与神经退行性疾病相关的蛋白质聚集体的自噬清除需要功能性多泡体

p62阳性结构积聚在缺乏Tsg101和Vps24的细胞中

为了进一步研究在ESCRT缺失细胞中发现的大的泛素阳性EEA1-负结构的性质，我们使用抗Tsg101和Vps24的siRNA处理的细胞进行进一步研究。我们首先询问p62和Alfy蛋白是否与细胞质泛素阳性结构相关(Simonsen等人，2004年;Bjorkoy等人，2005年)，在Tsg101或Vps24耗尽的细胞中积累。如图所示图2，均为第62页(图2 A)和Alfy(图2 B)发现与ESCRT缺失细胞中积累的泛素阳性结构有关。通过ImageJ软件对300多个细胞进行定量分析，Tsg101和Vps24缺失细胞中p62阳性结构的数量和大小均显著增加。p62阳性颗粒根据其大小进行分组，每100个细胞的数量显示在图2C对照细胞平均每100个细胞有355p62阳性结构，只有29个细胞的面积大于2μm²相反，缺乏Tsg101或Vps24的细胞平均有1251和1605个p62阳性结构，其中263和332个在2μm以上²分别是。因此，ESCRT亚单位的缺失导致泛素、p62和Alfy阳性聚集物或内含物的数量和大小增加。

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图2。

p62和Alfy阳性结构在Tsg101或Vps24缺失的细胞中积聚。将转染抗Tsg101或Vps24 siRNA的HeLa细胞固定、渗透，并用泛素（红色）和p62（绿色）（A）抗体或泛素（绿色）和Alfy（红色）（B）抗体染色。变色用黄色表示。棒材，10μm。（C） 使用ImageJ软件定量p62阳性颗粒的数量和大小（面积）。来自三个不同实验的大约100个细胞(n个=334（对照组）、309（Tsg101）和246（Vps24））用于量化，数据表示为每100个细胞的平均数。误差线=SEM。

Tsg101和Vps24缺失细胞的自噬降解受到阻碍

如Tsg101和Vps24缺失细胞中所示，泛素阳性聚集物的形成可能是由蛋白质合成增加或蛋白质降解减少引起的。泛素-蛋白酶体系统是消除多泛素损伤或错误折叠蛋白质的主要手段，但最近也发现，自噬的丧失会导致泛素阳性内含物的积累，并导致小鼠模型的神经退化(Hara等人，2006年;小松等人，2006年). 因此，我们询问蛋白质合成、蛋白酶体活性或自噬降解是否受到ESCRT亚基敲除的影响。蛋白质合成的总水平，通过掺入[^三H] -亮氨酸，在ESCRT缺失的细胞中没有明显变化（图S2 A，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200702115/DC1). 通过定量实时PCR（qRT-PCR）测量，ESCRT缺失细胞中p62和LC3-B的相对mRNA水平均未显著增加（图S2 B）。在对照细胞和ESCRT缺失细胞中不存在或存在蛋白酶体抑制剂PSI的情况下分析蛋白酶体活性，有趣的是，ESCRT缺失的细胞中蛋白酶体活性增加而不是减少（图S2 C）。这可能是由于蛋白水解串扰，由ESCRT击倒细胞中自噬降解的抑制所诱导，如下一节所述。

LC3/Atg8是一种广泛使用的自噬标记物，因为它与自噬膜特异结合，并在整个途径中保持结合(Kabeya等人，2000年;水岛等人，2001年). p62，已知与LC3相互作用并通过自噬降解(Bjorkoy等人，2005年;Pankiv等人，2007年)，是另一种常用的自噬标记。稳定表达LC3的HeLa细胞与GFP融合(Bampton等人，2005年)用对照、Tsg101或Vps24 siRNA转染，通过共焦显微镜分析GFP-LC3和p62的水平。尽管p62和GFP-LC3在对照细胞的小细胞质结构上共定位(图3 A，插图），这两种蛋白质在缺乏Tsg101或Vps24的细胞中大量积累(图3、B和C，插图）。根据三个独立实验的定量结果，在Tsg101和Vps24缺失的细胞中，p62和GFP-LC3的总体水平及其共定位程度均增加(图3 D). 在ESCRT缺失的HeLa细胞裂解物的免疫印迹上也可以看到p62的积聚(图3E)、HepII和U2OS细胞（未公布数据）。使用差异洗涤剂提取，一种常用于定量测量蛋白质包合物形成的技术(Scherzinger等人，1997年;Wanker等人，1999年)在ESCRT缺失细胞中，我们观察到p62从不太严格的提取缓冲液（1%Triton-X-100，可溶）转变为2%SDS（不可溶），代表着向更聚集的构象转变(图3E). 在缺乏Atg5的细胞中也可以看到p62的积累（图S3，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200702115/DC1)虽然Atg5和ESCRT缺失细胞中p62积累的机制明显不同，但这些数据进一步证明，当自噬转换受到抑制时，会形成p62阳性聚集物。

