初始CD4的器官依赖性体内启动⁺，但不是CD8⁺，浆细胞样树突状细胞产生的T细胞

PDCs无法启动脾脏中的原始T细胞

我们首先研究了脾脏PDCs在缺乏CD11c的情况下刺激原始T细胞的潜力^高的cDC。我们分离出TCR转基因OVA-特异性CD8⁺和CD4⁺分别来自OT-I和-II小鼠的T细胞(34,35). 供体小鼠携带异型标记物（CD45.1），用于检测受体小鼠中的转移细胞。在转移之前，T细胞被标记为细胞内染料CFSE，可以监测体内增殖(36). 将T细胞共转染到WT和CD11c-DTR转基因C57BL/6小鼠。用DTx处理移植小鼠，8小时后通过静脉注射可溶性OVA（10μg）或OVA负载的脾细胞进行免疫(37). 免疫后4天，处死小鼠，分离脾脏并分析T细胞移植物的增殖状态(图2). 所有挑战都导致CD4和CD4的急剧扩张⁺和CD8⁺WT受体小鼠的T细胞移植。如前所述(12)，CD11c缺失^高的cDC损害CD8的反应⁺T细胞对细胞相关抗原。MHC I类至CD8背景下抗原的呈现⁺T细胞需要一种独特的吞噬体-细胞溶质途径，导致交叉呈现，这是一种与cDC或cDC亚群独特相关的活性(12,37,38). 为了支持这一观点，我们发现CD8也需要cDC⁺外源性可溶性抗原激发后的T细胞启动(图2). 此外，脾脏cDC的缺失也会消除OVA-特异性CD4⁺T细胞对细胞相关和可溶性抗原的反应，从而扩展了Tian等人的研究(39). 重要的是，与最近的研究相反(40)，我们评估了在没有cDC的情况下PDCs的T细胞启动潜能。脾脏PDC无法启动原始CD4⁺和CD8⁺缺乏CD11c的T细胞^高的cDC。

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图2。

cDC消融损伤脾脏CD4⁺和CD8⁺T细胞启动。共转染CFSE标记CD45.1的流式细胞术分析⁺OT-I和-II T细胞移植物（10⁶DTx处理的非转基因和CD11c-DTR转基因小鼠（CD45.2）在静脉免疫OVA负载的脾细胞或可溶性OVA后4 d。直方图表示根据散射、CD45.1和CD8或CD4表面表达选通的细胞，如点图所示。数据显示了三个代表性实验中的一个实验的结果。

PDC可以启动原始CD4⁺LN中的T细胞，但不支持CD8⁺T细胞启动

T细胞反应在专门的次级淋巴器官（如脾脏和淋巴结）中启动，这些器官的微结构差异很大，分别反映了它们处理血液和组织载抗原的专门性。接下来我们调查CD11c是否^高的LN中也需要DC。局部皮下注射DTx导致表达DTR-GFP融合蛋白（包括CD8α⁺和CD8α^负极CD11c公司^高的cDC和窦状巨噬细胞(23)，但不是PDC(图1 C;图3 A; 图S1，A–C）。重复皮下注射DTx导致持续性cDC消融(图3 A和图S2 A，网址为http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20062373/DC1). 为了研究LN-cDC耗竭对该器官中T细胞反应的影响，我们用OVA特异性CD4的混合物移植WT和CD11c DTR转基因C57BL/6受体小鼠⁺（OT-II）和CD8⁺T细胞（OT-I）。小鼠接受DTx治疗（在整个实验过程中持续进行，以保持cDC耗竭；图3 A)8小时后，通过皮下注射10μg OVA进行免疫。免疫后3d，我们分离出抗原训练的腘淋巴结，并分析其移植T细胞的增殖状态。过继性共传递CD45.1⁺CD4细胞⁺和CD8⁺免疫可溶性OVA后，DTx处理的WT小鼠LNs中的T细胞容易增殖(图3 B). 重要的是，DTx诱导的cDC缺失消除了CD8的扩张⁺T细胞，表明与脾脏一样，启动了原始CD8⁺T细胞需要cDC的存在。然而，令人惊讶的是，我们观察到移植CD4的增殖反应⁺cDC缺失LN中的T细胞(图3 B). 重要的是，这不太可能是由残留的cDC引起的，因为DTx治疗在相同的LNs中损害了CD8⁺T细胞反应，通常对抗原挑战更敏感(41). CD4的持续性⁺CD11c-DTRtg BALB/c小鼠在没有cDC的情况下也观察到T细胞启动，与OVA-特异性TCR转基因原始CD4结合⁺从DO11.10小鼠分离的T细胞移植物（图S3）(42). 此外，为了证实我们在非TCR转基因系统和OVA以外的抗原中的观察结果，我们用KLH/CpG攻击未经治疗和cDC耗竭的DTRtg小鼠，并分析了内源性CD4的反应⁺T细胞。在s.c.抗原激发7天后，我们纯化了CD4⁺来自腘窝淋巴结的T细胞，用KLH脉冲APC进行体外再刺激。同样，CD4⁺无论是否存在cDC，T细胞均被有效激发（图S2）。

