转录辅活化因子Cited2通过以下途径诱导Bmi1和Mel18并控制成纤维细胞增殖墨水4a/农业研究基金

成纤维细胞分离、传代、生长曲线和集落形成分析。

如前所述，小鼠胚胎成纤维细胞是在分娩后13.5或15.5天从同窝胚胎中制备的(36). 第二天采集粘附的成纤维细胞并以1.5×10的密度进行电镀⁴每厘米细胞数²（第0代），此后每3天以相同密度传代一次。每次传代的种群加倍计算为log（n_如果/n个_哦)/log2，其中n_哦是首字母和n_如果每个通道的最终细胞数(13). 当n_哦大于n_f、，将种群倍增定义为0。每一代的累积种群倍增（CPD）是通过增加每一代种群倍增来计算的(13). 如前所述检测到衰老相关β-半乳糖苷酶(17). 对于生长曲线，在所示的时间点电镀并采集12孔板每孔的所示细胞数，并用结晶紫测量相对细胞数，如前所述(46). 将所示培养物的值标准化至第1天，并一式四份测定每个点。对于集落形成，将成纤维细胞按所示密度镀膜，并用Giemsa染色观察集落，如前所述(13).

生长分数。

细胞以1.5×10的密度进行电镀⁴/厘米²在指定通道的玻璃盖玻片上，48 h后，添加10μM溴脱氧尿苷（BrdU）24 h。盖玻片固定，在HCl中孵育，然后用抗BrdU单克隆抗体（Becton-Dickinson）染色，然后用次级羊抗鼠异硫氰酸荧光素结合抗体染色。细胞用碘化丙啶（PI）染色并安装在含有PI（载体）的Vectashield中。在激光扫描细胞仪（CompuCyte，Cambridge，Mass.）上定量BrdU和PI的核摄取，并根据制造商的说明使用WinCyte软件进行分析。每个单独的实验都获得了3000到5000个细胞的结果数据。生长分数计算为培养物中BrdU阳性细胞的百分比。

逆转录病毒。

通过使用双顺反子pLZRS-IRES-GFP质粒和Phoenix产生细胞（加利福尼亚州斯坦福市Garry Nolan赠送）生成CITED2、CITED2-Δ、Mel18、Bmi1和对照逆转录病毒上清液。成纤维细胞如前所述受到感染(25). 这个Bmi1公司逆转录病毒已在前面描述过(25). 这个梅尔18逆转录病毒由pSG5-Mel18产生，其中包含一个小鼠Mel18 cDNA插入物（来自日本广岛菅野M.Kanno），该插入物具有修改的翻译起始位点（GCCACCATGG），可将第二个氨基酸从H变为D。我们使用PCR将Mel18翻译起始位点转换回野生型（GGCATGC）（GenBank登录号：。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“D90085”，“term_id”：“220476”，“term_text”：“D 90085”}}D90085号)并将生态RI公司-存储区域网络DI片段（包含打开的读取帧）进入pLZRS-IRES-GFP。感染效率通常超过80%。使用标准分子克隆技术生成质粒载体(7).

吸液。

如前所述进行Northern印迹(7)通过使用6至10μg总RNA（RNeasy Mini试剂盒，QIAGEN）转移到Hybond N+膜（Amersham）。用0.05%亚甲基蓝染色观察28S和18S rRNA物种。小鼠p19^{农业研究基金}，第19页^墨水4d和第15页^墨水4bcDNA质粒是Charles Sherr（美国田纳西州孟菲斯市HHMI）和Gordon Peters（英国伦敦癌症研究所）赠送的礼物。第16页^墨水4a-和第19页^{农业研究基金}-特定探针(墨水4a/ARF1α和墨水4a/ARF1β)通过外显子特异性引物PCR从各自的cDNA模板中生成。使用相应的小鼠探针，从早期传代的不连续小鼠胚胎成纤维细胞进行Mel18、Bmi1和Mph1的Northern印迹。Mph1探针（IMAGE:3512187）来自英国剑桥MRC-HGMP。使用NIH Image软件在扫描的放射自显影图上测量相对信号强度。用抗Bmi1单克隆抗体（229F6；Upstate Biotechnology，Lake Placid，N.Y.）进行蛋白质印迹，p16^墨水4a（M156；圣克鲁斯）和反p19^{农业研究基金}（Ab80；Abcam，Cambridge，United Kingdom）多克隆抗体和抗管蛋白抗体（T-5293；Sigma）根据制造商的说明进行。

