血磷脂酰胆碱（LPC）是磷脂酶A2在炎症部位产生的一种脂质，可触发HMGB1分泌溶酶体的胞吐(加德拉等., 2002).

本研究提供了HMGB1从细胞核转移到分泌溶酶体的分子特征。我们发现在活化的单核细胞中，HMGB1被乙酰化广泛修饰，赖氨酸的两个主要簇对乙酰化和核定位都很重要。由于HMGB1也有两个非经典核输出信号（NES），在大多数细胞中，HMGB1不断地从细胞核穿梭到细胞质，但平衡几乎完全转向核积累。成纤维细胞被迫用脱乙酰酶抑制剂对HMGB1进行超乙酰化，减少其核输入：HMGB1随后被重新定位到细胞质中。在单核细胞中，HMGB1进一步移动，并浓缩到分泌溶酶体中。因此，单核细胞利用核重排机制和（去）乙酰化活性来调节HMGB1的细胞定位，在炎症刺激下将染色质蛋白转换为细胞因子。

结果

双向（2D）电泳可解析与多重乙酰化HMGB1蛋白对应的多个斑点

我们推断，蛋白质在两个不同细胞隔室中的选择性定位必须受到精确控制，并且必须与蛋白质的选择性状态相对应。因此，我们使用2D电泳研究HMGB1可能的翻译后修饰。HMGB1很容易从小牛胸腺中大量纯化；纯化的HMGB1在一维SDS-PAGE中分为两条带，一条主带对应于29 kDa的表观分子量，另一条小带包含ADP-核糖基部分修饰的HMGBI（图1A、 左凝胶，结果未显示）。在二维电泳中，更快的迁移带分解成8到10个不同的点（图1A、 右），具有相似的分子量和沿着pH梯度的规则间距。将17天龄小鼠胚胎的胸腺总提取物加载到双2D凝胶上（图1B） 其中一个被银染，另一个被免疫印迹并用HMGB1抗体检测。考虑到最酸性和最碱性的斑点低于全组织2D印迹的检测限，印迹上检测到的HMGB1斑点模式与纯化HMGB1获得的斑点模式相似。

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图1。HMGB1在胸腺和活化的单核细胞中被多重乙酰化。(A类)从小牛胸腺纯化的HMGB1在一维凝胶（SDS–PAGE，考马斯染色，右图）上出现两条带（箭头）。次要带含有ADP-核糖基HMGB1。对50微克HMGB1的同一样品进行2D凝胶电泳（银染，左图）；来自Bio-Read的2D蛋白质标记与HMGB1一起加载，生成右侧所列分子量的斑点矩阵。(B类)小鼠胸腺中含有许多HMGB1亚型。将来自胸腺总提取物（来自17天大的小鼠胚胎）的约300µg蛋白质装载在双2D凝胶上；顶部显示的凝胶是银染的，而底部的凝胶是印迹的，并用抗HMGB1抗体进行分析。(C)LPS激活人单核细胞高乙酰化HMGB1并将其积聚在细胞质小泡中。从外周血中纯化的单核细胞在有或无LPS的情况下培养过夜。然后固定活化的单核细胞和对照单核细胞的等分试样，并用抗HMGB1抗体（红色）进行免疫染色。HMGB1在非刺激性单核细胞中是核的，而在LPS激活的单核细胞则是核+泡状的。Bar表示7µm。将未经处理的和LPS激活的单核细胞等分试样冻融，并将约400µg总蛋白提取物加载到2D凝胶上，进行印迹，并用抗HMGB1进行免疫检测。请注意活化单核细胞中主要的额外HMGB1斑点。

然后我们验证了HMGB1的替代修饰状态与新分离单核细胞的激活状态相关（图1C） ●●●●。值得注意的是，虽然休眠单核细胞仅显示HMGB1的两种亚型，但LPS激活的单核细胞显示出一个主要的额外HMGB1斑点，但其pI较低。

HMGB1长期以来已知在赖氨酸2和11上乙酰化(斯特纳等., 1979). 事实上，在三种不同的细胞系（3T3、HeLa和HEK）和静止的单核细胞中，我们只发现HMGB1的两种亚型，这与先前的知识一致；然而，组蛋白脱乙酰酶（HDAC）抑制剂曲古抑菌素A（TSA）、丁酸钠和HC-毒素产生了多个HMGB1斑点，与胸腺提取物中观察到的斑点相似（结果未显示）。为了定位翻译后修饰的位点，我们从最丰富的可用材料开始，即从胸腺中纯化的HMGB1。我们从考马斯染色2D凝胶中切除了四个最丰富的斑点，并对其进行胰蛋白酶消化和质谱（MS）。肽之间的质量差异通常为42 Da，或该值的倍数，这与乙酰基部分相对应。我们没有发现甲基化、磷酸化或糖基化的证据。高达10种HMGB1亚型的存在表明，至少有同样多的赖氨酸会被乙酰化。HMGB1包含43个赖氨酸，长度仅214个氨基酸：为了鉴定乙酰化赖氨酸：我们使用不同的位点特异性蛋白水解酶试剂[Asp-N、溴化氰（CNBr）、胰蛋白酶、Glu-C、Asp-C]，单独或联合使用，并通过MALDI分析肽（图2A） ●●●●。将一个或多个乙酰化分配给蛋白质的大片段，然后它们的位置逐渐限制在较小的片段内。在图中提供的示例中2B、 HMGB1首先用天冬氨酸-N消化，消化后的非乙酰化片段在复杂的质谱数据模式中得到鉴定。对应于非乙酰化肽质量加上42或42的n倍的峰被假定为该特定肽的1对n乙酰化。然后，用CNBr进一步切割相同肽的等分，得到较小的片段。重复分配程序，直到乙酰化可以归属于特定的赖氨酸。

