心肌相关转录因子在上皮-间质转化中的双重作用段塞诱导与肌动蛋白重塑

MRTFs介导TGF-β1诱导的slug基因表达

据报道，包括蜗牛、鼻涕虫和扭曲在内的几个转录调控因子通过E-cadherin的转录抑制诱导EMT(Savagner等人，1997年;Batlle等人，2000年;卡诺等人，2000年;Yang等人，2004年). 在MDCK细胞中，TGF-β1显著诱导段塞，但不是的蜗牛或扭曲，24小时内(图3 A). 与此同时，Peinado等人（2003）先前报道的TGF-β1诱导蜗牛在MDCK II细胞中表达。我们证实，TGF-β1的诱导作用较弱且短暂蜗牛MDCK II细胞表达，但MDCK细胞不表达，而段塞在两种细胞系中均持续诱导表达3d(图3 B). 在我们的CA–MRTF-A克隆中，段塞表达显著高于亲代细胞，TGF-β1诱导的段塞DN–MRTF-A克隆和MRTF-A/B缺失细胞中的表达受到抑制(图3，C–E).Bolos等人（2003年）据报道段塞足以下调MDCK细胞中的上皮标记物表达和上调间充质标记物。总之，这些结果表明TGF-β1激活的MRTFs主要诱导段塞表达，导致MDCK细胞出现EMT。虽然TGF-β1没有增加扭曲在MDCK细胞中的表达，CA–MRTF-A克隆表现出高表达扭曲表达式(图3 C). 在DN–MRTF-A克隆和MRTF-A/B缺失细胞中扭曲表达低于野生型细胞(图3、D和E). 因此，扭曲表达不依赖TGF-β1，但依赖MRTF。

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图3。

的表达式配置文件段塞,蜗牛、和扭曲基因。（A） MDCK细胞与TGF-β1培养指定的小时数和EMT诱导基因的表达时间(段塞,蜗牛、和扭曲)采用RT-PCR进行分析。（B） MDCK或MDCK II细胞与TGF-β1培养指定天数段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR分析基因。（C） 的表达式级别段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR比较CA–MRTF-A（克隆C2、C3和C12）及其亲本MDCK细胞中的基因。（D） DN–MRTF-A（克隆D2、D10和D12）及其亲代MDCK细胞在有或没有TGF-β1的情况下培养24小时段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR对基因进行比较。（E） 用MRTF-A或-B siRNA或对照siRNA转染MDCK细胞，并用TGF-β1培养细胞24 h段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR对基因进行比较。

MRTF和Smad3合作调节家族鼻涕虫一种新发现的顺式元件的启动子活性

确定转录的调节机制段塞通过MRTFs基因，我们分析了家族鼻涕虫基因。在第一外显子上游的～2.5kb片段中，我们发现了SRF、Smad和SP1的几个候选顺式元件(图4 A和图S2，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200708174/DC1). 为了鉴定MRTF反应元件，一系列5′启动子缺失突变体段塞基因（F1–F8）被创建。F1–F6报告结构同样被MRTF-A激活，但在F7和F8中该反应被完全消除，表明MRTF反应元件位于−218和−293之间。该区域有两种假定的结合序列：两种用于SP1（SP1near和SP1far），另一种用于Smad（GCCG盒状基序；图4 B). 突变分析表明，GCCG样和SP1near基序对基础水平和/或MRTF依赖性活性很重要，因此双突变构建体（F6 mutGCCG/SP1near）失去了对MRTF-A的反应性，并显示出与F7相同的活性(图4、C和D). F1报告构建体也被TGF-β1刺激激活，其siRNA对MRTF-A/B的耗竭导致TGF-β1诱导的激活减少(图4 E). 此外，GCCG-like和SP1near基序对于TGF-β1诱导的家族鼻涕虫发起人(图4 F). 因此，这些结果表明TGF-β1–MRTF信号激活段塞启动子-报告子通过GCCG-like/SP1near基序构建。

