SDF-1和I-TAC的新型趋化因子受体参与细胞生存、细胞粘附和肿瘤发展

新型SDF-1/ITAC-1结合蛋白是7跨膜受体RDC1

为了鉴定新的SDF-1/I-TAC结合位点的分子性质，我们使用了上一节中定义的签名结合特征；即。，¹²⁵I SDF-1结合可被I-TAC和CCX451抑制，但不能被AMD3100抑制。在其他策略中，我们的研究包括评估“孤儿”G蛋白偶联受体（GPCR），根据预测的氨基酸序列，其结构类似于CXCR（有关综述，请参阅参考文献20). 一个孤儿，RDC1(21,22)被引入人乳腺癌衍生细胞系MDA MB 435s中，该细胞缺乏CXCR4和RDC1 mRNA（未描述），也缺乏结合能力¹²⁵I SDF-1型(图2 B). 与野生型生产线相比RDC1转染体具有特异性高亲和力SDF-1结合能力；此绑定可以被I-TAC和CCX451阻止，但不能被AMD3100阻止(图2 B)，显示出与MCF-7细胞上看到的相似性(图2 A). 使用第二个多克隆观察到相同的配体结合特性RDC1转染细胞系，以及转染293个细胞RDC1但不是亲代293细胞（未描绘）。

这个RDC1该基因产物在血清学上与CXCR4和CXCR3都不同，因为针对这些受体的特异性抗体无法结合RDC1转染的细胞（未公布的数据）。相反，用质粒编码的人对小鼠进行基因免疫产生的单克隆抗体RDC1特别绑定到RDC1型转染但不转染野生型MDA-MB 435s细胞(图2 C). 单独的实验表明，抗RDC1抗体与转染MBA-MB 435s细胞的两个单独的多克隆系结合RDC1以及转染293个细胞RDC1，但不与MBA-MB 435s细胞或经模拟转染或用另一种CXCR转染的293细胞结合（未发表的数据）。抗-RDC1杂交瘤上清液11G8或6E10，但不是无关的同型控制抗体11H3，特别抑制两者的结合¹²⁵I SDF-1和¹²⁵I I-TAC至RDC1以类似于CCX451类似物小分子拮抗剂CCX754的方式转染(图2 D). 在随后的实验中，较高浓度的11G8和6E10 mAbs纯化制剂完全中和了配体结合，进一步验证了试剂的特异性（未公布的数据）。总的来说，这些数据表明RDC1编码蛋白包含一个SDF-1结合位点，其性质与MCF-7细胞上表达的新型SDF-1/I-TAC结合位点没有区别(图1和​和2）。2). 我们暂时指定RDC1基因产物asCXCR7系列是迄今为止发现的CXC类趋化因子的第七个受体。

转化细胞和胚胎发育期间CXCR7的优先表达

我们对CXCR7表达的初步表征表明，我们检测的许多人类和小鼠转化细胞类型（例如，本文报道了MCF-7乳腺癌、HeLa宫颈癌和BCL1淋巴瘤，而T98G胶质瘤、A549肺癌和4T1乳腺癌是未公开的数据）CXCR7蛋白表达阳性(图3). 当用任何一种技术评估CXCR7的表达时，这一结论都是明显的；例如，用抗CXCR7单克隆抗体进行流式细胞术染色(图3 A),¹²⁵I SDF-1结合可被ITAC和CCX451抑制，但不能被AMD3100抑制(图3 B)以及通过CXCR7 mRNA水平的Northern blot分析(图3 C). 对于这些实验来说，重要的是，抗人CXCR7抗体还将小鼠CXCR7结合在小鼠肿瘤细胞系和转染小鼠的细胞系上CXCR7系列(图3 A且未描述）。在共存或缺失CXCR4的细胞株上观察到CXCR7(图3，A和C). 相反，在未转化的成年小鼠组织中观察到CXCR7的表达很少或没有，按照¹²⁵I SDF-1结合测定法（许多代表性实例如图4 A)或用抗CXCR7单克隆抗体染色(图4 B). 有趣的是，许多缺乏表面CXCR7表达的非转化组织表达CXCR7 mRNA(图4C)这表明CXCR7可以以翻译后的方式进行调节。总的来说图3和​和44提示膜CXCR7蛋白在转化细胞上频繁表达，但在正常细胞上不表达。

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图3。

通过转化的人和小鼠细胞系表达CXCR7。（A） 抗CXCR7抗体11G8染色和抗CXCR4抗体12G5证实了小鼠B细胞淋巴瘤、BCL1和人宫颈癌HeLa细胞膜CXCR7和CXCR4的表达。对于同种型对照，染色表示为阴影与开放。（B）¹²⁵I SDF-1结合谱揭示了BCL1和HeLa细胞表面膜CXCR7的表达。CXCR7结合通过抑制¹²⁵I SDF-1与100 nM的非放射性标记配体或10μM CXCR7拮抗剂CCX451结合，但与10μM的CXCR4拮抗剂AMD3100不结合。误差条代表SEM。（C）一组人类转化细胞系中CXCR7和CXCR4 mRNA表达的Northern blot分析。