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图2。多重修饰HMGB1的2D/MALDI-MS分析策略。(A类)从2D凝胶中切下斑点，用MALDI-TOF进行蛋白质水解和分析。混合物中的每个肽都有一个质量；预测的肽对应的质量生物信息学被选为‘锚’，我们在复谱中搜索对应于锚质量加上42倍（乙酰基的分子量）的其他峰。对两种肽进行了分析；对所有肽重复该程序。我们还挖掘了光谱，寻找磷酸化、甲基化和糖基化的证据，但没有发现任何证据。(B类)为在HMGB1中指定乙酰化位点而开发的多步骤消化策略的示例。用蛋白酶Asp-N在凝胶中消化2D凝胶中的斑点。通过MALDI-TOF分析一份等分试样：箭头确定对应于未修饰片段的峰。然后我们寻找未修饰片段的分子量加上42倍的峰值。因此，确定了每个片段上乙酰基部分的最大数目。用CNBr进一步消化另一等分的Asp-N消化HMGB1，并对产物进行类似分析。我们继续进行进一步的裂解，直到我们能够获得可识别的片段，其中所有赖氨酸都被乙酰化，或者没有乙酰化。

在分析了大量消化产物（未显示）后，我们确定了17种乙酰化赖氨酸，并排除了20种赖氨酸的修饰；只有6种赖氨酸保持不变（图三A） ●●●●。如果17种赖氨酸中的每一种都可以独立地乙酰化，则可能存在2种17HMGB1的（>10万）分子物种；然而，两组赖氨酸（图中红色三A） 似乎伴随着乙酰化。

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图3。HMGB1有两个具有NLS活性的片段和两个NES。(A类)HMGB1序列乙酰化位点的最终归属。标记为红色的赖氨酸（43种中有8种）经常被修改；蓝色赖氨酸从未被修饰（20/43）；以低频率修饰绿色（9/43）中的赖氨酸；紫色（6/43）中的赖氨酸没有特征，因为在光谱中没有发现含有赖氨酸的肽。HMG框以蓝色突出显示，酸性尾部以红色突出显示(B类)具有NLS活性的肽的鉴定。HMGB1的氨基酸27–43与二分NLS完全匹配。这种假定的二分NLS与GFP融合并在小鼠成纤维细胞中表达：虽然NLS1–GFP融合主要是核融合，但GFP本身是广泛扩散的。HMGB1–GFP的赖氨酸（K）27、28和29突变为丙氨酸（KKK→AAA-1）不会改变核定位。HMGB1的序列片段随后被导入PredictNLS数据库：178–184个片段与19个蛋白质匹配，其中17个为核蛋白。这是潜在NLS的良好迹象，我们将其命名为NLS2。其与GFP的融合（NLS2–GFP）显示出主要的核分布。HMGB1-GFP的赖氨酸181、182和183突变为丙氨酸（KKK→AAA-2）不会改变荧光蛋白的核定位。将两个簇中的所有六种赖氨酸突变为丙氨酸（2×KKK→AAA）或谷氨酰胺作为乙酰赖氨酸（2×KKK）的模拟物→QQQ）引起部分细胞溶质定位。六种赖氨酸突变为精氨酸（2×KKK→RRR）没有改变核定位。Bar表示10µm。(C)HMGB1从细胞核迅速扩散到细胞质。通过融合表达HMGB1的HeLa细胞（人类）和嗯1–/–小鼠胚胎成纤维细胞。人细胞角蛋白和HMGB1分别被染色为红色和绿色；细胞核被Hoechst 33342染成蓝色。人细胞角蛋白染色的细胞和两个细胞核被认为是异核体，其中一个细胞核具有小鼠细胞特有的明亮的Hoechst阳性异色斑点。最初，只有异核体中的人类细胞核含有HMGB1(t吨=0）。37°C孵育4小时后(t吨=4 h），HMGB1从人细胞核到小鼠细胞核重新平衡。(D类)HMGB1通过被动和主动运输离开核。瘦霉素B显著减少但不消除HMGB1在人和小鼠异核体细胞核之间的转移。对于每个处理（钩端霉素和对照），评估了150个异核体；50%的水平相当于完全平衡。(电子)两个HMG盒都与CRM1 exportin直接交互。将标记的CRM1蛋白与固定在谷胱甘肽-Sepharose或BSA、无尾HMGB1（BoxA+B）或与Sepharose共价连接的单个盒子上的GST-NS2珠混合。对代表输入材料（In）、第四次洗涤（W4）、五次洗涤后仍与珠子结合的材料（结合，B）和未结合材料（输出，O）的等分试样进行电泳和自动射线照相。CRM1与除阴性对照BSA外的所有珠子结合。在结合缓冲液中加入0.4µM钩体霉素B可防止CRM1同时与GST–NS2和HMG盒中的NES结合（通道18–23）。