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图3。

Tsg101和Vps24缺失细胞的自噬降解受到阻碍。用对照（A）、Vps24（B）或Tsg101（C）siRNA转染稳定表达GFP-LC3（绿色）的HeLa细胞5天，并进行免疫荧光分析。用抗p62（红色）抗体标记细胞，并通过共焦显微镜进行分析。变色用黄色表示。棒材，10μm。（D） 使用Zeiss LSM 510 Meta软件对p62和GFP-LC3的总水平（归一化为对照细胞）及其在对照细胞和Tsg101和Vps24缺失细胞中的共定位程度（占总数的%）进行量化。来自三个独立实验的30个细胞用于定量。误差条=SEM。（E）Western blot显示Vps24和Tsg101缺失的HeLa细胞中LC3-II和p62的积累。p62也聚集在不溶性部分中（下图），表明Vps24和Tsg101耗尽后向更聚集的形式转变。（F） Western blot显示对照组和经Bafilomycin A处理的Vps24缺失细胞中LC3-II水平相似。

由于GFP-LC3有可能与无膜聚集物结合(Kuma等人，2007年)可能是因为它与p62的复合形成(Bjorkoy等人，2005年;Pankiv等人，2007年)，分析细胞自噬水平的更好方法是分别测量18-kD细胞溶质和16-kD脂质自噬体结合形式LC3、LC3-I和LC3-II之间的比率(Kabeya等人，2000年,2004). 如图所示图3E在缺乏Tsg101或Vps24的细胞中检测到LC3-II水平升高。原则上，这可能是由自噬水平升高或降解减少引起的。然而，在用质子ATP酶抑制剂巴氟霉素A处理的对照和ESCRT耗竭的细胞中，内源性LC3-II水平相似，已知巴氟霉素A可抑制溶酶体降解(图3 F). 如果ESCRT敲除导致自噬水平增加，我们预计在ESCRT缺失的细胞中LC3-II水平将高于用Bafilomycin A处理的对照细胞。此外，与对照细胞相比，ESCRT缺失细胞中的LC3-B mRNA水平未受影响（图S2 B）也表明，尽管是间接的，LC3合成保持不变。

为了进一步研究ESCRT耗尽的细胞中自噬降解是否受到抑制，我们利用最近开发的双标记mCherry-GFP-LC3结构（dtLC3）(Pankiv等人，2007年)，在非酸性结构（自噬体和两质体）中被检测为黄色荧光（绿色与红色合并），由于这些酸性结构中GFP的猝灭，仅在自溶体中被检测为红色（见图4 A，卡通）。而对照细胞中50%的dtLC3信号为红色(图4、B和E)，在Tsg101-中仅检测到20%的红色(图4、C和E)和Vps24缺失细胞(图4、D和E). 这表明mCherry-GFP-LC3向酸性溶酶体的转运，即自溶体的形成，在ESCRT耗竭的细胞中受到抑制。Tsg101和Vps24的耗竭也抑制了饥饿诱导的HeLa细胞中长寿蛋白质的降解(图4 F). 与对照细胞相比，缺乏Tsg101和Vps24的细胞中饥饿诱导的降解水平分别降低了60%和43%。总的来说，我们的数据强烈表明了自噬中功能性MVB的一般要求。