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图4。

通过Northern杂交分析，未转化的人和小鼠组织表达少量膜CXCR7，但经常表达CXCR7。（A） 的绑定¹²⁵I SDF-1到从小鼠获得的各种组织细胞。误差条表示SEM（B）抗-CXCR7抗体11G8不能结合小鼠血液、肝脏、肺或心脏细胞。FACS直方图表示同型控制（开放）和特定染色（阴影）。（C） Northern blot分析显示正常小鼠组织中CXCR7特异性mRNA，但这与细胞表面蛋白表达无关。

SDF-1与正常和CXCR4缺陷小鼠胎肝细胞结合的初步观察(图1 A)提示CXCR7在正常胚胎发育过程中表达。事实上，CXCR4的E13胚胎表达的SDF-1结合位点^−/−I-TAC和CCX451对小鼠有抑制作用，但AMD3100对小鼠无抑制作用(图5 A)确认其身份为CXCR7。CXCR7在胚胎发育期间大量表达，但其表达是短暂的，在E11和E13的小鼠胎肝细胞上检测到，但在E15和E17上没有检测到(图5，A–C). 配体结合证实了CXCR7在胎儿发育中的这种表达模式(图5 A)，抗体染色(图5 B)和Northern印迹分析(图5C). 初步流式细胞术和免疫组织化学分析表明，CXCR7阳性细胞的这一亚群包括通过肝脏运输的原始红细胞（未发表数据）。目前正在进行进一步研究，以确定这种细胞群的特征。有趣的是，CXCR7表达的这种缺失与E15和E17之间发生的SDF-1或CXCR4基因缺失的致命后果相一致(1,2,7)表明CXCR4在CXCR7表达减少的阶段对胚胎发育至关重要。

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图5。

CXCR7在小鼠早期胚胎发育中表达。（A） 的绑定¹²⁵在SDF-1α、I-TAC、CXCR7拮抗剂CCX451或CXCR4拮抗剂AMD3100浓度增加的情况下，将I SDF-1注入胚胎胎肝（E11-17）。误差条代表SEM。（B）如方框所示，使用抗CXCR7抗体11G8，E13小鼠胎肝细胞的一个子集染色阳性。（C） Northern blot分析显示CXCR7 mRNA在E11和E13中表达，但在E15和E17胎肝中没有表达。对照组包括来自CXCR7-阳性MCF7细胞和CXCR7--阴性CEM-NKr细胞的总RNA。所显示的数据是在至少五个实验中获得的。

CXCR7在体外细胞存活中的作用

CXCR7在细胞生长/存活中的作用首先由以下观察结果表明：CXCR7系列-转染的MDA MB 435s细胞在培养中比野生型MDA MB 43 5s细胞扩张更快，尤其是在次优组织培养基中（例如，仅添加1%胎牛血清的培养基）。为了探索这一现象，两种细胞类型均在1%含血清培养基中的重复培养皿中培养5天，每天采集不同的培养皿进行细胞计数评估。如所示图6 A大多数野生型细胞在降低血清环境中培养时死亡（连系）；相比之下CXCR7系列转染体在最初几天呈指数级扩张，在电镀后4-5天达到活细胞的稳定期（虚线）。使用几个不同的CXCR7系列转染株以及模拟转染的野生型细胞。培养物中活细胞数量的差异CXCR7系列与野生型细胞系相比，转染剂似乎反映了细胞存活率的增加，而不是细胞增殖的增加CXCR7系列转染细胞，因为转染细胞和野生型细胞培养5d后的总细胞回收率相似(图6 A，右；和图6 B)而死亡细胞的比例则有显著差异(图6 A，中间；和图6 B). 事实上，使用Annexin V染色鉴定凋亡细胞显示，野生型435s细胞在培养5天后，凋亡细胞占很大比例（～40%），而CXCR7型转染细胞培养中凋亡细胞相对较少(图6 C). CXCR7拮抗剂CCX754能够以剂量相关的方式逆转这种保护作用，这一事实证明了这种效应的特异性(图6 D). 相同的化合物对野生型细胞没有影响(图6 D)或其他CXCR7阴性细胞系（未发表的数据）。总的来说，这些数据表明，CXCR7的表达为细胞提供了生存优势，这在使用细胞生长次优的组织培养条件的实验中变得明显。