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图4。

启动子分析家族鼻涕虫基因。（A） 荧光素酶报告子分析使用一系列5′启动子缺失突变体段塞基因（F1–F8）。第一外显子上游的～2.5-kb片段包含推测的CArG盒样序列、SBE和SP1-结合元件。用这些带有或不带有pcDNA3.1–CA–MRTF-A的报告构建物转染MDCK细胞，转染24 h后测量荧光素酶活性。误差条表示三个独立实验的SD。（B） 启动子结构体F6的序列，其中含有七个SP1结合元件和GCCG样基序。MRTF-A响应元素的核心区域下划线。（C） 使用一系列突变的F6构建物进行荧光素酶报告子分析，其中SP1far、SP1near和/或GCCG-like基序中的位点如D所示发生突变。误差条代表三个独立实验的SD。（E） 用MRTF-A和-B siRNA或对照siRNA转染MDCK细胞。转染后，将F1报告基因构建物导入细胞。用TGF-β1培养细胞24小时，然后测定荧光素酶活性。误差条表示三个独立实验的SD。（F） 用所指示的报告构建体转染MDCK细胞。然后用TGF-β1培养细胞24小时，并测定荧光素酶活性。误差条表示三个独立实验的SD。

为了确定GCCG-like和SP1near基序是否足以用于TGF-β1和MRTF反应，将−219和−244（核心区）之间序列的九个串联拷贝插入报告基因上游（9xcore区域–Luc；图5 A). 该报告结构被TGF-β1显著激活，依赖于MRTFs的表达(图5 B). GCCG基序被确定为黑腹果蝇Smad蛋白（Mad/Medea）-结合顺式元素(Kusanagi等人，2000年). 报告者分析表明Smad1、2或3不是9xcore区域–Luc的激活剂，而MRTF-A显著激活了该报告者结构(图5、C和D). 然而，与MRTF-A单独表达相比，Smads与MRTF-A共同表达略微增加了MDCK细胞中该结构的活性(图5 C). 在HepG2细胞中明确观察到MRTF-A和Smad3对9xcore区域–Luc活化的协同作用(图5D). 与MDCK细胞相比，HepG2细胞显示出9xcore区-Luc的强大激活，这可能是因为它们的细胞环境不同，如内源性Smad3和MRTF-A活性和转染效率。此外，内源性Smad3的siRNAs缺失降低了9xcore区域–Luc对MRTF-A外源性表达的反应性(图5、E和F). 因此，这些结果表明MRTFs和Smad3协同调节段塞基因通过核心区域。

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图5。

9xcore区域的启动子分析–Luc结构。（A） 9xcore区域的示意图–Luc构造。（B） 用MRTF-A或-B siRNA或对照siRNA转染MDCK细胞。转染后，将9xcore区域–Luc构建物导入细胞。用TGF-β1培养细胞24小时，然后测定荧光素酶活性。误差条表示三个独立实验的SD。（C和D）将9xcore区域–Luc构建物与pcDNA3.1-Smad1（3E）、pcDNA3.11-Smad2（2E）、pcDNA3.1S-mad3（3E，和/或pcDNA3.1–CA–MRTF-A一起导入MDCK（C）或HepG2（D）细胞，并在转染24 h后测量荧光素酶活性。误差条表示三个独立实验的SD。（E） 分别用两种Smad3 siRNAs（Smad3 siRNA1或2）或对照siRNA转染HepG2细胞。转染24h后，用免疫印迹法分析Smad3蛋白的表达水平。（F） 用Smad3 siRNA或对照siRNA转染HepG2细胞。转染后，将9xcore区域–Luc构建物导入含有不同数量pcDNA3.1–CA–MRTF-A（0μg[−]、0.3μg[+]、0.6μg[++]和0.9μg++]）的细胞中，并测定荧光素酶活性。误差条表示三个独立实验的SD。

MRTF通过其基本域与Smad3的C末端结合

两个研究小组最近报告称，心肌蛋白与Smad1和Smad3结合，激活心肌和平滑肌特异性转录(Callis等人，2005年;邱等，2005). 在MDCK细胞中，内源性MRTF-A和-B与Smad3相互作用，TGF-β1治疗显著增加了它们的相互作用(图6 A)，表明TGF-β1不仅诱导MRTF的核转位，而且增强了它们的相互作用。为了确定MRTF和Smad3的相互作用域，体外合成了MRTF与Smad3蛋白的缺失序列，并通过共免疫沉淀分析了它们的相互作用。Smad3-C与MRTF-A–full的结合比Smad3-full更紧密，而Smad3-NL和MRTF-A-full之间的相互作用非常微弱，这表明Smad3的C末端结构域，包括MH2结构域，在很大程度上负责与MRTF-A的相互作用(图6、B和C). 相反，Smad3-C与MRTF-A–full、MRTF-AN-项和MRTF-AN-termΔQ相结合，但与MRTF-A cent、MRTF-aC-term或MRTF-An-term△BQ不相结合(图6、D和E)，表明MRTF-A的基本结构域对Smad3结合是必需的。我们证实，与MRTF-A一样，MRTF-B也与Smad3结合，并且MRTF-A-ΔB和-BΔB都失去了Smad3的结合活性(图6 F). 这些结果表明，MRTF的基本结构域和Smad3的MH2结构域直接相互作用。