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图4。

在缺乏Tsg101或Vps24的细胞中，自溶体的形成受到抑制。（A） 双标记LC3蛋白（mCherry-GFP-LC3）在非酸性结构中会发出黄色（绿色与红色融合）荧光，由于这些酸性结构中GFP的猝灭，仅在自溶体中显示为红色。（B–F）HeLa细胞转染对照（B）、Tsg101（C）或Vps24（D）siRNA 4 D，然后再转染mCherry-GFP-LC3 24 h，然后进行共聚焦显微镜分析。棒材，5μm。（E） 使用蔡司LSM 510 Meta软件在三个独立实验中对约30个具有类似表达水平的细胞中的mCherry-LC3（红色）信号进行量化，数据表示为mCherry-GFP-LC3总量的%。误差栏=SEM.（F）退化[¹⁴C] 在完全培养基（对照）、血清和氨基酸缺乏培养基（饥饿）或饥饿培养基中培养的细胞中的缬氨酸标记蛋白，在3-甲基腺嘌呤（3-MA）存在的情况下抑制自噬降解。显示了在重复±1 SEM中进行的四个实验的平均每小时降解率。

ESCRT缺失细胞中的自溶体形成受到抑制

我们的数据表明，由于有缺陷的自噬降解，泛素阳性、p62阳性聚集物在ESCRT缺失的细胞中积累，但这一途径在哪一步受到阻碍？虽然经典观点认为自噬体与溶酶体直接融合，但也发现自噬小体与内吞途径的早期部分发生融合(Tooze等人，1990年;Punonen等人，1993年;Liou等人，1997年;Berg等人，1998年)两性体一词用于描述含有自噬和内吞物质的自溶体前腔室(戈登和塞格伦，1988年). 由于ESCRT复合物是MVB正确形成所必需的，因此ESCRT亚单位的丢失可能会抑制自噬体与MVB的融合或两性体与溶酶体的融合。

为了解决这个问题，我们使用了免疫电子显微镜（EM）。为了利用自噬和内胚标记物进行双标记实验，我们使用稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞(Bampton等人，2005年). 冷冻切片与抗GFP的抗体和MVB/晚期内体标记物lyso一起孵育-第二类磷脂酸（LBPA）和两性体的存在可以根据LC3-LBPA共定位和形态学进行评分(图5). 在对照细胞中检测到GFP-LC3和LBPA阳性的两性体(图5 A)但在缺乏Tsg101的细胞中更常见（增加42%）(图5、B、D和F)和Vps24（增加29%）(图5、C和F). 此外，在Tsg101-depleted细胞中通常发现由自噬体和可能代表吞噬细胞的管状结构组成的双膜结构簇，所有这些结构都强烈标记GFP-LC3（见于～25%的细胞）(图5、B和E)但在Vps24缺失的细胞中没有如此显著，在对照细胞中从未见过。使用共焦免疫荧光（IF）显微镜也发现ESCRT缺失细胞中的两性体水平增加，表现为Alfy和LBPA之间的共定位（图S4，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200702115/DC1). 在一些细胞中，Alfy阳性结构似乎被LBPA阳性膜包围（图S4 D），这表明当MVB途径受阻时，蛋白质聚集体可能在两体中积累。然而，由于共焦显微镜的分辨率较低，我们无法区分融合（两性体）和对接的自噬体-内体小泡，因此EM分析是解决这个问题的更好方法。

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图5。

自噬体和两性体在ESCRT缺失细胞中形成。用对照（A）、Tsg101（B、D和E）或Vps24（C）siRNA转染稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞，并进行免疫电镜分析。用抗GFP（15-nm金）和LBPA（10-nm金）抗体进行冷冻培养。在对照组（A）和ESCRT缺失细胞（B和C）中均观察到以电子密度LC3阳性区域和腔内小泡含量为特征的Am。（D） 在Tsg101-depleted细胞中，我们发现大簇更典型的自噬体（Au）和（E）簇双膜结构，包括自噬小体和可能代表吞噬细胞的管状结构，所有这些都强烈标记GFP-LC3。我们从未在对照细胞中观察到类似的簇，在Vps24缺失的细胞中也很少观察到类似簇。棒材，200 nm。（F） 对照细胞和Tsg101或Vps24缺失细胞中两性体的定量。每次实验每消耗一个siRNA，大约有20个细胞被包括在内(n个= 3). 误差线=SEM。

为了确定是否在自噬囊泡中发现p62阳性结构，用对照、Tsg101或Vps24 siRNA处理的HeLa细胞冰冻切片与抗p62抗体孵育，然后用胶体金标记的二级抗体孵养。在对照细胞和缺乏Tsg101或Vps24的细胞中，在两性体中检测到p62阳性结构(图6、E和F). 此外，在Tsg101和Vps24缺失细胞的p62标记区域内，经常发现典型内胚体形态的小泡状-管状成分簇和较大的泡状物(图6，A和B). 在这些细胞中也经常发现无膜致密的p62阳性细胞溶质聚集物(图6、C和D；和表一)，但从未在控制单元中(表一).