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图6。

介绍CXCR7系列MDA MB435s对这些细胞具有生长优势。在所有实验中，野生型或CXCR7系列-转染MB435s细胞在含有次优血清浓度（1%而非标准10%）的培养基中进行体外培养。（A） 活细胞、死细胞和野生型细胞总数或CXCR7系列-转染细胞随时间培养。（B） 以直方图形式总结生长实验第4天的时间点，以强调野生型和CXCR7系列-转染细胞的总细胞数相似，但可以通过死亡细胞总数来区分。（C） 这些培养物中的凋亡细胞被鉴定为不含碘化丙啶的细胞，并用Annexin V标记物染色以检测凋亡细胞。（D） CCX754以剂量依赖的方式抑制CXCR7介导的生长优势。野生型或CXCR7系列-在整个实验过程中，转染细胞与不同浓度的CXCR7化合物孵育。

CXCR7在体外细胞粘附中的作用

我们还测试了CXCR7促进活化内皮细胞单层粘附的能力。荧光标记野生型MDA MB 435s细胞或CXCR7系列用活化细胞因子TNF-α和IL-1β刺激内皮细胞后，将转染细胞应用于人脐静脉内皮细胞（HUVEC）单层，并通过荧光细胞计数测定粘附性(图7 A)或量化荧光(图7 B). 这个CXCR7系列转染剂与活化的HUVEC的粘附性明显高于野生型细胞(图7，A和B). 有趣的是，野生型细胞对活化的HUVEC有一定的粘附性CXCR7系列转染子对未刺激的HUVECs显示出一定的粘附性(图7 B). 相反，当野生型细胞被添加到未刺激的HUVEC中时，未观察到粘附(图7 B). 使用单独多克隆的类似实验CXCR7系列-转染细胞系代替克隆CXCR7型-转染MDA MB 435s细胞产生了类似的结果（未公布的数据）。对这种影响的可能机制的进一步了解由¹²⁵I SDF-1结合试验表明，在TNF-α和IL-1β体外刺激后，HUVECs上调CXCR7的表达(图7、C和D). TNF-α和IL-1β刺激前HUVEC单层与环己酰胺预孵育显著降低CXCR7的表达(图7、C和D)表明活化的HUVEC合成新的CXCR7受体，而不是使用先前存在的（但不结合的）CXCR7接收器。HUVEC激活后，Northern blot分析也观察到CXCR7 mRNA表达增加(图7 D). 使用来自肺、心脏和各种其他组织的内皮细胞也获得了类似的结果（未发表的数据）。因此，除了在许多转化细胞和早期胎肝细胞中显著表达外(图3——5 ​),)，CXCR7也可以通过激活的内皮细胞表达。此外，尽管CXCR7在一种细胞类型上的表达可以促进一些细胞-细胞的相互作用，但CXCR7同时在活化的HUVEC和肿瘤细胞上的表达在体外产生了最大的粘附性。

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图7。

CXCR7在体外介导细胞粘附。粘附性的测量（A）通过捕获亮场图像来可视化HUVEC单层和标记的粘附细胞（亮圈），（B）通过荧光来定量粘附。误差线代表SEM。（C）通过放射性标记结合分析，激活的内皮细胞表达CXCR7。用TNF-α和IL-1β（HUVEC活性）刺激HUVECs，或在存在或不存在环己酰亚胺（CHX）的情况下进行半处理，并用放射性标记的SDF-1孵育。对未标记的SDF-1α和I-TAC（各100 nM）以及CCX451和AMD3100（各10μM）进行了竞争能力检测¹²⁵I SDF-1绑定。（D） 在存在或不存在环己酰亚胺（CHX）的情况下培养的非刺激（HUVEC）或TNF-α/IL-1β（HUVEC作用）细胞表达的CXCR7-特异性mRNA的Northern blot分析。MCF7（天然表达）和CEM-NKr（转染剂）CXCR7转录物显示为对照。至少在五个实验中重现了A–C的数据。两次获得D的数据。

老鼠。

从Charles River Laboratories购买8周龄雌性C57BL/6小鼠、SCID小鼠和定时妊娠C57BL-6小鼠。所有动物程序和研究均严格按照ChemoCentryx，Inc.机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

放射性配体结合分析。

如前所述，进行了评估放射性配体与CXCR7结合的分析(16). 通过在γ计数器（PerkinElmer）中分析细胞来定量放射性配体结合。使用软件（Prism；GraphPad）分析和绘制数据。

钙动员。

如前所述，使用细胞内比例荧光染料Indo-1进行钙动员反应(38).