HMGB1有一组复杂的定位信号

对第一个乙酰化簇的检查表明，残基27和43之间的赖氨酸（图三B） 可能代表经典的二分核定位信号（NLS）(科科尔等., 2001). 我们将HMGB1的氨基酸27-43融合到绿色荧光蛋白（GFP）的N末端：未融合的GFP分布在整个细胞中，而融合蛋白（NLS1-GFP）的约90%的荧光集中在细胞核中。同样，该肽将β-半乳糖苷酶驱动至细胞核（数据未显示）。因此，氨基酸27–43代表一种功能性NLS。然后，我们将HMGB1–GFP完全融合的赖氨酸27–29突变为丙氨酸：令人惊讶的是，核定位没有受到影响（KKK→AAA-1；图三B） ●●●●。对HMGB1序列的目视检查没有发现任何其他规范NLS，但PredictNLS程序提供了一组经过实验验证的硅生成NLS中的附加值(科科尔等., 2001)，将178–184个氨基酸与几个核蛋白匹配（图三B） ●●●●。当与GFP（NLS2–GFP）的N末端融合时，氨基酸178–184显示出明显的NLS活性。再次，当HMGB1–GFP融合的赖氨酸181、182、183转变为丙氨酸（KKK→AAA-2；图三B） ，融合蛋白仍为核。HMGB1–GFP的双突变体，其中两个赖氨酸簇都被改变为丙氨酸或谷氨酰胺，在细胞质中明显存在（图三B、 2×KKK→AAA和2×KKK→而赖氨酸转变为精氨酸并不影响蛋白质的核定位（图三B、 2×KKK→RRR）。然而，值得注意的是，即使是双HMGB1突变体在细胞核中的数量也高于细胞质中的数量。显然，HMGB1具有几个有助于核定位的区域，尽管不是作为分离的肽，而是仅在整个蛋白质的背景下，如先前对HMGB2所示(白川方明等., 1997).

HMGB1通过被动和主动运输迁移到细胞质

我们注意到从小牛胸腺纯化的HMGB1中乙酰化簇与在GFP融合体上具有NLS活性的片段一致。赖氨酸到谷氨酰胺双突变体的部分细胞质定位表明，细胞可能通过乙酰化这些赖氨酸将HMGB1从细胞核中排除，从而中和它们的基本电荷，使它们无法发挥NLS的功能。然而，这种机制可能只阻止HMGB1从细胞质向细胞核的运动，而不能促进相反的运动，即从细胞核向细胞质的运动。为了验证HMGB1也可以沿出口方向穿过核膜，我们融合了嗯1–/–小鼠胚胎成纤维细胞(Calogero等人，1999年)HMGB1阳性的人HeLa细胞（图三C） ●●●●。具有人细胞质（用抗人细胞角蛋白抗体染成红色）和小鼠细胞核（通过明亮的Hoechst阳性异色斑点识别）的细胞是异核体。融合后不久，异核体中的小鼠细胞核几乎没有HMGB1，但在37°C下4小时（存在环己酰亚胺以抑制蛋白质合成）通常足以平衡人类和小鼠细胞核之间的HMGB1（绿色）。然后我们用钩端霉素B处理异核体，钩端霉素B是一种涉及CRM1出口蛋白的活性输出抑制剂：HMGB1在人和小鼠细胞核之间的重新平衡被强烈降低（图三D） ●●●●。为了证明HMGB1具有依赖于CRM1的核输出信号（NES），我们在网织红细胞提取物中合成了标记的CRM1，并将其传递给含有NS2（强NES作为阳性对照；Askjaer等人，1999年)、BSA（阴性对照）、无尾HMGB1（方框a+B）、方框a或方框B（图三E） 。CRM1绑定到两个HMG框，表示每个框都包含一个NES。当400 nM钩体霉素添加到含有CRM1的网织红细胞提取物中时，标记的蛋白质没有与NS2或同时含有NES的BoxA+B结合。HMGB1是一种小蛋白（摩尔重量，25 kDa），它可能通过简单的扩散穿过核孔而迁移到核内或从核内迁移：为了测试被动扩散，我们在4°C下培养HeLa细胞4小时，这种情况阻碍了主动的、GTP驱动的核输入/输出。冷孵育后，HMGB1的重要部分定位在细胞质中（未显示）。

HMGB1的乙酰化决定其重新定位到成纤维细胞的细胞质和单核细胞的囊泡

这些结果表明HMGB1可以通过被动和主动两种机制在两个方向上穿越核膜。然而，所有培养细胞和静止单核细胞的细胞核中都含有绝大多数HMGB1，这表明在基线条件下，输入比输出更有效。为了证实乙酰化可以通过抑制核输入来改变平衡，我们用TSA处理表达HMGB1–GFP的小鼠成纤维细胞1小时：大量荧光蛋白被重新定位到细胞质中（图4A） ●●●●。2×KKK→RRR突变体不能在六种赖氨酸上乙酰化，对TSA治疗没有反应，仍然是细胞核。