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图6。

Vps24-和Tsg101-缺失细胞中p62阳性结构的免疫电镜。转染Vps24（A、C和E）或Tsg101（B、D和F）siRNA的HeLa细胞的冷冻切片与抗p62抗体（15-nm蛋白A-金，10-nm在D中）孵育。检测到无膜p62阳性聚集体（C和D）或泡状-管状元件（A和B）密集簇内的p62阳性结构。与这些簇相关的具有早期内体形态（EE）或多泡外观（MVB）的囊泡。我们还观察到，在缺乏Vps24（E）或Tsg101（F）的细胞中，分离在两性体内的电子致密结构中有p62标记。两性体通常由一个电子密度高的p62阳性体（E和F，箭头）和一个多泡内体结构（E和F，箭头）组成。棒材，200 nm。

总之，我们的EM和IF分析表明，自噬体和两性体在ESCRT缺失的细胞中积累，但也形成了内胚体和自噬小泡簇和无膜聚集物。

泛素和p62阳性聚集体在CHMP2B突变细胞中积累

ESCRT-III亚单位CHPM2B的突变最近与FTD有关(Skibinski等人，2005年)和ALS(帕金森等人，2006年). 对一个患有常染色体显性FTD的丹麦家系CHMP2B进行测序，发现受影响个体CHMP2B第6外显子的受体剪接位点发生了G-C转换，产生了两个异常转录物。一个转录本包含外显子5和6之间的201-bp内含子序列（CHMP2B^简介5)导致提前终止密码子，从而导致36-氨基酸C末端截断。另一个基因由于使用了一个位于外显子6（CHMP2B）5′端10 bp处的隐性剪接位点而缺失10 bp^Δ10)导致CHMP2B的最后36个氨基酸被一个异常的29-氨基酸C末端取代(Skibinski等人，2005年).

该家族患者的大脑含有泛素和p62阳性内含物(Holm等人，2007年)因此，可以解释这些患者神经退行性表型的一个假设是CHMP2B突变导致自噬降解受到抑制。为了研究这一假设，将myc标记的野生型或突变型CHMP2B转染HeLa细胞，用myc、泛素和p62抗体染色，并用共焦显微镜进行分析。如图所示图7 A未转染细胞和表达野生型CHMP2B的细胞在小细胞质结构上泛素和p62染色较弱。相反，在表达CHMP2B的细胞中，泛素和p62的水平显著增加（20–40倍）^简介5(图7、B和D)和CHMP2B^Δ10(图7，C和D). 表达CHMP2B的细胞的免疫印迹也检测到p62水平升高^简介5与模拟转染细胞或转染野生型CHMP2B的细胞相比(图7 E). 尽管转染效率低于30%，但CHMP2B的总表达水平^重量和CHMP2B^简介5是平等的(图7 E). 还发现p62在CHMP2B的Triton-X-100不溶部分积聚^简介5-表达细胞，如通过差异洗涤剂提取测定的（未发表的数据）。与ESCRT缺失细胞一样，在表达CHMP2B突变体的HeLa GFP-LC3细胞中，GFP-LC2水平增加（图S5、B和C，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200702115/DC1)与未转染细胞和表达野生型CHMP2B的细胞进行比较（图S5 A）。