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图6。

MRTF-A或-B与Smad3之间的相互作用。（A） MDCK细胞中表达的MRTFs和Smad3的免疫共沉淀。MDCK细胞在有或无TGF-β1的情况下培养24 h。使用非免疫兔IgG（对照IgG）、抗Smad3或抗MRTF-A或-B抗体进行协同免疫沉淀。沉淀剂中的蛋白质用所示抗体通过免疫印迹法检测。（B） Smad3截短突变体的示意图。显示了MH1结构域、连接区和MH2结构域。所示数字表示氨基酸位置。（C） 体外合成了HA-Smad3全蛋白、HA-Smad NL蛋白、HA-Smad C蛋白和全长FLAG–MRTF-A蛋白，并使用抗HA抗体通过共免疫沉淀分析了它们的相互作用。（D） MRTF-A和-B蛋白截短序列的示意图。显示了RPEL基序、基本域（B）、富Q域（Q）、SAP域、线圈域和事务激活域（TAD）。（E） 体外合成了FLAG–MRTF-A蛋白和HA-Smad3C蛋白的截短序列，并使用抗FLAG抗体通过共免疫沉淀分析了它们之间的相互作用。（F） 体外合成了FLAG–MRTF-A全、-B全、-AΔB、-BΔB和HA-Smad3全蛋白，并用抗HA抗体共免疫沉淀分析了它们之间的相互作用。

MRTF–Smad3复合物直接结合到家族鼻涕虫发起人

确定MRTF–Smad3复合物是否与DNA序列结合段塞核心区域，DNA-蛋白质结合试验在体外进行–翻译的HA-Smad3、FLAG–MRTF-A和包含核心区域序列的生物素化DNA探针。Kusanagi等人（2000年）据报道，Smad1和4直接与GCCG基序（GCCGnCGC）结合，但Smad3没有。然而，我们目前的结果显示Smad3与核心区域探针之间存在显著的相互作用，核心区域探针包含GCCG-like基序（GCCGtCCC；图7 A). 虽然MRTF-A在Smad3的存在下显著结合，但仅表达时，它没有与DNA探针结合(图7 A). 当添加非生物素化探针作为竞争物时，这种相互作用被显著抑制。竞争物中GCCG-like基序的突变消除了这种干扰，表明MRTF–Smad3复合物结合到段塞启动子通过Smad3–GCCG样基序相互作用。此外，MRTF-A以剂量依赖性的方式增强Smad3与探针的亲和力(图7 B). 我们还通过染色质免疫沉淀（ChIP）分析证实了MRTFs、Smads和体内核心区序列之间的相互作用，并清楚地表明MRTF-A/B和Smad3，而不是Smad1或2，与细胞的核心区结合段塞启动子对TGF-β1刺激的反应(图7 C).

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图7。

MRTF/Smad3与核心区域序列的结合家族鼻涕虫发起人。（A） 使用生物素化核心区DNA探针和体外进行DNA-蛋白质结合分析–合成HA-Smad3 full和FLAG–MRTF-Afull。与DNA探针结合的蛋白质用所示抗体通过免疫印迹法进行检测。（B） MRTF-A对Smad3与含有核心区域的DNA探针结合的协同效应呈剂量依赖性。（C） MRTF-A和-B以及Smad1、2和3与内源性核心区序列结合的ChIP分析段塞基因。MDCK细胞在有或无TGF-β1的情况下培养24 h，并使用非免疫兔IgG（对照IgG）、抗-MRTF-A和-B以及抗Smad1、2和3抗体进行ChIP检测。进行PCR以确定段塞围绕核心区域的启动子序列。