增长率下降。

确定细胞增殖受损的机制引用2^−/−成纤维细胞，活跃增殖细胞的一部分(11)通过用BrdU标记平行培养物24小时来测量。BrdU摄取和PI染色的双变量分析表明引用2^+/+和引用2^−/−成纤维细胞在最初培养时接近100%（图。2A和B). 通过连续传代引用2^−/−成纤维细胞的下降速度比引用2^+/+成纤维细胞。增长率下降引用2^−/−文化早在第一段就很明显了。所有培养物最初主要是二倍体，由PI染色确定（图。​（图2A）。2安培). 随着连续传代，培养物变成四倍体（图。​（图2A，2安培、中间和下部面板）。尽管图的顶部显示了野生型文化。​图2A2安培这一代仍以二倍体为主，下一代则以四倍体为主（数据未显示）。

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图2。

的增长分数引用2^−/−小鼠胚胎成纤维细胞。（A） 核DNA合成（BrdU）与DNA含量（PI）的散点图引用2^+/+（w） 和引用2^−/−（n） 第0代和第4代成纤维细胞培养。BrdU标记的细胞显示为绿色。未标记的细胞用蓝色（2n）、红色（4n）或黑色（8n DNA含量）表示。（B） 的增长分数引用2^−/−和引用2^+/+成纤维细胞培养物相对于传代数作图。

引用2^−/−成纤维细胞增加了墨水4a/农业研究基金.

上述结果表明：引用2^−/−成纤维细胞在培养时过早停止增殖，不会自发永生，并表现出细胞衰老的形态学特征。小鼠胚胎成纤维细胞的衰老与选择性剪接产物水平的增加有关墨水4a/农业研究基金基因座，p16^墨水4a和第19页^{农业研究基金}（图。​（图3A）3A级)（在参考文献中审查48和49). INK4家族成员抑制细胞周期素依赖性激酶4和6，而p19^{农业研究基金}抑制p53抑制剂MDM2的功能。我们检查了墨水4a/农业研究基金早期通过引用2^+/+和引用2^−/−成纤维细胞（图。3B至F). 用p19探针检测Northern印迹^{农业研究基金}cDNA，检测两个p16^墨水4a和第19页^{农业研究基金}（图。3A和B)作为通信产品。这个探针显示墨水4a/农业研究基金表达明显增加（2.7倍）引用2^−/−成纤维细胞（图。​（图3B）。3B公司). 区分交替拼接p16的特定探针^墨水4a和第19页^{农业研究基金}转录物显示，这两种转录物的表达在缺乏引用2（图。3C和D). p15的表达^墨水4b，INK4家族成员(21)（图。​（图3E），第三方)，年也增加了（2.5倍）引用2^−/−成纤维细胞（图。​（图3A）。3A级). 我们观察到p19的表达没有变化^墨水4d，另一个INK4家族成员(23)（图。​（图3F）。第三层). 与这些观察结果一致，p16的水平^墨水4a和第19页^{农业研究基金}蛋白质也增加了（分别是2.5倍和2.7倍）引用2^−/−第1代成纤维细胞（图。3G和H).

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图3。

墨水4a/农业研究基金中的表达式引用2^−/−成纤维细胞。（A） 代表墨水4a/农业研究基金和墨水4b显示外显子结构和产生三种不同细胞周期抑制剂p15的选择性剪接（虚线）的位点^墨水4b，第16页^墨水4a和第19页^{农业研究基金}.（B到F）从独立的成对RNA中获得的总RNA的Northern blot引用2^+/+（w） 和引用2^−/−（n） 来自同窝胚胎的成纤维细胞。通道编号（P）显示在每个面板中。（B） 全长p19^{农业研究基金}cDNA作为探针。此探针检测两个p19^{农业研究基金}和第16页^墨水4a亚型，这是一个组合。（C） 第16页^墨水4a用特异性外显子1α探针检测。（D） 第19页^{农业研究基金}用特异性外显子1β探针检测。（E和F）第15页^墨水4b和p19^墨水4d用全长cDNA探针检测转录物。每块面板的底部显示28S和18S RNA物种，证实负载量相等。（G和H）来自引用2^+/+和引用2^−/−用抗p16抗体检测第1代成纤维细胞^墨水4a和抗p19^{农业研究基金}抗体（顶部面板）和抗微管蛋白单克隆抗体（底部面板）显示相等的负载。