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图7。

泛素和p62阳性结构积聚在表达CHMP2突变体的细胞中。转染myc标记的野生型CHMP2B（A）、CHMP2B的HeLa细胞^简介5（B） 或CHMP2B^Δ10（C） 用抗C-Myc（红色）、泛素（绿色）和p62（蓝色）抗体标记，并通过共焦显微镜进行分析。显示黑白单通道图像。棒材，10μm。（D） 使用蔡司LSM 510 Meta软件对来自三个独立实验的20个细胞中的p62总水平进行量化，并将平均值归一化为对照（模拟转染）细胞中的平均p62水平。误差棒=SEM。（E）Western blot分析显示转染myc-CHMP2B的细胞中p62的积累^简介5与模拟转染细胞（对照）和转染CHMP2B的细胞进行比较^重量（F）免疫电镜显示，在转染myc-CHMP2B的细胞中，p62阳性聚集物包含密集的囊泡-管状结构簇^简介5.巴，200纳米。

然后，我们使用免疫电镜进一步表征表达CHMP2B突变体的细胞中形成的p62阳性结构的形态。在缺乏Tsg101和Vps24的细胞中，发现p62阳性自噬体、两性体、小泡状-管状元件簇和无膜致密的p62阳性细胞溶质聚集体(图6). 在表达CHMP2B的细胞中检测到类似的p62阳性结构^简介5突变体和p62阳性的小泡状-管状元件簇可以在图7 F总之，我们的结果表明CHMP2B突变体的表达抑制自噬降解，导致泛素、p62和GFP-LC3的积累。

TDP-43在ESCRT缺失细胞的细胞质内含物中积聚

FTLD-U和ALS的特征是p62-和泛素阳性、τ-和α-突触核蛋白阴性的神经元胞质内含物异常积聚，TDP-43最近被确定为这些疾病的主要泛素化蛋白(Arai等人，2006年;Neumann等人，2006年). 因此，我们询问TDP-43是否在缺乏Tsg101或Vps24的HeLa细胞中积聚在细胞质聚集体中。在对照细胞中，TDP-43主要在细胞核中检测到，在少数细胞中也在p62阳性的小细胞质结构中检测到(图8 A). 相反，在Tsg101缺失的细胞中(图8 B)或Vps24(图8 C)，TDP-43积聚在p62和泛素染色阳性的聚集物中。因此，我们的数据首次表明，TDP-43阳性内含物与MVB形成和自噬降解所需蛋白质的耗竭之间存在联系。

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图8。

TDP-43在Tsg101-和Vps24-缺失细胞的细胞质泛素阳性结构中积累。转染对照（A）、Tsg101（B）或Vps24（C）siRNA的HeLa细胞被固定、渗透，并用TDP-43（绿色）、泛素（红色）和p62（蓝色）抗体染色。显示了黑白两种颜色的单通道图像。合并后的图片中，所有蛋白质的颜色均为白色。棒材，10μm。

我们没有在表达CHMP2B的细胞中发现的细胞质泛素、p62阳性结构中检测到TDP-43^简介5和CHMP2B^Δ10（图S5、E和F）。这与最近的数据一致，即CHMP2B突变的丹麦家族患者的泛素阳性内含物为TDP-43阴性(Holm等人，2007年). 这与其他FTLD-U病例形成对比，并可能表明多功能血透可能在TDP-43中发生两种不同的影响——阳性和阴性FTLD-U。

抗体

兔抗Hrs抗体(Raiborg等人，2001年)，电压24(巴赫等人，2006年)和阿尔菲(Simonsen等人，2004年)之前已经描述过。将重组Vps22与麦芽糖结合蛋白（MBP）（Eurogenetec）融合后注射家兔，制备识别人Vps22的抗体。抗血清在Vps22-MBP亲和凝胶珠上亲和纯化（Bio-Rad Laboratories）。从GeneTex中获得了抗Tsg101的小鼠单克隆抗体。兔抗LC3抗体是由Tamotsu Yoshimori（日本大阪大阪大学）赠送的。人类抗早期内体抗原（EEA）1抗血清是Ban-Hock Toh（澳大利亚墨尔本莫纳什大学）赠送的。兔抗溶酶体相关膜蛋白（LAMP）2是Gillian Griffiths（英国牛津大学）赠送的礼物。小鼠单克隆抗溶血素-第二类磷脂酸（LBPA）由Jean Gruenberg（瑞士日内瓦大学）提供。豚鼠抗p62 C-末端抗体来自PROGEN Biotechtick GmbH。小鼠抗α-微管蛋白和抗结合单/多泛素（FK2）单克隆抗体分别来自Sigma-Aldrich和Affiniti Research Products。抗GFP抗体来自AbCam。兔抗TDP-43抗体来自ProteinTech Group。兔抗c-Myc抗体来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Cy2-、Cy3-和Cy5-标记的二级抗体来自Jackson ImmunoResearch Laboratories。