MRTFs还调节TGF-β1诱导的EMT中肌动蛋白细胞骨架的重组

在EMT期间，TGF-β1诱导应力纤维的形成，而不是皮质肌动蛋白束的消失。我们证明TGF-β1刺激的MDCK细胞和CA–MRTF-A克隆表现出明显的应力纤维形成，皮质肌动蛋白束丢失(图1 C和图8 A). TGF-β1诱导的EMT中的肌动蛋白重塑似乎通过Rho途径进行调节，Rho通路通过肌动蛋白聚合和解聚调节肌动蛋白细胞骨架的重组(Bhowmick等人，2001年). 出乎意料的是，TGF-β1诱导的肌动蛋白重塑被蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺完全抑制(图8 A)，表明需要从头合成蛋白质。众所周知的间充质标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达在EMT期间增加(图8 B). 此外，我们观察到钙调素和原肌球蛋白的上调(图8 B)增强各种细胞系中应力纤维的形成(Sobue和Sellers，1991年;Li等人，2004年). β-肌动蛋白略有增加，但黏附蛋白vinculin和talin的表达水平不变(图8 B). 最近，我们报道了MRTF-A和-B通过肌动蛋白细胞骨架基因的转录调节调节成纤维细胞NIH 3T3细胞中肌动蛋白的细胞骨架重组，包括加德斯蒙和原肌球蛋白1(Morita等人，2007年). 在CA–MRTF-A克隆中，肌动蛋白细胞骨架蛋白的表达水平显著增加(图8 C). 相反，在DN–MRTF-A克隆中，TGF-β1诱导的这些蛋白的上调受到严重抑制(图8 C). MRTF-A/B的缺失也抑制了TGF-β1对细胞骨架蛋白的诱导(图8 D)这表明MRTFs在TGF-β1刺激下激活这些基因的转录。重要的是加德斯蒙(Yano等人，1995年),原肌球蛋白(Nakamura等人，2001年), α-座椅模块组件(布兰克等人，1992年)、和β-肌动蛋白(Liu等人，1991年)都包含一个CArG框或CArG类似框的图案（图S3，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200708174/DC1)它们的转录受SRF调节。在我们的报告试验中，TGF-β1以CArG盒依赖的方式增强了这些启动子的活性(图8E)这些激活被DN–MRTF-A抑制(图8F). 这些结果强烈表明，一旦被TGF-β1激活，MRTFs也会增强SRF/CArG介导的肌动蛋白细胞骨架基因的转录，从而导致肌动蛋白的细胞骨架重塑。

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图8。

MRTFs调节TGF-β1诱导的MDCK细胞肌动蛋白重塑。（A） MDCK细胞在加入或不加入TGF-β1和/或环己酰亚胺（CHX）的情况下培养24小时。然后固定细胞，并用Alexa 568共轭指骨肽染色。棒材，20μm。（B） MDCK细胞在加入或不加入TGF-β1的情况下培养24小时。通过免疫印迹法比较所示细胞骨架蛋白的表达水平。（C） DN–MRTF-A（克隆D2、D10和D12）和亲代MDCK细胞在有或无TGF-β1的情况下培养（左）。在没有TGF-β1的情况下培养CA–MRTF-A（克隆C2、C3和C12）和亲代MDCK细胞（右）。通过免疫印迹法比较肌动蛋白细胞骨架蛋白的表达水平。（D） 用MRTF-A或-B siRNA或对照siRNA转染MDCK细胞，并用或不用TGF-β1培养。免疫印迹法比较MRTF-A、-B和细胞骨架蛋白的表达水平。（E和F）荧光素酶报告子分析使用启动子结构进行卡尔德蒙,原肌球蛋白1, α-座椅模块组件、和β-肌动蛋白包含原生（WT CArG）或突变（mut CArGhttp://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200708174/DC1). 用这些细胞骨架启动子构建物转染MDCK细胞。转染后18h，分别用TGF-β1和TGF-α1培养24h，测定荧光素酶活性。对于F，将pcDNA3.1–DN–MRTF-A载体与细胞骨架启动子构建体一起转染。误差条表示三个独立实验的SD。

MRTFs调节TGF-β1诱导的HK-2和NMuMG细胞EMT

为了确认我们在MDCK细胞中证明的当前模型是否适用于其他细胞类型，我们分离了小鼠乳腺上皮NMuMG细胞和人类近端肾小管上皮HK-2细胞的稳定表达CA–MRTF-A和DN–MRTF-A的细胞系。与MDCK细胞一样，NMuMG中表达的MRTF在LMB存在的情况下通过TGF-β1刺激转位到细胞核中，而HK-2细胞显示即使没有LMB，TGF-http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200708174). 在表达CA–MRTF-A的NMuMG和HK-2克隆中，在没有TGF-β1刺激的情况下，观察到EMT事件，即与肌动蛋白细胞骨架蛋白上调相关的肌动蛋白重塑、细胞-细胞粘附分离以及从上皮标记物到间充质标记物的表达变化(图9，A–E). 相反，TGF-β1诱导的EMT事件在表达DN–MRTF-A的NMuMG和HK-2克隆中受到抑制(图9，A–E).