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图4。TSA处理后HMGB1移到细胞质中。(A类)小鼠成纤维细胞暴露于10 ng/ml TSA中1 h，导致HMGB1–GFP显著迁移至细胞质；没有可识别的小泡。6种赖氨酸突变为精氨酸（2×KKK→RRR）可阻止HMGB1-GFP的细胞质积累，即使在TSA处理后也是如此。(B类)U937.12细胞在添加或不添加LPS或钩端霉素B的情况下培养3h。然后固定细胞并用HMGB1抗体（红色）进行免疫染色。HMGB1在静止的U937.12细胞中是唯一的核，而在LPS激活的细胞中主要是囊泡。瘦霉素阻碍核输出，从而导致囊泡积聚。休眠U937.12细胞的细胞质和小泡中含有大量HMGB1，这些细胞在4°C下孵育3小时，以促进低乙酰化HMGB1向细胞质的被动扩散，并在37°C下重新加热5分钟，以恢复主动运输（“冷却和复温”）。同样，当U937.12细胞进入M期时，HMGB1的重要部分包含在细胞质和囊泡中，而在核膜破裂（“中期”）后，HMGB2游离低乙酰化进入细胞质。(C)小鼠腹腔巨噬细胞的细胞核中含有HMGB1，但经LPS刺激后，HMGB1的一部分转移到细胞质小泡。用TSA孵育，但在没有LPS的情况下，也会导致HMGB1转移到囊泡中。

为了评估乙酰化在单核细胞中的作用，我们使用了U937细胞系和新分离的小鼠腹腔巨噬细胞。不同亚克隆的U937细胞在细胞因子分泌方面表现不同；因此，我们选择了一个定义明确的亚克隆12[-]，该亚克隆具有良好的质膜分子标记和功能性反应特征(博沃伦塔等., 1999). 静止的U937.12细胞的细胞核中含有HMGB1，而LPS激活的细胞在1小时内将大量蛋白质重新分配到细胞质小泡中，有时会完全清空细胞核（图4B） ●●●●。HMGB1在U937.12细胞中的重新定位未被环己酰亚胺阻断（结果未显示），但对钩端霉素B敏感。

HMGB1也在LPS刺激的小鼠巨噬细胞中重新定位（图4C） ●●●●。巨噬细胞中含有HMGB1的小泡的独特形态（比U937.12细胞中的小泡少且大得多）使我们能够测试HMGB1是否存在过乙酰化就其本身而言可以将HMGB1从细胞核转向分泌。用10 ng/ml TSA处理1 h的静止巨噬细胞与用LPS激活的巨噬细胞似乎没有区别。

然后我们测试了过乙酰化是否是积累到分泌溶酶体中所必需的（图4B） ●●●●。我们在4°C下培养U937.12细胞数小时，导致大量HMGB1被动扩散到细胞质，然后将温度升高回37°C。在5分钟内，一群小泡对HMGB1呈阳性反应。同样，HMGB1在有丝分裂期间通过核膜的破坏释放到细胞质中(法尔乔拉等., 1997)也与小泡有关。我们的结论是，分泌溶酶体可以积累HMGB1作为默认活性，并且只要HMGB1在胞浆中可被它们获得，它们就会积累HMGB1。

HMGB1通过PCAF、CBP和p300乙酰化

我们还研究了HMGB1是否能被最丰富的组蛋白乙酰化酶乙酰化。在体外，谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）-PCAF融合乙酰化细菌产生HMGB1的效率约为重组组蛋白H3和H4的50%，用作阳性对照（图5A） ●●●●。单个盒子，boxA和boxB，都被乙酰化了。溶菌酶为阴性对照，未乙酰化。重组CBP和p300 HAT结构域也获得了类似的结果（数据未显示）。免疫沉淀PCAF、CBP和p300也乙酰化HMGB1（图5B和结果未显示）。有趣的是，用LPS刺激的U937细胞显示大量H3乙酰化显著增加（图5C） 以及体积H4乙酰化的少量但显著增加（2h后约20%；未显示结果）。这些结果表明，单核细胞通过改变乙酰化/去乙酰化平衡而对激活作出反应，从而有利于乙酰化，并表明HMGB1乙酰化可能是更普遍的乙酰化波的一部分。

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图5。HMGB1由组蛋白乙酰转移酶乙酰化。(A类)将所示纯化蛋白与谷胱甘肽–Sepharose结合的GST–PCAF（+）或对照谷胱甘蛋白–Sepharo（-）孵育，以及[14C] 乙酰辅酶A。培养后，将上清液中的反应产物从珠子中分离出来并进行电泳。凝胶经考马斯染色（左）、干燥和放射自显影（右）。(B类)从小鼠3T3成纤维细胞免疫沉淀天然PCAF，并与重组组蛋白H3和H4、重组全长HMGB1及其无尾衍生物HMGB1ΔC孵育。[14C] 将乙酰辅酶A添加到通道2、4和6的反应混合物中。(C)将U937细胞与LPS孵育指定的时间，并通过用抗乙酰H3抗体进行蛋白质印迹来测定细胞提取物。为了进行比较，还显示了与TSA孵育后H3乙酰化的程度。直方图显示了三个独立实验的平均误差和标准误差（LPS治疗后的差异显著，P（P）< 0.05).