siRNA寡核苷酸和质粒的转染

使用了以下先前描述的siRNA寡核苷酸：小时(Bache等人，2003年)，Tgs101(Bishop等人，2002年)，电压24(巴赫等人，2006年)、和控制(Cabezas等人，2005年). Vps22被siRNA双链体耗尽：有义5′-CUGCAGAGCCAAGUAUA-3′和反义5′-UUACUUGGCCUCUGCAAG-3′（MWG Biotech）。结果通过使用ON-TARGETplus SMARTpool siRNA（Dharmacon）对抗人类Hrs、Tsg101和Vps22得到证实。还使用了抗人类Atg5和小鼠Vps24的ON-TARGETplus SMARTpool siRNA。如前所述，用siRNA寡核苷酸转染HeLa细胞(巴赫等人，2003年). 简而言之，使用寡病毒胺（Invitrogen）将40–100 nM siRNA转染细胞3天；在实验开始前，细胞被重新放置并再放置2d。通过在SDS-PAGE上运行等量的细胞裂解液，然后使用Hrs、Tsg101、Vps22或Vps24抗体进行Western blotting，证明了特异性蛋白敲除。

siRNA转染4d后，用mCherry-GFP-LC3转染HeLa细胞，再培养24h，然后用共焦显微镜进行分析。编码myc标记的野生型CHMP2B、CHMP2BcDNA转染HeLa细胞^简介5或CHMP2B^Δ10根据制造商的说明，在pLNCX2（CLONTECH Laboratories，Inc.）或mCherry-GFP-LC3中使用FuGene6（Roche）。

差异洗涤剂提取和Western blot分析

为了分析不同蛋白质的细胞水平及其溶解度，首先在冰镇裂解缓冲液（50 mM NaCl、10 mM Tris、5 mM EDTA、0.1%SDS和1%Triton X-100+蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒）中提取细胞，离心（14000 rpm）10 min，并收集上清液（可溶性部分）。剩余的蛋白质颗粒在用含有2%SDS的样品缓冲液（不溶性部分）萃取之前用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。测定可溶组分中的蛋白质浓度，并在15%或4-20%梯度凝胶（Pierce Chemical Co.）上加载每个样品约20μg的蛋白质，然后用电印迹法将其溶解到Immobilon-P膜（Millipore）上。用标准ECL试剂检测特异性抗体来探测印迹。使用ChemiGenius成像系统（Syngene）提供的软件对获得的不同条带的强度进行量化，并使用微管蛋白作为负荷控制来量化相对量。添加200 nM Bafilomycin A 8 h，以抑制溶酶体降解。

共焦免疫荧光显微镜

将生长在盖玻片上的HeLa细胞（转染或未转染所示siRNA或质粒）固定在3%多聚甲醛中，用0.05%皂苷渗透，并按照前面所述进行荧光显微镜染色(Simonsen等人，1998年). 使用配备Neo-Fluar 100×/1.45油浸物镜的显微镜（LSM 510 META；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）检查盖玻片。使用蔡司LSM 510软件3.2版ImageJ（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院；网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/、1997–2007）和Adobe Photoshop 7.0。

电子显微镜

将转染或未转染所示siRNA或质粒的HeLa细胞在室温下固定在4%甲醛/0.2%戊二醛0.1 M磷酸盐缓冲液中40分钟，然后在12%明胶中以10000 rpm的速度清洗、刮取和造粒。样本被2.3 M蔗糖渗透，安装在银针上，并在液氮中冷冻。在−110°C下切割超薄冰冻切片（EM FCS超微切片机；徕卡），并用2%甲基纤维素和2.3M蔗糖的1:1混合物收集。将切片转移到formvar/碳涂层网格中，并用抗p62或GFP和LBPA的抗体标记，然后用基本上如所述的蛋白A缀合物标记(Slot等人，1991年). 分别使用配备SIS Megaview 3或Morada相机的Philips CM10和JEOL JEM-1230电子显微镜在60–80 kV电压下观察截面。通过对随机选择的细胞轮廓上的金颗粒进行计数，对标记进行量化。从三个不同的实验中，每组约200个细胞（对照组、Tsg101-和Vps24-siRNA）中计算p62阳性聚集体的数量。