我们的数据显示，LN包含CD11c以外的APC^高的能够刺激原始CD4的DC或巨噬细胞⁺T细胞。虽然PDC是潜在的候选人，但其他MHC类别II⁺细胞可能负责CD4⁺T细胞启动。迄今为止，最大的MHC II级⁺淋巴结中的人群是B淋巴细胞，即使是幼稚的淋巴细胞，也能有效地摄取和处理非结合蛋白抗原(43). 然而，B细胞激活原始CD4的能力⁺T细胞仍在争论中(44–46). 此外，在B细胞上遇到pMHC被认为会导致非生产性T细胞启动或耐受(47). 为了研究B细胞在我们的系统中的作用，我们将CD11c DTR转基因杂交到B细胞缺陷的遗传背景（C57BL/10-Igh-6tm1点火[微吨]）(48). CD11c-DTRtg：μMT和μMT C57BL/6小鼠植入OVA-特异性CD4⁺T细胞（OT-II）并接受DTx治疗和OVA免疫。B细胞缺乏导致移植CD4的恢复减少⁺DTx处理的CD11c-DTRtg小鼠的T细胞：μMT和μMT C57BL/6小鼠。然而，丢失CFSE-label的OT-II细胞的频率，并因此在OVA攻击下增殖，不受B细胞缺失的影响（图S4、A和B，可在http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20062373/DC1). CD4细胞⁺因此，在没有B细胞和CD11c的情况下，LN中的T细胞启动持续存在于结合细胞中^高的cDC。其他潜在的APC候选细胞是表皮朗格汉斯细胞（LC），即CD11c^否定，但迁移到皮肤排泄LN时上调CD11c表达(49). 因此，预计LC在到达LN时会对DTx敏感。然而，为了排除CD4⁺我们观察到的T细胞反应是由残留的LCs引起的，我们将CD11c-DTR转基因小鼠与LC-specific Langerin启动子下携带DTR基因的小鼠杂交(50). LanDTR:CD11cDTR小鼠的DTx治疗导致cDC和LC的消融（未发表的数据）。然而，过继转移的OT-II CD4的反应⁺OVA挑战的T细胞持续存在（图S4 C）。总的来说，这些数据表明除cDC、巨噬细胞、B细胞或LC外的其他细胞负责CD4的启动⁺T细胞，并指出PDC在抗原呈递中的作用。

LN PDCs有效地获取和处理可溶性抗原并引发生产性T细胞反应

抗原呈递和CD4⁺通过LN受体PDCs启动T细胞需要摄取抗原。重要的是，低分子量（<70 kD）的可溶性抗原很容易通过高度发达的管道网络运输到LN的T细胞区，即PDC邻近区(51). 为了研究LN PDCs是否能够获得抗原，我们用DQ-OVA免疫C57BL/6 WT小鼠，并分析LN APC群体的抗原摄取情况。由于自动猝灭，这种荧光试剂在未经处理的形式下无法检测到，但一旦进入酸性的内胚体细胞室，就会发出荧光。如中所示图4，DQ-OVA很容易被LN受体CD11c摄取^高的DC并按照绿色荧光标签的感应指示进行处理。PDC的标记效率至少与CD11c相同^高的cDC，而B细胞未受DQ-OVA攻击的影响。重要的是，在幼年小鼠中，抗原摄取与抗OVA抗体无关，因此Fcγ受体也与PDC抗原捕获有关(52). 因此，PDCs在我们的实验系统中可以接触到抗原，它们可能负责启动CD4⁺淋巴结中的T细胞耗尽CD11c^高的DC。

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图4。

PDCs体内抗原采集。在后脚垫皮下注射DQ-OVA后24小时收集的腘窝LN的流式细胞术分析。直方图表示cDC对DQ-OVA摄取的分析（CD11c^高的mPDCA-1型^负极)、PDC（CD11c^整数mPDCA-1型⁺)和B细胞（CD11c^负极B220型⁺). 结果代表了两个独立的实验。