讨论

HMGB1在核蛋白中是独一无二的，因为它可以由髓系起源的细胞（将其用作促炎细胞因子）和发育的神经细胞（其作用还不太清楚）分泌(米勒等2001年b月). 本研究确定HMGB1的亚细胞位置取决于乙酰化。这基于以下证据。（i） HMGB1在单核细胞中被翻译后修饰。修饰HMGB1从单核细胞的迁移模式与多重赖氨酸乙酰化兼容。从小牛胸腺中纯化的HMGB1确实是多重乙酰化的。（ii）脱乙酰酶抑制剂导致HMGB1的一部分从细胞核重新定位到细胞质。六种赖氨酸突变为谷氨酰胺，类似乙酰化赖氨酸，因为它没有正电荷，也会导致HMGB1的一部分从细胞核重新定位到细胞质。将相同的六种赖氨酸突变为精氨酸（不能乙酰化），使HMGB1定位对脱乙酰酶抑制剂无反应。（iii）HMGB1一旦进入单核细胞的细胞质，就会默认地积聚在进行调节性胞吐的分泌溶酶体中(加德拉等., 2002). 因此，分泌间接依赖于蛋白质乙酰化。

我们的数据表明，HMGB1在大多数细胞类型中的主要核定位是由于HMGB1分子通过能量驱动的转运过程在胞浆和细胞核之间不断穿梭的稳态结果。早期的报告表明HMGB1的可变比例位于细胞质中(巴斯丁和内哈特，1979年)：这种观察可能是由于细胞的冷却，这种情况阻碍了能量驱动的传输。

以前已经描述过通过乙酰化对转录因子HNF4和CTIA的细胞核与细胞质蛋白定位的调节(苏托格鲁等., 2000;斯皮里亚纳基斯等., 2000); 然而，在这些情况下，赖氨酸乙酰化促进核积累，这一过程似乎与NES功能和蛋白质输出机制有关。最近，研究表明，病毒蛋白E1A的NLS乙酰化导致其细胞质积聚(麦迪逊等., 2002). 除了规模之外，我们描述的过程是相似的：E1A的一小部分在单个赖氨酸上乙酰化，而每个细胞约有100万HMGB1分子在单核细胞中被多重乙酰化。

单核细胞必须具有特定的能力，能够在炎症刺激下大量乙酰化染色质成分，如HMGB1。图6总结了迄今为止收集到的信息。在单核细胞中，促炎信号与表面受体的结合激活了许多信号通路，包括通过钙调素和NFAT/钙调神经磷酸酶、NF-κB和所有MAP激酶的钙信号。这些信号通路必须直接影响负责核蛋白乙酰化/脱乙酰化的酶，而不是通过特定基因的表达间接影响，因为单核细胞的环己酰亚胺处理不能阻止组蛋白乙酰化或HMGB1重定位。当HAT和HDAC之间的平衡偏向乙酰化时，由于许多正电荷丢失，核进口减少；因此，HMGB1的很大一部分一旦通过其NES和CRM1出口的作用被出口，就无法重新进入核。一旦HMGB1是胞质的，其积累到囊泡中可能只需要存在特定的细胞器，即分泌溶酶体。这些在造血细胞和黑素细胞中丰富，但在其他类型的细胞中不丰富(布洛特和格里菲斯，2002年). 发育中的神经元可以分泌HMGB1，但囊泡中没有明显的蓄积：它们是如何分泌HMGBI的尚不清楚。

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图6。专业炎症细胞HMGB1分泌的控制。在所有细胞中，包括静息炎症细胞中，HMGB1在细胞核和细胞质之间穿梭；核输入是活跃的，蛋白质通过被动扩散和CRM1介导的主动输出迁移回细胞质。当HMGB1乙酰化不足时，核输入速率超过再扩散加输出速率，蛋白质主要或仅为核。炎症细胞通过IL-1β、TNF-α、LPS或HMGB1自身与自身受体结合而激活后，NF-κB和MAP激酶（MAPK）通路被激活。磷酸化MAPK迁移到细胞核，在那里它们直接或通过衔接蛋白激活组蛋白乙酰化酶或抑制去乙酰化酶。这反过来促进HMGB1的乙酰化。输出的乙酰基-HMGB1不能返回核。髓样细胞配有分泌性溶酶体，这是一种在适当刺激下可以分泌的溶酶体类型，可能通过溶酶体膜中嵌入的特定转运体积累IL-1β或HMGB1。当LPC（一种炎性脂质）与其自身受体结合后，携带HMGB1的分泌性溶酶体与质膜融合并分泌其货物。

根据我们的解释，专业炎症细胞将一种古老的非特异性坏死信号重新发展为真正的细胞因子。这不需要进行大规模的重组，因为HMGB1在所有细胞的细胞核和细胞质之间穿梭，可以被核乙酰转移酶乙酰化，造血细胞中存在分泌性溶酶体，并用于分泌其他无铅细胞因子，如IL-1β和IL-18(安德烈等., 1999;加德拉等., 2000). 唯一可能的创新是大规模的染色质乙酰化反应。被动HMGB1释放和主动HMGB1分泌之间的分子模拟并不完美，然而：HMGB1高度乙酰化以分泌，而被动释放的HMGB1则不是。染色质蛋白HMGB1的重复改造，首先作为坏死信号，然后作为炎症细胞因子，其本身是显著的；潜在地，它还涉及足够的翻译后修饰用于治疗干预。例如，在脓毒症期间，可能以乙酰化过程本身为目标来阻止单核细胞/巨噬细胞有害的HMGB1分泌(王等., 1999)或关节炎(普勒特斯等., 2003;谷口等., 2003).