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图9。

MRTF-A和-B在小鼠NMuMG细胞和人HK-2细胞中诱导EMT。（A） 将NMuMG CA–MRTF-A（克隆C4和C9）、DN–MRTF-A（克隆D34和D41）和亲代NMuMG-β1培养24 h，并用Alexa 568结合性阴茎肽染色。棒材，20μm。（B） 将HK-2 CA–MRTF-A（克隆C1和C3）、DN–MRTF-A（克隆D1和D3）和亲代HK-2细胞在有或无TGF-β1的情况下培养48 h，并用Alexa 568结合的卵磷脂染色。棒材，20μm。（C） 无TGF-β1培养的NMuMG CA–MRTF-A（克隆C4和C9）和HK-2 CA–MRTF-A（克隆C1和C3）细胞的相位对比图像。棒材，50μm。（D和E）NMuMG（WT）、NMuMG-CA-MRTF-A（克隆C4和C9）、HK-2（WT，和HK-2 CA-MRTF-A（克隆C1和C3）细胞在没有TGF-β1的情况下培养（左）。NMuMG（WT）、NMuMG DN–MRTF-A（克隆D34和D42）、HK-2（WT）和DN–MRTF-A（克隆D1和D3）细胞在有或没有TGF-β1的情况下培养24小时（NMuMG细胞系）或48小时（HK-2细胞系；右）。通过免疫印迹法比较所示蛋白的表达水平。（F） NMuMG细胞与TGF-β1培养指定天数段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR分析基因。（G） 在不含TGF-β1的情况下培养NMuMG和NMuMG-CA-MRTF-A（克隆C4和C9）细胞（左）。NMuMG和NMuMG-DN-MRTF-A（克隆D34和D42）细胞在有或无TGF-β1的情况下培养24 h（右）。的表达水平段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR分析基因。（H） HK-2细胞与TGF-β1培养指定天数，表达时间进程段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR分析基因。（一） HK-2和HK-2 CA–MRTF-A（克隆C1和C3）细胞在没有TGF-β1的情况下培养（左）。HK-2和DN–MRTF-A（克隆D1和D3）细胞在有或无TGF-β1的情况下培养24小时（右）。的表达水平段塞,蜗牛、和扭曲通过RT-PCR分析基因。

在NMuMG细胞中，TGF-β1上调段塞,蜗牛、和扭曲在TGF-β1刺激后，这些上调至少维持3天(图9 F). 异位CA–MRTF-A显著诱导段塞,蜗牛、和扭曲而异位DN–MRTF-A抑制TGF-β1诱导的这些基因的表达(图9 G)表明TGF-β1-MRTF信号调节NMuMG细胞中所有这些基因的诱导。相反，HK-2细胞表现出TGF-β1诱导的段塞表达式，但不是的扭曲表达式(图9、H和I). TGF-β1也增加蜗牛在HK-2细胞中表达，但这种诱导是短暂的，正如在MDCK II细胞中观察到的那样(图9 H). 在HK-2细胞中，异位CA–MRTF-A显著诱导段塞表达和异位DN–MRTF-A抑制TGF-β1诱导的段塞表达式(图9 I). 然而，CA–MRTF-A和DN–MRTF-A均不影响蜗牛和扭曲表达式(图5、H和I)这表明MRTF与HK-2细胞中的表达没有直接联系。因此，段塞正如在MDCK细胞中观察到的那样，NMuMG和HK-2细胞中的表达受到TGF-β1-MRTF信号的密切调节，而蜗牛和扭曲在这些细胞系中表达受到不同的调节。

细胞培养

在补充有10%FCS的DME中培养MDCK、MDCK II、NMuMG和HepG2细胞。HK-2细胞在添加10%FCS的DME/F-12中培养。在TGF-β1的实验中，将细胞在含有2%马血清的DME中培养24-48小时，加入/不加入10 ng/ml TGF-β1。