细胞迁移。

细胞迁移分析使用96 well微腔（Chemo Tix；NeuroProbes，Inc.）进行。细胞重新悬浮在趋化缓冲液中（含Ca的HBSS²⁺，镁²⁺和0.1%BSA），并放置在过滤器顶部（孔径为3或5μm，取决于细胞大小）。趋化因子放置在过滤器下方的小室中。在37°C的加湿培养箱中90分钟后，取下过滤器，向下室中添加5μl CyQuant（Invitrogen），并在540-nm波长的平板阅读器（分子器件）上分析微孔板。

流式细胞术。

使用标准程序标记细胞，并在FACScan上进行分析（Becton Dickinson）。所提供的数据通过光散射对活细胞进行门控。

CXCR7转染剂。

使用mRNA分离试剂盒（μMACs；Miltenyi Biotec）从MCF-7细胞中分离出编码人类CXCR7的基因RDC1的完整编码序列。通过RNeasy柱上的DNA酶消化（QIAGEN）去除DNA污染，并使用RNA PCR核心试剂盒（GeneAmp；Applied Biosystems）生成cDNA。cDNA样品的PCR用Taq PCR Master Mix试剂盒（QIAGEN）进行，使用含有5′和3′NotI位点的RDC1引物（hRDC1F，5′-GATGCGGCCGCTATGGATCTGCATCTTCGACT-3′；hRDC1R，5′-GATGCGGCCGCTCATTTGGTGCTCTGCTCCAAG-3′）。将NotI-酶切的PCR产物连接到NotI-蛋白酶切的pcDNA3.1（+）（Invitrogen）中并进行定向筛选，然后确定cDNA序列。通过Maxiprep（QIAGEN）从过夜细菌培养物中分离出质粒DNA。使用基因脉冲器（生物实验室）通过电穿孔（0.22 kV，960 uF）将10μg质粒DNA添加到MDA MB 435s细胞中。电穿孔48小时后，将细胞转移至选择培养基（1000μg/ml G418）。

单克隆抗体生产。

使用含有RDC1的质粒通过DNA疫苗接种获得了人CXCR7的单克隆抗体。CXCR7特异性抗体通过与人RDC1转染子结合与表达不相关蛋白的转染子结合来鉴定。产生了两种CXCR7特异性抗体，分别命名为11G8和6E10。特异性通过对一组趋化因子受体缺乏反应性而得到证实。

抗体纯化。

使用蛋白G柱从采集的上清液中纯化抗体，随后进行酸性洗脱（甘氨酸，pH 3）和透析以对抗PBS。通过Lowry抗BSA试验测定抗体浓度。

Northern印迹分析。

对10μg总RNA进行电泳，转移至硝化纤维过滤器，并使用试剂进行探测（NorthernMax；Ambion）。使用RNA试剂盒（Strip-EZ；Ambion）从克隆小鼠或人类CXCR4和CXCR7开放阅读框中生成特异性反义核糖探针。购买FirstChoice小鼠Blot 1（Ambion），并用小鼠CXCR4和CXCR7核糖探针进行检测。

细胞凋亡检测。

将膜联蛋白V–FITC（Invitrogen）和碘化丙啶（Invit罗gen）添加到洗涤的细胞（10⁶细胞/毫升（FACS缓冲液中），在室温下黑暗中放置15分钟。加入FACS缓冲溶液，立即用流式细胞仪分析细胞。

粘附试验。

允许HUVEC在24孔塑料组织培养板上过夜。用含有10 ng/ml TNF-α和10 ng/ml IL-1β的培养基处理单层细胞5 h。细胞在室温下用钙黄绿素AM（Invitrogen）在PBS中加载30 min，清洗，并在37°C下添加到HUVEC单层细胞中15 min。粘附细胞通过显微镜和荧光强度进行定量。

体内肿瘤模型。

在同基因模型中，C57BL/6小鼠接种小鼠Lewis肺癌细胞系LL/2。在异种移植模型中，CB17 SCID小鼠接种IM9人淋巴瘤或移植A549人肺癌片段。在所有实验中，在肿瘤移植时开始用CXCR7拮抗剂（100 mpk qd）或载体（等效体积）进行皮下注射治疗。阳性对照组接受已知的化疗药物（丝裂霉素或马法兰），每2天腹腔注射2 mg/kg。

我们感谢K.Moore博士、C.Gerard博士、H.Showell博士、B.Premack博士、M.Stein博士和R.Ransohoff博士的深刻评论。我们感谢研发系统为这些研究提供了许多试剂和材料。D.Littman隶属于霍华德·休斯医学研究所。

这项工作完全由ChemoCentryx公司资助。

一些实验中使用的小分子CXCR7拮抗剂是ChemoCentryx，Inc.的专有财产，可以开发用于临床应用，如果成功，可以作为新的治疗药物销售。这些化合物仅在本研究中用作研究工具。作者没有其他相互冲突的财务利益需要报告。