材料和方法

蛋白质表达和纯化

按所述纯化细菌产生的全长HMGB1及其片段(米勒等2001年). HMGB1ΔC是一种缺少酸性尾部的截断(博纳尔迪等., 2002). 小牛胸腺HMGB1根据J.Bernués（CSIC，巴塞罗那）善意提供的方案进行纯化。简单地说，去除脂肪和结缔组织后，将胸腺切碎在缓冲液1中（0.14 M NaCl，0.5 mM EDTA，0.1 mM PMSF）。匀浆经过三次5%PCA提取；将离心后收集的上清液合并并用TCA（18%终浓度）澄清。丙酮–HCl（400:1 v/v）和丙酮单独的分馏沉淀消除组蛋白H1。然后将溶解在pH 9.0的硼酸盐缓冲液中的沉积物在CM-Sephadex C25柱上通过一次或两次（根据样品纯度），并用0.11到0.2 M的NaCl梯度洗脱。

在本文中，根据Allfrey及其同事对HMGB1中的残留物进行了编号(斯特纳等., 1979)：成熟HMGB1的第一个氨基酸是甘氨酸，因为该基因编码的第一个蛋氨酸在合成后被裂解。

质粒

表达HMGB1-GFP的质粒pEGFP-HMGB1(Scaffidi等人，2002年)以HMG-GFPdir 5′-ATCCTGagACAT gggCAAAggAgATCC-3′和HMG-GFPrev 5′-ggCCCgcGGTTCCAT CATCATCATCATCTTCTTTC-3′为外引物，以六对内诱变引物（粗体替换）为模板，在多步PCR诱变中生成NLS1和NLS2的突变体：NLS1KQdir 5’-gAg gAgCACCAgCAgCAgCACCCggATg-3′和NLS1KQ修订版5′-CATCCgggTgCTgCTgCTggTggTCCTC-3′；NLS1KRdir 5′-CAC（NLS1KRdir 5′-CCA）阿格阿格CACCggATgCTTCTgTC-3′和NLS1KRrev 5′-gTgCCTCCTCCT公司gtgCTCCTCCCgGCAg-3′；NLS1KAdir 5′-gAgAgCACgCggCggCgCACCggATgC-3′和NLS1KArev 5′-gCATCCggTgCgCCgCCgCgTgCTCCTC-3′；NLS2KQdir 5′-AgCCAgCAACAgAAggAAgAgAAgACgAg-3′和NLS2KQrev 5′-CTTCTgTTgCTggCTCTTCTC AgCCTTgAC-3′；NLS2KRdir 5′-AgCAggAgAAgg公司AAggAAgAgAAg ACgACgAg-3′和NLS2KRrev 5′-CTTCCTTCTCCT公司gCTCTTCTCA gCCTTgAC-3′；NLS2KAdir 5′-AgCgCggCAgCgAAggAAgAggAAg ACgAC-3′和NLS2KArev 5′-CgCTgCCgC公司gCTCTCTCAgCCTTg AC-3′。然后将最终PCR产物克隆到pEGFP-HMGB1中Xho公司我和囊II获得突变质粒。

我们通过克隆NLS1-GFP和NLS2-GFP之间的序列，生成了NLS1-GPP融合的结构Xho公司我/囊pEGFP-N1载体两个盒的II位点，通过退火寡核苷酸对NLS1dir 5′-TCTACTCgAgACATGAAgAAgAAgAAg CACCCggATgCTTCAAC TTCTCAgAgTTCCAAgCCgCCgCggCTAA-3′和NLS1rev 5′-TT AgCCgCgCTTCTTggAgAACTGAgAAcTgAgAAgACAgAAgATgAAgCATCCgg gTgTCTCgAgTAgA-3′；NLS2dir 5′-TCTACTCgAg ACATGAAg AgCAAgAAAg AAAAAg-AAgAACCgCggCTCA-3′和NLS2rev 5′-TgAgCCgCgTTCTTTCTTgCTCTTAgTCTCgAgAg AgTAgA-3′。

所有结构均通过测序进行验证。

二维凝胶电泳

将约50µg纯化HMGB1或250µg总细胞蛋白添加到350µl含有8 M尿素、2%CHAPS、20 mM二硫代赤藓醇、0.8%IPG缓冲液[载体两性细胞，pH 3–10非线性（NL）或pH 4–7线性（l）]的复水缓冲液中。将样品涂敷在18 cm聚丙烯酰胺（PA）凝胶条上（pH值范围3–10 NL，或pH值4–7 L）。IPGphor（法玛西亚生物技术公司）的等电聚焦（IEF）在75 000–90 000伏特时停止。使用Protean II设备（Bio-Rad）进行二维运行。IEF后，首先将板条浸泡在平衡缓冲液中（EB；6 M尿素，3%十二烷基硫酸钠，375 mM Tris pH 8.6，30%甘油，2%DTE），然后浸泡在含有3%碘乙酰胺和微量溴酚蓝的EB中。然后将试纸条涂在10–12%的PA凝胶上。凝胶在90 V下运行约16 h，然后在25 mM Tris pH 7.5、0.192 M甘氨酸、20%甲醇中进行银染或转移到硝化纤维素膜（ECL、Amersham）上。我们使用ImageMaster 2D软件从斑点在凝胶中的位置计算其pI，并估计与定义的ΔpI相对应的特定修饰的数量。