表达载体和转染

鼠标的编码区域MRTF-A型和-B类和人类Smad1型,2、和三经PCR扩增后克隆到pcDNA3.1（+）表达载体（Invitrogen）中。CA–MRTF-A公司(Morita等人，2007年)，CA-Smad1（Smad1（3E）；秦等，2001)，CA-Smad2（Smad2（2E）；Funaba和Mathews，2000年)、CA-Smad3（Smad3（3E））；Chacko等人，2001年)和DN–MRTF-A(Morita等人，2007年)如前所述建造。以pGEX-KG-TAT-C3为模板，通过PCR扩增C3外酶编码区，克隆到pcDNA3.1（+）中。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）、TransIT-LT1（Mirus）或核载体（Amaxa Biosystems）将这些表达载体转染细胞。为了建立稳定的表达CA–或DN–MRTF-A的细胞系，MDCK和NMuMG细胞转染pcDNA3.1–CA–MRTF-A或pcDNA3.1-DN–MRTF-A，并用100μg/ml Geneticin（Invitrogen）培养以分离耐药克隆。由于HK-2细胞对Geneticin具有耐药性，因此使用线性潮霉素标记物（Clontech Laboratories，Inc.）分离表达CA或DN–MRTF-A的HK-2细胞系。

荧光素酶报告试验

人类的启动子区域加德斯蒙(Yano等人，1995年),原肌球蛋白1(Nakamura等人，2001年), α−座椅模块组件(布兰克等人，1992年)、和β-肌动蛋白(Liu等人，1991年)基因通过PCR扩增并克隆到pGL3-basic中（Promega；图S3）。的启动子区域家族鼻涕虫（可从GenBank/EMBL/DDBJ获得，注册号：。AB300658型)和人类段塞（可从GenBank/EMBL/DDBJ获得，登录号：。AB300659型)通过PCR扩增基因并将其克隆到pGL3-basic中。为了构建9x核心区–Luc载体，体外合成了核心区序列（5′-tcgcggccgtcccggggggggtgtg-3′），并将9个核心区片段串联插入pGL3-basic中。3xCArG-Luc向量是参考以前的一篇论文构建的(Hill等人，1994年). 简而言之c-fos公司体外合成了CArG盒序列（5′-attggatccatattaggacatct-3′），作为一个单元。TATA盒序列爪蟾γ-肌动蛋白通过PCR扩增该基因，并将其和合成的3xCArG寡核苷酸一起插入pGL3-basic中。将这些构建物与pSV-βGal（Promega）一起导入MDCK或HepG2细胞，以使转染效率正常化。转染24 h后，用被动裂解缓冲液（Promega）对细胞进行裂解，并分别使用荧光素酶分析系统（Promeca）和发光β-半乳糖苷酶检测试剂盒II（Clontech Laboratories，Inc.）测量荧光素素酶和β-半乳糖苷酶活性。

免疫细胞化学和显微镜

在盖玻片上生长的细胞在室温下用4%多聚甲醛在PBS中固定30分钟，然后用0.1%Triton X-100在PBS内渗透。固定细胞与一级抗体孵育，然后与适当的Alexa 488结合二级抗体（Invitrogen）孵育。为了观察肌动蛋白丝或细胞核，在二级抗体溶液中添加Alexa 568-结合的卵磷脂（Invitrogen）或Hoechst 33342（Invitorgen）。将染色细胞安装在GEL/MOUNT安装介质（Biomeda）中，并在室温下使用显微镜（IX70；Olympus）和60×/12.5透镜（UPlanFLN；油虹膜；Olymbus）进行观察。使用MetaMorph软件（MDS Analytical Technologies）使用相机（CoolSNAP HQ CCD；Photometrics）采集荧光图像，并使用Photoshop CS软件（Adobe）进行处理。

逆转录聚合酶链反应

使用TRIzol试剂（Invitrogen）从细胞中提取总RNA，并使用PrimeScript逆转录酶（Takara Bio Inc.）逆转录。使用以下PCR引物扩增cDNA：段塞，5′-atgccgctctcttcctgg-3′/5′-gtgtgagtctcatgtccttgaag-3′；蜗牛，5′-accttccagcctacgacgac-3′/5′-gcagcggtggctgtgcggatg-3′；扭曲，5′-ctcggayaagcgagagat-3′/5′-ctagtgggacgcggacatgga-3′；和间隙，5′-tctcaccataggagagg-3′/5′-gaaggcatagggag-3′。