增殖性T细胞的扩增可能与产生细胞因子的效应性T细胞有关，但也与T细胞反应的流产有关(53–55). 因此，我们研究了启动的LN CD4的质量⁺通过研究T细胞极化和T细胞长期存活。分析移植卵巢特异性CD4的Th细胞极化⁺T细胞，我们通过静脉注射OVA肽重新激发OVA免疫小鼠进行体内再刺激试验(56). 在CD11c存在和不存在的情况下^高的cDC、CD4⁺T细胞有效分化为产生IFN-γ的效应T细胞(图5 A). 流产性T细胞刺激的特征是抗原特异性T细胞群在最初扩张后崩溃(53,54). 测试CD4的持久性⁺在没有cDC的情况下启动的T细胞，我们使用混合CD11c-DTR-BM嵌合体，允许重复DTx治疗，从而延长cDC耗竭(57). 在未治疗和cDC耗竭的小鼠中，OT-II CD4⁺T细胞移植物克隆性扩增，并在初始抗原挑战后持续存在(图5 B). 此外，无论有无cDC，移植的原始CD4⁺T细胞分化为CD45RB的T细胞^低的记忆表型(58). 总的来说，PDCs似乎能够刺激幼稚的CD4⁺T细胞，导致持续反应，包括产生IFN-γ的记忆表型效应T细胞。重要的是，与cDC触发的免疫反应相反，这种反应并不伴随伴随CD8⁺T细胞反应。

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图5。

CD4细胞⁺在没有cDC的情况下启动的T细胞分化为具有记忆表型的Th细胞，并持续较长时间。（A） CFSE标记的CD45.1⁺将OT-II细胞转移到非转基因和CD11c-DTR转基因小鼠（CD45.2⁺). 1天后，小鼠皮下注射DTx；8小时后，用OVA和CpG在它们的后脚垫进行免疫。免疫后3d，在去除腘淋巴结前2 h，用OVA肽在体内重新刺激后，评估腘淋巴中IFN-γ的产生。数据表示CD4门控后的IFN-γ谱⁺CD45.1型⁺淋巴细胞。结果代表了两个独立的实验。（B） CFSE标记的CD45.1⁺将OT-II细胞转入混合[WT>WT]或[DTRtg>WT]BM嵌合体（CD45.2⁺). 小鼠在转移后1天皮下注射DTx，8小时后用注射到其后脚垫中的OVA免疫。连续皮下注射DTx，第二天进行一次，直到第21天。在第4天、第11天和第21天采集血液，并评估是否存在OT-II细胞（CD4⁺CD45.1型⁺)记忆性T细胞标记CD45RB的表达。条形图描述了CD45RB在第4天、第11天和第21天血液染色的平均荧光强度值。结果代表了两个独立的实验。

CD11c的隔离^高的DC和PDC。

用1 mg/ml胶原酶D（Roche）在37°C下消化外周淋巴结或脾脏45分钟。PBS中的组织被机械破坏，对于脾脏，用1 ml ACK缓冲液（0.15 M NH）孵育进行红细胞溶解₄氯，0.1 M KHCO_三1 mM EDTA和PBS）在室温下保持1分钟。根据制造商的协议（Miltenyi Biotec GmbH），通过MACS细胞分选富集PDC。

体外增殖试验。

将BALB/c小鼠静脉免疫（20μg OVA或10μg mPDCA-1-OVA）和皮下注射到后足垫（10μg OVA或mPDCA-1-OVA）。24小时后，收获脾脏、腘窝和腹股沟淋巴结，并使用FACS Aria（Becton Dickinson）通过根据CD11c和mPDCA-1表达的高速细胞分选来纯化cDC和PDC。含有<0.01%污染CD11c的PDC阳性率^高的cDC。DC（10⁴)或PDC（2–3×10⁴)与10⁵DO11.10 CD4⁺T细胞。72小时后用1μCi的[h脉冲培养^三]16h后测定胸腺嘧啶核苷掺入量。

干扰素-α分泌测定。

以2×10培养富含MACS的脾PDC⁶细胞/ml在完整的RPMI 1640中培养20小时，400 HAU/ml流感病毒A/Texas/1/77（由R.Arnon提供，以色列Rehovot Weizmann研究所）。使用干扰素-αELISA试剂盒（Performance Biomedical Laboratories）对上清液进行检测。