质谱法

从用胶体考马斯染色的2D凝胶中去除分离的蛋白质点，并按所述进行还原和烷基化(舍夫琴科等., 1996). 然后我们进行了连续的蛋白水解或化学裂解。特别是，在50 mM NH中进行胰蛋白酶、天冬氨酸-N、谷氨酸-C消化4HCO公司三根据切割效率，在37°C下缓冲pH 8.0，摇晃3小时至过夜。化学裂解（Asp-C）是通过在56°C的2%甲酸中培养斑点过夜来实现的。将PVDF膜上的斑点在70%三氟乙酸中的CNBr存在下在黑暗中培养1小时。使用干滴技术和α-氰基-4-羟基肉桂酸或芥子酸作为基质，将1微升消化产物加载到MALDI靶上。

MALDI-TOF质量测量在Voyager-DE STR飞行时间（TOF）质谱仪（马萨诸塞州弗雷明翰应用生物系统公司）上进行，该质谱仪以延迟提取和反射模式运行。通过Data Explorer软件处理内部校准光谱。

细胞培养和转染

小鼠成纤维细胞和HeLa细胞在添加了10%胎牛血清（Gibco）、100 IU/ml青霉素和100µg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）中培养，加入5%CO2增湿的大气。用FuGene（Roche）转染HeLa细胞和小鼠成纤维细胞。要表达荧光蛋白，105细胞被置于35mm培养皿中的盖玻片上，并瞬时转染1µg合适的质粒。转染24小时后观察细胞。转染后约24小时，在固定和成像之前，用10 ng/ml曲古抑菌素A（TSA；Sigma）处理成纤维细胞1小时。由M.Alfano和G.Poli（米兰HSR）善意提供的U937原发性前列腺癌细胞亚克隆12[-]在添加10%FCS的RPMI培养基（Gibco）中生长，我-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100µg/ml链霉素，暴露于0.1µM维生素D3（Roche）中3天以促进CD14表达，并用100 ng/ml LPS（Sigma L4391）或10 ng/ml TSA刺激1小时。通过腹腔灌洗回收的小鼠巨噬细胞和从外周血纯化的人单核细胞，维持在如上所述补充的RPMI培养基中，并用100 ng/ml LPS激活。

异核体分析

HeLa细胞被镀在六孔培养皿中的玻璃盖玻片上（10万个细胞/皿）。16小时后，200000嗯1–/–将小鼠成纤维细胞贴在相同的盖玻片上。在100µg/ml环己酰亚胺存在下培养3 h后，用PBS清洗细胞，并用100µl预加热的50%PEG-6000在PBS中处理1 min。用PBS冲洗三次后，用含有100µ/ml环己酰亚胺的DMEM培养细胞4 h，然后用4%多聚甲醛（PFA）固定。使用抗人细胞角蛋白（Santa Cruz）和抗HMGB1抗体进行免疫荧光，通过Hoechst染色观察染色质。如有指示，将150 nM钩体霉素B（维也纳诺华市芭芭拉·沃尔夫赠送的一种礼物）与环己酰亚胺一起添加到培养基中。

为了测试HMGB1的被动扩散，用100µg/ml环己酰亚胺在37°C下预处理HeLa细胞30分钟，在4°C下孵育4小时，用4%PFA固定，并用抗HMGB1抗体染色。

使用CRM1进行下拉分析

CRM1蛋白是在体外转录-按照制造商的协议，使用pSGCRM1质粒作为模板，用TnT耦合网织红细胞裂解系统（Promega）翻译(Askjaer等人，1999年). 刚做的[35S] Met标记的CRM1（7µl）在15µl RAN缓冲液（50 mM Tris–HCl pH 7.5，200 mM NaCl，2 mM MgCl2，10%甘油），5µl 6×CRM1缓冲液[20 mM HEPES–KOH pH 7.5，80 mM CH三烹饪，4 mM Mg（CH三首席运营官）2，250 mM蔗糖，2.5 mM DTT]，1 mg/ml BSA，400 nM钩霉素B(Askjaer等人，1999年)，BSA，重组无尾HMGB1（在Bonaldi等人，2002年)、方框A或方框B。GST–NS2与谷胱甘肽–Sepharose（Amersham）偶联，其他蛋白质与活化的Sepharose-CH（Amersham）共价交联。在4°C下，在旋转轮上培养1小时。将珠粒离心，将上清液在Savant中干燥。然后在4°C下用50 vol含有9%甘油、5 mM MgCl的PBS清洗珠子五次2和1%NP-40。然后将珠在10µl SDS-PAGE加载缓冲液中煮沸，并将其与干燥上清液（输出）、第四次洗涤（W4）和等量输入一起加载到8%SDS-PA凝胶上，作为参考。然后将凝胶在尼龙滤纸上吸墨，并暴露在X射线胶片上以检测标记的CRM1。

免疫荧光和GFP成像

在LabTek II培养箱（Nalgene）中培养的细胞直接固定在PHEM缓冲液中3.7%PFA中（36.8 g/l PIPES，13 g/l HEPES，7.6 g/l EGTA，1.99 g/l MgSO）4，在室温下用KOH缓冲至pH 7.0）10分钟。固定后，用PBS清洗细胞，并在4°C下用含300 mM蔗糖和0.2%Triton X-100的基于HEPES的渗透缓冲液培养3分钟。随后在封闭溶液（BlS；PBS中0.2%BSA）中培养15分钟。然后将初级抗体在BlS中稀释至最终浓度，并在室温下延长孵育1 h。用BlS冲洗三次后，用BlS中的二级抗体培养细胞1小时，用BlS冲洗三次，然后用含有0.5µg/ml Hoechst的PBS培养细胞。多克隆兔抗HMGB1抗体购自BD PharMinen（加利福尼亚州托里松树），并以1:1600的稀释度使用。与Alexa Fluor 488或594（工作稀释度1:1000）偶联的羊抗兔IgG（H+L）多克隆抗体购自Molecular Probes（Eugene，or）。