氨基酸缺失对长寿命蛋白质降解的影响

用对照或抗Tsg101或hVps24的siRNA处理HeLa细胞，用0.25μCi/ml孵育24小时我-[¹⁴C] 缬氨酸-补充培养基。用PBS冲洗细胞三次，以去除未合并的放射性同位素，然后在含有10 mM冷缬氨酸的新鲜完整培养基中培养2小时，以降解短命蛋白质。在HBSS+10 mM Hepes中冲洗细胞，并用完整培养基或HBSS+10mM Hepes+10mM缬氨酸±10 mM 3-甲基腺嘌呤（3-MA）（Sigma-Aldrich）培养4h。然后刮取细胞，并使用TCA从培养基和细胞中沉淀蛋白质。蛋白质水解被评估为酸溶放射性除以沉淀物中保持的放射性。

促进剂停堆实验和过滤捕集试验

siRNA转染48 h后，HeLa Htt65Q-或103Q-mCFP细胞或N2a Htt103Q-mCFRP细胞再暴露于100 ng/ml dox下3 d，以停止新的Htt65Q/103Q-mCFP-蛋白的产生，并允许50%以上的清除率发生(山本等人，2006年). 根据已公布的方案，使用膜过滤法检测淀粉样聚谷氨酰胺蛋白聚集体，分析siRNA处理对聚Q聚集体清除的影响(Scherzinger等人，1997年;Wanker等人，1999年). 用抗GFP抗体检测65Q/103QmCFP。总蛋白质负荷标准化为可溶性部分的体积。或者，通过共焦免疫荧光显微镜分析Htt103QmCFP聚集体的清除率。通过对三个独立实验中每种条件下的300个细胞进行计数，对具有聚集物的细胞百分比进行量化。

蛋白质合成分析

细胞在缺乏亮氨酸的Hepes培养基中培养2小时。然后将细胞培养在含有2μCi ml的Hepes培养基中⁻¹[^三H] -亮氨酸在37°C下保持20分钟。用5%三氯乙酸（TCA）提取细胞10分钟，然后在5%TCA中清洗（5分钟），然后在0.1 M KOH中溶解。测量细胞相关放射性。

蛋白酶体分析

使用蛋白酶体-Glo细胞分析法（Promega）分析蛋白酶体活性，该方法根据制造商的说明测量与蛋白酶体复合体相关的糜蛋白酶样蛋白酶活性。在分析前5小时添加蛋白酶体抑制剂PSI（50μM）。

定量实时PCR（qRT-PCR）

从5×10提取总RNA⁵根据制造商的说明，使用Aurum Total RNA迷你试剂盒（Bio-Rad Laboratories）的HeLa细胞。通过光密度测量纯度和数量。使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad实验室），使用1μg总RNA进行cDNA合成。实时PCR是在平行的20μl反应中进行的，其中包含10μl 2×QuantiTect SYBR Green PCR主混合液（QIAGEN）、2μl 10×QuantiTect引物分析（QIAGE）和20 ng cDNA（2 ng用于肌动蛋白）。LightCycler480（Roche）的循环条件为95°C 15分钟，40个循环94°C 15秒，55°C 20秒，72°C 20 s。使用以下流行的QuantiTect引物分析：Hs_SQSTM1_1_SG、Hs_MAP1LC3B_1_SG，Hs_ACTB_1_SG、Hs_TBP_1_SG。实时效率根据标准稀释曲线的斜率计算。RNA转录水平通过直接比较C类 _T型值(C类 _T型>35拒绝）和按ΔΔ计算的相对数量C类 _T型等式或由2转换为线性形式^-ΔΔCt转录物被归一化为每种情况下肌动蛋白和TBP的数量。

我们非常感谢Aviva Tolkovsky赠送HeLa GFP-LC3细胞，并感谢Terje Johansen在出版前提供mCherry-GFP-LC2构建物。

这项工作得到了挪威研究委员会、挪威癌症协会和哈特曼家庭基金会的资助。