与CITED2互补可促进增殖。

确定这些变化是否是特定于引用2，我们感染了引用2^−/−由逆转录病毒长末端重复序列驱动的双顺反子逆转录病毒表达人CITED2（与小鼠CITED2保守94%）和GFP（绿色荧光蛋白）的成纤维细胞（图。​（图4A）。4A级). 这些成纤维细胞的增殖明显增强，并在研究期间（即超过30天）保持其纺锤形（数据未显示）。相比之下，与表达GFP的对照逆转录病毒（LZRS）或表达CITED2Δ的逆转录病毒平行感染，CITED2-Δ是一种缺乏重叠CBP/p300和TFAP2结合域的突变(9,12)，没有增强扩散。这些结果在使用独立分离的引用2^−/−成纤维细胞。感染引用2^−/−表达CITED2逆转录病毒的成纤维细胞也导致墨水4a/农业研究基金和墨水4b表达式（分别为1.5倍和1.6倍）（图。4B和C)与控制逆转录病毒相比。

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图4。

的补充引用2^−/−CITED2的成纤维细胞。（A）引用2^−/−成纤维细胞（来源于13.5dpc的胚胎）感染CITED2、CITED2Δ（缺乏残基215至270）或LZRS（对照）逆转录病毒。感染的成纤维细胞在第7天（第0代）被移植，每3天传代一次。逆转录病毒补充的累积增长引用2^−/−成纤维细胞显示为CPD与传代数的关系图。通过使用独立分离的成纤维细胞，在另外两个独立实验中重现了结果。（B和C）逆转录病毒补体总RNA的Northern blot引用2^−/−成纤维细胞。LZ表示感染LZRS（对照）逆转录病毒，C2表示感染表达CITED2的逆转录病毒。检测到的抄本显示在每个面板中。每个图中的底部面板显示28S和18S RNA物种，证实了负载量相等。（B） 全长p19^{农业研究基金}cDNA作为探针。此探针检测两个p19^{农业研究基金}和第16页^墨水4a亚型，这是一个组合。（C） A第15页^墨水4b用全长cDNA探针检测转录物。

一个完整的墨水4a/农业研究基金基因对抑制细胞增殖至关重要引用2^−/−成纤维细胞。

上述结果表明引用2抑制成纤维细胞增殖墨水4a/农业研究基金和/或墨水4b.明确确立墨水4a/农业研究基金在调解过早阻止引用2^−/−成纤维细胞，我们生成的成纤维细胞缺乏这两者引用2和墨水4a/农业研究基金(引用2^−/−:墨水4a/农业研究基金 ^−/−)并将其扩散与引用2^−/−:墨水4a/农业研究基金^+/+,引用2^+/+:墨水4a/农业研究基金^−/−和野生型成纤维细胞（图。5A和B). 与之前的观察结果一致(45)，缺乏成纤维细胞墨水4a/农业研究基金在连续传代培养过程中，增殖速度快于野生型成纤维细胞，在实验期间（48天）增殖速度没有减慢。与图中的观察结果一致。​图1，1,引用2^−/−成纤维细胞过早且永久性地停滞。成纤维细胞缺乏两者引用2和墨水4a/农业研究基金几乎与缺乏墨水4a/农业研究基金没有减缓扩散。这些结果在缺乏两者的独立分离的成纤维细胞中得到了进一步证实引用2和墨水4a/农业研究基金（未显示数据）。然后，我们通过在第4代将这些成纤维细胞镀上，并在接下来的10天内检测细胞的生长情况（图。​（图5C）。5摄氏度). 根据上述观察结果，引用2^−/−成纤维细胞的增殖能力显著降低墨水4a/农业研究基金^−/−成纤维细胞增殖速度快于野生型成纤维细胞。成纤维细胞缺乏两者引用2和墨水4a/农业研究基金像那些缺乏墨水4a/农业研究基金我们还检测了这些成纤维细胞在低密度镀膜时形成集落的能力，这是对原代细胞增殖潜能的独立测量(13). 在本试验中，野生型和引用2^−/−成纤维细胞形成的小菌落效率很低（图。​（图5D）。第五天).墨水4a/农业研究基金^−/−成纤维细胞有效地形成大的集落。成纤维细胞缺乏两者引用2和墨水4a/农业研究基金形成的殖民地几乎与缺乏的殖民地一样墨水4a/农业研究基金这些结果表明墨水4a/农业研究基金功能对于观察到的增殖能力降低和过早增殖停滞至关重要引用2^−/−成纤维细胞。