表达HMGB1–GFP及其衍生物和NLS–GFP融合的细胞按照上述方法进行PFA固定，然后在含有Hoechst 33342的PBS中培养以染色细胞核。在DeltaVision恢复显微镜系统（Applied Precision，Issaquah，WA）上使用Olympus 60×或100×1.4NA Plan Apo油浸物镜对细胞进行成像，该系统围绕配备汞弧照明的OlympusIX70显微镜构建。过滤器来自Chroma Technology Corp.（Brattleboro，VT）Hoechst 33342激发360/40，发射457/50；Alexa 488或GFP激发490/20、发射528/38；AlexaFluor 594，励磁555/30，发射617/73。使用Coolsnap_Hq/ICX285 CCD相机（Photometrix，Tucson，AZ）采集40个间隔0.4µm的光学截面，并使用SoftWoRx 2.50软件包（Applied Precision）中的约束迭代算法，使用10次迭代和标准参数进行解卷。每幅图像测量512×512像素，有效像素大小为106 nm（60×）或63 nm（100×）。

体外和体内乙酰化试验

在HAT缓冲液（50 mM Tris–HCl pH 8.0，10%甘油v/v，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，0.1 mM-PMSF，10 mM丁酸钠）中使用0.1–0.2 mg/ml底物蛋白，18 mM[14C] 乙酰辅酶A（55 mCi/mmol；Amersham Pharmacia Biotech）和～20 ng/ml GST–PCAF和GST–CBP融合蛋白。反应在37℃下进行20分钟，然后在4℃下进行10分钟。在1000℃下通过离心将珠子从基质中分离出来克将上清液直接与SDS–PAGE加载缓冲液混合，煮沸并加载在10%的tricine–PAGE上。凝胶用考马斯染色，然后干燥并放射自显影。用个人密度计IS（分子动力学）扫描薄膜，并用ImageQuant软件定量条带。

使用针对PCAF、CBP和p300（圣克鲁斯生物技术）的兔抗体特异性免疫沉淀HAT。首先用蛋白A–Sepharose孵育3小时，预处理来自3T3提取物的约200µg总蛋白，然后用抗体在4°C孵育过夜（1:100稀释，相当于～1.5µg Ig）在300µl RIPA缓冲液中（10 mM Tris–HCl pH 8.0，1%Triton，0.1%SDS，0.1%脱氧胆酸钠，140 mM NaCl，1 mM DTT，1 mM PMSF，1 m M EDTA，60µg/ml蛋白酶抑制剂混合物）。加入20µl蛋白质A–Sepharose浆液（50%珠粒在RIPA缓冲液中）；将混合物在4°C下在旋转轮上培养3小时；然后将珠离心并在RIPA缓冲液中洗涤五次，同时用丙酮沉淀上清液。将等分的珠子（IP样品）与上清液（非IP样品）一起加载到8%的SDS-PAGE凝胶上并输入，以检查免疫沉淀的效率。将与蛋白A–Sepharose连接的免疫沉淀HAT等分样品与约0.5µg蛋白质底物和80 mM培养[14C] 总体积为40µl缓冲液HAT中的乙酰辅酶a。反应在37℃下进行30分钟，再加上在4℃下进行10分钟。反应产物按上述方法进行电泳和定量。

体内培养细胞（HeLa，3T3，HEK-Phoenix）中HMGB1的乙酰化在DMEM中培养70%的融合细胞，其中添加了各种HDAC抑制剂：5 ng/ml TSA，10 ng/ml HC毒素，5 mM丁酸钠；在不同的时间点通过胰酶消化法收集细胞，并在裂解缓冲液中冻融三次（50 mM PIPES pH 7.0，50 mM KCl，5 mM EGTA，2 mM MgCl2，1 mM DTT，60µg/ml蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。

为了监测LPS处理的U937细胞中的染色质乙酰化，在SDS–PAGE缓冲液中煮沸10µg细胞，并如上所示进行电泳。作为对照，用10 ng/ml TSA培养细胞样本。转移到过滤器后，对过滤器的上部进行染色以进行负荷控制，并使用B.Turner教授（伯明翰）善意提供的兔抗乙酰基-H4抗体和圣克鲁斯的兔抗乙酰基-H3对过滤器的下部进行免疫印迹。

生物信息学

使用PredictNLS检查HMGB1的潜在NLShttp://cubic.bioc.columbia.edu/prefectNLS，用于分析和确定NLS的自动化工具(科科尔等., 2001).

致谢

我们感谢B.M.Turner和L.Vandel提供的有用建议和试剂，A.J.Bannister、J.Bernues、C.Kilstrup-Nielsen和M.Vujanac提供的试剂和方案，M.Alfano和G.Poli提供的U937.12细胞，L.Ronfani和I.Benzoni提供的小鼠腹腔巨噬细胞，N.Collu提供的技术援助。L.Falciola贡献了未发表的结果。这项工作得到了意大利癌症研究协会（AIRC）以及卫生部、教育部、大学和研究部的支持。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团