OVA与抗mPDCA-1 F（ab'）的结合₂片段和特异性试验。

用胃蛋白酶A（Sigma-Aldrich）消化抗mPDCA-1单克隆抗体（大鼠IgG2b，κ；Miltenyi Biotec GmbH）。粒度分级后（Superdex 200 16/60凝胶过滤柱；GE Healthcare），F（ab'）₂片段与用琥珀酰4激活的OVA（Sigma-Aldrich）结合-(N个-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸盐（Pierce Chemical Co.），符合制造商协议。F（ab’）₂-OVA结合物经粒度分级和无菌过滤（Millex GV过滤单元0.22μm；Millipore），用于体内应用。分别用辣根过氧化物酶偶联的多克隆兔抗大鼠Ig（H+L；Jackson ImmunoResearch Laboratories）和辣根过氧化物酶偶联的兔抗OVA抗体（Research Diagnostics，Inc.）通过蛋白质印迹分析评估构建体的完整性。通过ELISA测定OVA含量为～75 ng OVA/μg mPDCA-1 F（ab'）₂-OVA共轭物。为了证明体内特异性，我们注射了10-25μg FITC-共轭抗-mPDCA-1-F（ab’）₂–静脉注射卵巢或进入后脚垫。3小时后，分析脾脏或合并的腘窝和腹股沟淋巴结，以确定PDC特异性靶向。

免疫组织化学。

将腘窝淋巴结的4μm石蜡切片脱蜡，并用2 ml HCl，H处理₂O（运行）₂在50%甲醇和50%PBS中在室温下放置15分钟。对于抗原暴露，切片在pH 6.0的10 mM柠檬酸钠中微波加热。用20%热灭活正常山羊血清和0.1%Triton X-100在PBS中阻断后，在室温下用生物素化山羊抗GFP多克隆抗体（ab6658；Abcam）孵育切片过夜。用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（Vectastain Elite ABC试剂盒；Vector Laboratories）显示染色。最后，用苏木精-Mayer（Finkelman）对切片进行染色。

T细胞增殖分析。

从相应小鼠的脾脏和淋巴结分离出TCR转基因T细胞，根据制造商的方案（Miltenyi Biotec GmbH）用抗CD8或-CD4抗体对MACS细胞进行分离富集，并用CFSE（C-1157；Invitrogen）标记(57). CFSE标记的T细胞（1–2×10⁶/小鼠）注射到受体小鼠的尾静脉。

免疫接种。

通过静脉注射3×10的细胞相关抗原免疫小鼠⁷OVA负载β2m^−/−脾细胞(37). 将可溶性OVA（Sigma-Aldrich）静脉注射（10μg/小鼠）或皮下注射到后足垫（10μg/m足垫）。将KLH（Sigma-Aldrich）皮下注射到后脚垫中（10μg/脚垫）。抗DEC205-OVA结合物（由德国海德堡大学医院K.Mahnke提供）的使用剂量为7 ng/脚垫。F（ab’）₂和抗mPDCA-1–F（ab’）₂–以8μg/脚垫的剂量注射OVA。为了测量银摄取量，小鼠通过后脚垫注射10μg/脚垫用DQ-OVA（Invitrogen）免疫。

细胞内细胞因子染色。

用5 nmol/footpad CpG核苷酸1668（TIB MOLBIOL）中的25μg OVA免疫小鼠。2天后，在去除腘窝淋巴结前2 h，通过静脉注射100μg OVA肽（残基323–329）对小鼠进行体内再刺激。将组织切碎，并在37°C的1 mg/ml胶原酶D（Roche）中在补充有10μg/ml布雷费尔丁A（Calbiochem）的培养基中培养20分钟。细胞固定在2%甲醛中，用0.3%皂苷渗透，并染色以检测抗CD45.1、-CD4和-IFN-γ抗体。

流式细胞术分析。

本研究中使用的染色试剂包括PE偶联的抗CD4、CD19、CD45.1、CD11c、CD45RB、CD8和KJ126（DO11.10克隆型）；生物素化抗CD45.1和mPDCA-1；APC偶联CD11c、CD4、IFN-γ和CD8；FITC-偶联抗CD4；PE-Cy5.5–耦合抗B220（Caltag实验室）；以及PerCP偶联的抗CD4和CD8抗体。除非另有说明，否则试剂来自PharMinen或eBioscience。抗Siglec-H抗体（440c）由M.Colonna（密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院）提供。使用CellQuest软件（BD Biosciences）在细胞仪上分析细胞（FACSCalibur；BD Bios科学）。

我们感谢M.Colonna提供的抗-Siglec-H抗体（440c），感谢K.Mahnke提供的DEC-205 OVA结合物，感谢B.Clausen提供的Langerin-DTR小鼠。我们感谢盖伊·沙哈尔（Guy Shakhar）和荣格实验室（Jung laboratory）的成员对手稿的批判性阅读，也感谢阿迪·本·亚沙尔（Adi Ben-Yashar）、Y.切尔梅什（Y.Chermesh）和O.阿姆拉姆（O.Amram）提供的技术帮助和畜牧业。

这项工作得到了以色列科学基金会的支持。S.Jung是Pauline Recanati职业发展主席的现任者，也是Benoziyo分子医学中心的学者。

作者没有相互冲突的经济利益。