消除墨水4a/农业研究基金不能挽救胚胎畸形引用2^−/−老鼠。

确定是否墨水4a/农业研究基金在小鼠胚胎畸形的发生中起作用引用2，我们检查了缺乏这两种物质的胚胎引用2和墨水4a/ARF公司。就像只缺少胚胎引用2(9)，两者缺一不可引用2和墨水4a/农业研究基金心脏畸形（图。​（图6B），6亿)，肾上腺发育不全（图。​（图6D），第6天)和无脑（图。​（图6F）。第6页). 在这些实验中，在缺乏胚胎的8个胚胎中，有4个胚胎出现了无脑畸形引用213个胚胎中有6个同时缺乏这两种基因引用2和墨水4a/农业研究基金.控制野生型胚胎引用2但缺少墨水4a/农业研究基金心脏、肾上腺和神经发育正常（图。6A、C和E). 这些结果表明引用2控制与胚胎发育相关的其他途径。

缺少细胞引用2减少了Bmi1和Mel18的表达。

上述数据表明引用2通过抑制细胞增殖墨水4a/农业研究基金遗传证据表明，在原代小鼠成纤维细胞中，多梳组基因Bmi1公司抑制p16^墨水4a和第19页^{农业研究基金}还有那个梅尔18（a）Bmi1公司paralog）抑制p16^墨水4a(25). 因此，我们检测了这些基因在早期传代中的表达引用2^+/+和引用2^−/−来自同窝胚胎的成纤维细胞。我们发现Mel18和Bmi1的表达在引用2^−/−成纤维细胞（图。7A和B). 在表达Mph1型，另一个多梳组基因。我们还检查了成纤维细胞待定2，另一个墨水4a/农业研究基金阻遏物(24)，但在野生型或引用2^−/−成纤维细胞（数据未显示）。感染引用2^−/−表达CITED2逆转录病毒的成纤维细胞导致Mel18（1.5倍）和Bmi1（1.4倍）的表达适度增加（图。7C和D).

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图7。

的表达式梅尔18和Bmi1公司成纤维细胞缺乏引用2.（A）从引用2^+/+（w） 和引用2^−/−（n） 来自同窝胚胎的成纤维细胞。顶部面板显示Mel18、Bmi1或Mph1的探测斑点，如图所示。发现两种Mel18亚型(52). 底部面板显示28S和18S RNA物种，以显示相等的负载。（B） 总细胞裂解物的Western blot用抗Bmi1单克隆抗体（顶部）进行探测，并用抗微管蛋白单克隆抗体进行复制（底部）以显示相等的负载。（C） 获得的总RNA的Northern印迹引用2^−/−成纤维细胞同时感染逆转录病毒。LZ表示感染LZRS（对照）逆转录病毒，C2表示感染表达CITED2的逆转录病毒。顶部面板显示了一个用Mel18 cDNA探测的斑点。底部面板显示28S和18S RNA物种，显示负载相等。（D） 来自引用2^−/−成纤维细胞。LZ表示感染LZRS（对照）逆转录病毒，C2表示感染表达CITED2的逆转录病毒。该实验采用独立隔离的方法进行两次引用2^−/−成纤维细胞系（1号和2号）。顶部面板显示用抗Bmi1抗体探测的斑点。底部面板显示了一个用抗管蛋白抗体探测的斑点，以显示相等的负荷。

我们感谢罗纳德·德皮尼奥慷慨捐赠墨水4a/农业研究基金突变小鼠，Charles Sherr和Gordon Peters提供探针礼物，Garry Nolan提供LZRS质粒和Phoenix细胞，Derek Davies（英国癌症研究所）提供细胞术帮助。

K.R.K.是威尔科姆奖学生，也是林肯学院的基思·默里高级学者。这些研究由Wellcome Trust向S.B.颁发的高级奖学金资助。