协同免疫沉淀

用裂解缓冲液（1 mM EDTA、0.1%Triton X-100、50 mM NaF、1 mM Na）裂解细胞_三VO（旁白）₄1 mMβ-甘油磷酸和蛋白酶抑制剂鸡尾酒片[Roche]，PBS，pH 7.4，[Nakarai Tesque Inc.]），并在冰上培养15分钟。经过短暂的超声处理后，将裂解物在10000℃下旋转克30分钟以清除细胞碎片。将产生的上清液与所示抗体孵育过夜（16-24小时）。在此培养后，将蛋白质G–Sepharose（GE Healthcare）添加到混合物中，然后轻轻搅拌，再培养4小时。为了洗脱免疫复合物，将Sepharose珠用裂解缓冲液洗涤四次，然后添加SDS样品缓冲液。为了检测MRTFs和Smad3之间的相互作用，使用TNT快速偶联转录/转移系统（Promega）在体外合成MRTF-A和-B、Smad3及其相应缺失结构的产物。将合成的蛋白质以各种组合混合在裂解缓冲液中，并通过共免疫沉淀评估其相互作用。

RNA干扰

使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）将siRNA转染细胞，并在分析前培养2天。siRNA序列如下：旋木雀MRTF-A siRNA1，5′-caggtgaattatccgaaagata-3′；旋木雀MRTF-A siRNA2，5′-ctgtggcatatcaagaacaa-3′；旋木雀MRTF-B siRNA1，5′-ccccaagatactaatagaaa-3′；旋木雀MRTF-B siRNA2，5′-accaatgaaatttccata-3′；人MRTF-A siRNA1，5′-gacacctcggaattgcacttt-3′；人MRTF-A siRNA2，5′-cccgagtcaccactgc-3′；人MRTF-B siRNA1，5′-ggacgagaacaactagtg-3′；人MRTF-B siRNA2，5′-gtatgctggaccatcact-3′；人Smad3 siRNA1，5′-atcaagggattcctatggaa-3′；和人类Smad3 siRNA2，5′-aagagattcgataccgataa-3′。在对照实验中，使用了加扰siRNA（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。

DNA-蛋白质结合分析

体外–用500μl DNA亲和沉淀缓冲液（20 mM Hepes-KOH，pH 7.9，80 mM KCl，1 mM MgCl2，0.2 mM EDTA，0.5 mM DTT，10%wt/vol甘油和0.1%Triton X-100）稀释合成的FLAG–MRTF-A和/或HA-Smad3蛋白并与1μg生物素化双链DNA探针和15μg鲱鱼精子DNA在4°C下孵育1.5小时。在竞争实验中，还添加了50μg非生物素化DNA探针或非生物素突变DNA探针。然后将Dynabeads M-280链霉亲和素（Invitrogen）添加到DNA-蛋白质混合物中，并在室温下通过旋转轻轻混合样品1.5小时。用DNA亲和沉淀缓冲液洗涤珠子，用SDS样品缓冲液洗脱结合蛋白。DNA探针序列如下：家族鼻涕虫启动子，5′-gttcgcggccgtcccggggggggctgaaa-3′；突变核心区家族鼻涕虫启动子，5′-gttcgcgaagtccgggggggggctgaaa-3′；人类类GCCG基序段塞启动子，5′-tcagaggcgcgcgcgcgt-3′；人类突变的GCCG-like基序段塞启动子，5′-tcagaggcaaaggcccgtcctct-3′；人体SBE段塞启动子，5′-aatattctctctataaagacccatacaa-3′；和人类变异的SBE段塞启动子，5′-aaaatattatactaaaaaccatacaa-3′。

ChIP分析

MDCK或HK-2细胞在含有2%马血清（含或不含TGF-β1）的DME中培养24小时，用于使用ChIP检测试剂盒（Millipore）、抗MRTF-a和-B抗体以及抗Smad1、2和3抗体进行的ChIP检测。用于PCR扩增的引物序列如下：家族鼻涕虫核心区，5′-ctgtccgcgcagcgg-3′和5′-ctctgcgcgactgagcg-3′；人类段塞类GCCG基序，5′-ctctcagctgattggatc-3′和5′-acggcggtcctacagcatc-3′；和人类SBE，5′-gaaactggtagactgagattgg-3′和5′-Gaacaccggacatctctc-3′。

这项工作得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部（K.Sobue）科学研究拨款（15GS0312）的支持。